定Km值、Vmax、kcat和比活性，借助于標 準方法W色譜法方式通過儀-Sepharose柱選擇性地富集所述多膚。蛋白質(zhì)濃度的測定借助 于標準方法來進行，要么采用BCA方法(Pierce BCA Protein Assay KitP;rod#23225)，然而 優(yōu)選地采用用關(guān)于各自蛋白質(zhì)的比消光系數(shù)來實施的光度法，所述比消光系數(shù)用在 ht1:p: //web. e邱asy. org/protparam上在線可用的程序 "P;ro1:Param"來計算（Gasteiger E. 等人，Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server ,John M.Wa化er(編輯）= Hie Proteomics Protocols 化n化ook,Humana Press,2005,第571-607 頁)。
[0072] 實施例2:序列同一性W及保守氨基酸序列區(qū)段的確定
[0073] 在具有有著SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列的多膚的總多膚長度上的相互之間的 序列同一性百分比（表1)的確定可W借助于程序BLAST(Basic Local Alignment Search Tool),特別是用可W在"國家生物技術(shù)信息中屯、（化tional Center for Biotechnology Information)"的主頁（NCBI;http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/)上使用的BLASTP來進行。因 此，可能的是，根據(jù)Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. (1997)25:3389-3402)的算 法，將兩個或更多個序列互相進行比較。作為程序設置，考慮基本設置，但是特別地："最大 祀序狎' =100;"期望闊值' =10;"字長"=3;"矩降'=化0S0M62;"缺日成本'="存在：11; 延伸：r計算調(diào)整條件式組成得分矩陣調(diào)整"。
[0074] 為了確定保守氨基酸序列區(qū)段，借助于軟件COBALTQ.S. Papadopoulos和 R.Agarwala,2007,COBALT:constraint-based alignment tool for multiple protein sequences ,Bioinf o;rmatics23:1073-79)來調(diào)節(jié)對準相互之間具有至少70%的序列同一性 的具有SEQ ID No.1-6的多膚，其中考慮標準參數(shù)，特別是下列參數(shù)（"缺口罰分"：-11,-1; '味端缺口罰分"：-5,-1使用RPS BLAST化Se RPS BLAST)" :on; "Blast E-值' ：0.003;"發(fā) 現(xiàn)保守列和重新計算（Find Conserved columns and Recompute)" :on;"使用查詢聚簇 (use query clusters)" :on;。字長"：4;?？赡芫鄞鼐嚯x"（may cluster distance) :0.8; "字母表"：常規(guī)；"同源性保守設置化omology conversation setting) :3bits)。該分析的 結(jié)果描繪出了保守氨基酸。保守氨基酸序列區(qū)段被定義為具有至少5個連續(xù)的保守氨基酸 的下列區(qū)域：即關(guān)于具有SEQ ID No. 1的序列，位置+24至位置巧0的區(qū)段A、位置巧2至位置+ 77的區(qū)段B、位置巧9至位置+87的區(qū)段C、位置+89至位置+145的區(qū)段D、位置+150至位置+171 的區(qū)段E、位置+177至位置+193的區(qū)段F、位置+223至位置+228的區(qū)段G、位置+230至位置+ 237的區(qū)段H、位置+239至位置+247的區(qū)段I、位置+249至位置巧55的區(qū)段J、位置+257至位置 +261的區(qū)段K、位置+263至位置+270的區(qū)段L、位置+272至位置+279的區(qū)段M、位置+297至位 置+301的區(qū)段N和位置+303至位置+313的區(qū)段0。
[0075] 如上面所描述的那樣，進行多膚相互之間的W及獨個多膚的保守氨基酸序列區(qū)段 相對于具有SEQ ID No. 1的序列的保守氨基酸序列區(qū)段而言的序列同一性百分比的測定。 結(jié)果呈現(xiàn)在表1和2中。
[0076] 表1:多膚相互之間的序列同一性百分比。
[00791
r0082I
[0083] 實施例3:通過在細胞裂解物中的多膚來水解ZEN
[0084] 為了測定其將ZEN降解為非毒性或低毒性的代謝物HZEN和D監(jiān)EN的能力，如在實施 例1中所描述的那樣，在大腸桿菌中制備由具有SEQ ID No. 17的核巧酸序列所編碼的具有 SEQ ID No.1的多膚，所述多膚就運樣地和W具有C-末端或N-末端6X化S標簽的方式來進 行制備。將有著由具有SEQ ID No. 18-31的核巧酸序列所編碼的具有SEQ ID No.2-15的氨 基酸序列的多膚僅在C-末端標記上6 X化S。各將100mL的具有2.0-2.5的光密度(ODSOOnm) 的大腸桿菌培養(yǎng)物通過在4°C下離屯、來進行收獲，并且重懸浮在20ml Brunner礦質(zhì)培養(yǎng)基 (DSMZ微生物培養(yǎng)基編號462,2012)中。通過用弗氏壓碎器在20 ,OOOpsi下處理3次來將細胞 懸浮液裂解。將如此獲得的細胞裂解物Wl: 1〇、1:100或1:1，〇〇〇的稀釋物進行使用，所述稀 釋物在包含0.1 mg/ml BSA(牛血清白蛋白）的化unner礦質(zhì)培養(yǎng)基中制備。對于ZEN降解試 驗，使用9.9ml的包含0.1 mg/ml BSA的化unner礦質(zhì)培養(yǎng)基、0.1 ml的經(jīng)稀釋的細胞裂解物和 3化1的ZEN底物儲液?？傊?，因此將細胞裂解物Wl: 1，000、1:10，000或1:100,000進行了稀 釋。2. OSmM ZEN溶液(40體積％的4〔壯60體積％的出O)用作ZEN底物儲液。為了制備該溶液， 相應地稱量W晶體形式的ZEN(Romer Labs的生物純標準品，商品編號001109,純度為至少 98%)并裝瓶，并且將其溶解。每個降解批次在25ml玻璃小瓶中進行，并且在25°C下在W IOOrpm進行搖動的情況下溫育總共120小時。在時間點0、0.5、1、2、5、24、47、72和120小時， 各取Iml的樣品，將多膚在99°C下加熱失活10分鐘并膽存于-20°C。在樣品解凍后，通過離屯、 分離開不溶性成分。借助于LC/MS/MS來分析ZEN、監(jiān)EN和DHZEN。為此，借助于尺寸為250mmX 3mm和顆粒大小為扣m的化enomenex Luna C18(2)柱通過色譜法來將代謝物分開。具有l(wèi)ml/ 1的甲酸濃度的乙臘-水混合物用作流動相。在270皿下記錄UV-信號。電噴霧離子化化SI)用 作離子化源。借助于QTrap/LC/MS/MS(S重四極，Applied Biosystems) W "增強模式"來對 ZEN、監(jiān)EN和D監(jiān)EN進行定量。在最遲24小時后，在批料中不再檢測到重大量的ZEN。大部分 (超過80 % )的ZEN被轉(zhuǎn)變成監(jiān)EN或D監(jiān)EN。
[0085] 在圖1中看到，示例性地關(guān)于經(jīng)1:10,000稀釋的細胞裂解物溶液，對于未加標簽的 (圖1A) W及對于加有C-末端6 X HiS標簽的（圖1B)和加有N-末端6 X HiS標簽的（圖1C)具有 SEQ ID No. 1的多膚，ZEN的隨時間的降解和監(jiān)EN及DHZEN的隨時間的增力日。從中清楚地顯而 易見的是：1.ZEN的轉(zhuǎn)化立即且完全地進行，運是因為在于試驗開始后立即抽取的第一個樣 品（0小時）中，就已經(jīng)幾乎不再能夠檢測到ZEN;和2.通過附加 C-末端或N-末端的標簽，未出 現(xiàn)值得注意的活性損失。
[0086] 實施例4:通過在細胞裂解物中的多膚來水解ZEN衍生物
[0087] 為了測定多膚將除了 ZEN外還有ZEN衍生物轉(zhuǎn)化為非毒性或低毒性的代謝物的能 力，如在實施例3中所描述的那樣，W具有C-末端化S標簽的方式制備具有SEQ ID No. 1-15 的多膚，并且作為在"降解15"中的細胞裂解物，考慮各自的具有有著SEQ ID No. 17-31的序 列的合成核巧酸序列。
[0088] 降解試驗如在實施例3中所描述的那樣來進行，其中每種多膚用選自〇-261、0-ZEL、a-ZAL、e-ZAL、Z14G、Z14S和ZAN的每種ZEN衍生物來進行測試。W1:10，000的總稀釋度 來使用細胞裂解物。作為底物儲液，使用等摩爾的（即2 . OSmM的）ZEN衍生物溶液，W代替 2 . OSmM ZEN溶液（40體積 ％ 的ACN+60體積 ％ 的出0)。a-Z化、P-Z化、a-ZAL、P-ZAL和ZAN從 Sigma購進并且作為關(guān)于該分析的標準品來進行使用。按照諸如在P.Krenn等人，2007 (Mykotoxin Research, 23,4,180-184)和M. Sulyok等人，2007(Anal. Bioanal. Chem. 289, 1505-1523)中所描述的方法，W至少90%的純度來制備Z14G和Z14S，并且將其作為關(guān)于該 分析的標準品來進行使用。與實施例3的另一個差別是，僅取一個樣品，即在24小時后。在降 解試驗期間ZEN衍生物濃度的降低借助于LC/MS/MS來進行定量。a-Z化、P-Z化、Z14G和Z14S 按照 M. Sulyok 等人（2010,化〇(1 Qiemishy, 119,408-416)的方法來進行測量;a-ZAL、0-ZAL 和ZAN按照P.Songsermaskul等人（2011,J.of Animal Physiol.and Animal Nutr.,97, 155-161)的方法來進行測量。令人驚訝地表明，在所有降解試驗中，在24小時的溫育后，僅 僅存在ZEN衍生物的起始量的0%至最大13%。
[0089] 實施例5:多膚W及其變體的比活性W及酶動力學參數(shù)
[0090] 多膚W及其變體的比活性的測定通過光度法來進行，其中所有所使用的多膚具有 C-末端6 X化S標簽。多膚或其變體的制備、富集和純化如在實施例1中所描述的那樣來進 行。ZEN至監(jiān)EN的降解通過在315nm的波長下吸光度的下降來測量。ZEN和監(jiān)EN的摩爾消光系 數(shù)[e ]通過實驗來測定，并且為0.0078895山mol-icm-i和0.003085化皿〇1-1畑1-1。消光系數(shù)是 強烈地抑依賴性的，并因此必須總是在精確相同的pH值下，優(yōu)選地甚至在相同的基質(zhì)中進 行活性測量。在32°C下，在UV-VIS光度計化itachi U-2001)中，在200至2500皿的波長范圍 內(nèi)，在石英比色皿中，在5〇11^化13-肥1(抑=8.2)緩沖溶液中進行測量。
[00W] 2.OSmM ZEN溶液(40體積％的ACN+60體積％的此0)用作ZEN底物儲液。為了制備該 溶液，相應地稱量W晶體形式的ZEN(Romer Labs的生物純標準品，商品編號OOl 109，純度為 至少98%)并裝瓶，并且將其溶解。用50mM Tris-HCl(抑=8.2)來制備ZEN底物稀釋物(0.79 i^M、1.5化M、2.3化M、3.1化M、4.7化M、6.2祉M、7.8扣M、9.4化M、10.9化M、12.56y M、14.1化M、15.7化M、17.2祉M、18.8化M )。將多膚溶液用50mM IYis-HCl緩沖液(pH = 8.2)稀釋至大約70ng/ml的終濃度。將ZEN底物稀釋物在水浴中預熱至32°C。
[0092] 給10化1的各個ZEN底物稀釋物滲入0.化1的多膚溶液，并且測量吸光度5分鐘，其 中測量每個"多膚溶液-ZEN底物稀釋物"組合至少兩次。
[0093] 通過考慮ZEN和監(jiān)EN的消光系數(shù)，經(jīng)由隨時間進程的吸光度的斜率，計算出關(guān)于每 個底物濃度的反應速率。
[0094] 名稱"Km值"或"米-曼常數(shù)"設及用于描述酶親和力的參數(shù)，其具有單位[yM]或 [mM]，并且按照H.Bisswang(2002,化巧me KineticsJSBN 3-527-30343-X,第 19頁）借助于 線性化nes標繪圖來計算，其中為此優(yōu)選地使用程序SigmaPlot 12.0的函數(shù)"酶動力學，單 一底物"。名稱"酶反應的催化常數(shù)"或"ksat值"設及用于描述多膚或酶的轉(zhuǎn)化速度的參數(shù)， 其Wkri給出，并且優(yōu)選地借助于程序SigmaPlot 12.0的函數(shù)"酶動力學，單一底物"來計 算。"最大酶速率"或"Vmax值"W單位[yM/s]或[mM/s]給出，并且類似于Km值，借助于線性 化nes標繪圖來測算，其中為此優(yōu)選地使用程序SigmaPlotl2.0的函數(shù)"酶動力學，單一底 物'。
[00M] 借巧干巧所伸巧的酶濃度，報據(jù)下冰公式夾計貸比活忡，
[0096]
[0097] 其中一個單位被定義為在32°C下在50mM化is-HCl緩沖溶液(pH=8.2)中每分鐘 水解1皿〇1 ZEN。
[009引下面，示例性地對于具有SEQ I