牛psma5基因rna干擾載體的構(gòu)建與篩選及在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因生物領(lǐng)域，具體設(shè)及一種牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構(gòu)建與篩選 及在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] PSMA5基因具有多種生物學(xué)功能，它是26s蛋白酶體的組成元件，26s蛋白酶體負(fù)責(zé) 細(xì)胞大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，它是生物體內(nèi)的重要降解途徑，關(guān)系到很多生物進(jìn)程。在之前的 蛋白組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，PSMA5在乳腺的共輛亞油酸(CLA)內(nèi)源性合成中表達(dá)上調(diào)，因此推測(cè) PSM5可能參與CLA的內(nèi)源性合成。
[0003 ] CLA是亞油酸的同分異構(gòu)體，是一系列含有碳8、9、10、11開(kāi)始的共輛雙鍵，具有位 置和幾何異構(gòu)的十八碳二締酸的異構(gòu)體的總稱(chēng)。CLA是近幾十年來(lái)，在反當(dāng)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一 種對(duì)人體有益的功能性不飽和脂肪酸。它具有令人矚目的生理活性，如抗癌、抗動(dòng)脈硬化 癥、抗糖尿病、提高免疫力、改善骨組織代謝、抑制脂肪沉積等生物學(xué)功能。因此，如何提高 CLA合成的含量成為近幾十年來(lái)國(guó)內(nèi)外的一個(gè)研究熱點(diǎn)。在自然界CLA主要Wcis-9，trans-11 CLA的形式存在于反當(dāng)動(dòng)物的乳制品和肉制品中。前期的研究可知牛奶中CLA主要通過(guò) 乳腺中內(nèi)源性合成而來(lái)，但是其合成機(jī)制還不明確。目前的研究?jī)H僅知道TVA可W通過(guò)硬脂 酷輔酶A去飽和酶SCD的去飽和作用轉(zhuǎn)化成CLA，但除了 SCD W外還可能存在其他的蛋白參與 并調(diào)控CLA的合成。盡管W現(xiàn)有的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段可W提高牛奶中CLA的含量，但是其含量還 遠(yuǎn)不能發(fā)揮CLA的最佳生理功效。因此只有對(duì)乳腺中CLA合成的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入的研究， 明確乳腺中內(nèi)源性合成化A的機(jī)制，才能利用分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)手段來(lái)進(jìn)一步提高乳中化A的含 量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構(gòu)建與篩選及在奶牛 乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] 牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構(gòu)建與篩選及在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)，包括如 下步驟：
[0007] Sl、在NCBI上查詢牛PSMA5基因的CDS區(qū)序列，根據(jù)ShRNA的設(shè)計(jì)原則在invi化Ogen 的ShRNA在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站上設(shè)計(jì)PSMA5基因的ShRNA祀序列；
[000引 S2、選擇4條合適的ShRNA祀序列W及一條陰性對(duì)照序列，根據(jù)pLVX-shRNA2-puro 質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)W及ShRNA的設(shè)計(jì)原則在選擇的ShRNA祀序列上加上酶切位點(diǎn)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和 終止轉(zhuǎn)錄的序列，送到華大基因合成；
[0009] S3、將正義鏈（100uM)5ul;反義鏈（100uM)5ul; IOX退火緩沖液加1;d地20 35ul混 合后置于水浴鍋中，95°C加熱5min后，關(guān)閉水浴鍋?zhàn)匀唤禍刂?0°CW下，取樣電泳，切膠回 收退火產(chǎn)物，置于-20°C備用；
[0010] S4、用EcoRI、BamHI限制性內(nèi)切酶雙酶切pLVX-shRNA2-puro空質(zhì)粒，37°C，地，酶切 體系如下：pLVX-shRNA2-puro空質(zhì)粒20ul ;EcoRI限制性內(nèi)切酶Iul ;Ba恤I限制性內(nèi)切酶 Iul; IOX CutSmart緩沖液加 l;dd肥0 23ul;
[0011] S5、將所得退火產(chǎn)物與所得的雙酶切的pLVX-shRNA2-puro空質(zhì)粒用T4 DNA連接酶 連接，16°C，過(guò)夜；
[0012] S6、將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提，提取的質(zhì)粒W備轉(zhuǎn)染細(xì)胞;將magi'細(xì)胞培養(yǎng)到匯合度為80%時(shí)，傳代到6孔板中，24h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ，按照 1 ipof ectamine?2000說(shuō)明操作，轉(zhuǎn)染4她后檢測(cè)巧光；
[0013] S7、收集轉(zhuǎn)染后4她的細(xì)胞，提取RNA，-80°C備用，篩選出最有效的ShRNA重新轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度大于90 %后，更換分化培養(yǎng)基;分化培養(yǎng)4days后提取RNA和總蛋白，-80 °C備用；
[0014] S8、在NBCI上找到牛的內(nèi)參基因 e-act in和PSMA5的CDS區(qū)序列，用primer premie巧軟件設(shè)計(jì)引物，送華大基因合成，引物序列如下：
[0015]
[0016]
[0017]
[001 引
[0019] 反應(yīng)體系如下：2X !^istStart Universal SYBR Green Master(Rox) IOul;引物 (上）0.4ul;引物（下）0.4ul;模板cDNA lul;d地20 8.化 1;
[0020] S9、按照如下程序進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR:
[0021] 首先在95°C運(yùn)行2min，之后40個(gè)PCR循環(huán)(95°C IOs; 60°C34s);之后95°C Imin; 55°C 30s；95°C30s；
[0022] SIO、采用法計(jì)算巧光定量結(jié)果，在4條設(shè)計(jì)的ShRNA序列中選取干擾效率最 高的一條，再轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)的Western blotting檢測(cè)。
[0023] 其中，所述步驟S5中的連接體系如下：退火產(chǎn)物lul;化VX-shRNA2-puro雙酶切產(chǎn) 物Iul; T4 DNA連接酶Iul; IOX T4 DNA連接酶緩沖液Iul; d地20 6ul。
[0024] 其中，所述Western blotting檢測(cè)包括如下步驟:首先將總蛋白用BCA試劑盒進(jìn)行 濃度測(cè)定，按每孔IOug的量上樣，電泳時(shí)間為70v，3小時(shí)；120V，2小時(shí)；采用半干轉(zhuǎn)方法， 15v，45min，將目的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC)上;采用5%脫脂奶粉封閉化，一抗4°C過(guò) 夜解育；然后用TBST洗S次，每次15分鐘；再解育二抗，室溫3小時(shí)；最后用ECL發(fā)光液顯影， 用化non Gis軟件進(jìn)行灰度值分析。
[0025] 其中，所述一抗為GAPDH(abl81603，1:10000，3化Da;Abeam)，PSMA5( 1: 5000，27?。?cell signaling)。
[00%]其中，所述二抗為Goat anti-feAbit IgG-H&L(ab6721,1:3000;Abeam)。
[0027] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0028] 構(gòu)建了PSMA5基因 RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)，并利用實(shí)時(shí)巧光 定量PCR及western blotting的方法分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)PSMA5基因的表達(dá)情況，為 進(jìn)一步掲示PSM5在乳腺的CLA內(nèi)源性合成中的作用提供技術(shù)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中重組RNA干擾載體測(cè)序圖。
[0030] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中PSMA5 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量，
[0031] 圖中，A:細(xì)胞轉(zhuǎn)染4她后PSMA5 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量B:分化4d后PSMA5 mRNA水平 相對(duì)表達(dá)量。
[0032] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中PSMA5蛋白水平相對(duì)表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0034] 實(shí)施例
[0035] 本實(shí)施例所使用的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系(MAC-T)由韓國(guó)李洪求教授實(shí)驗(yàn)室所贈(zèng)。
[0036] 本實(shí)施例所使用的試劑如下：
[0037] DMEM/HIGH 化UCOSE、Penicillin-Streptomycin Solution、胎牛血清購(gòu)自 HyClone公司，氨化可的松、膜島素、催乳素 、RIPA lysis buffer購(gòu)自sigma公司，0.25%-T巧psin 2.21mM 抓TA、DPBS購(gòu)自CORNING公司，M-MLV Reverse Transcrip化se、dNTP Mix、 01igo(dT)15 P;rime;r、RecombinantRNasin@Ribonuc lease Inhibito;r、T4 DNA Ligase、BamHI限制性內(nèi)切酶、EcoRI限制性內(nèi)切酶、6曰3*邱?凝膠及PCR回收試劑盒、質(zhì)粒小 提試劑盒購(gòu)自Promega公司，DNA純化試劑盒、D2000 marker、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自 天根公司，TRlzol?Reagent、lip〇fectamine?2〇〇〇購(gòu)自 invitrogen公司，pLVX-shRNA2- puro質(zhì)粒購(gòu)自優(yōu)寶生物公司，F(xiàn)'astStart Universal SYBR Green Master(ROX)購(gòu)自羅氏公 司，primary antibodies:PSMA5貝勾自cell signaling公司，primary antibodies：GAPDH, polyclonal secondary antibody：Goat anti-Rabbit IgG-H&L貝勾自abeam公司，ECL顯影試 劑盒購(gòu)自化ermo公司。
[0038] 本實(shí)施例中牛乳腺上皮細(xì)胞MAC-T生長(zhǎng)培養(yǎng)基為DMEM/HI GHGLUC0SE化yClone) + 10%胎牛血清巧OOul膜島素（5iig/iil)巧OOul氨化可的松（lyg/iU ) + 1 %青霉素-鏈霉素 (lOOIU/ml青霉+100μg/ml鏈霉素）。分化培養(yǎng)基為DMEM/HI GHGLUC0SE化yClone)W%胎牛 血清巧OOul膜島素（5iig/yl)巧OOul氨化可的松（lyg/iU)巧OOul催乳素（5ug/ul)+l%青霉 素-鏈霉素（lOOIU/ml青霉+lOOμg/ml鏈霉素）。
[0039] Sl、在NCBI上查詢牛PSMA5基因的CDS區(qū)序列，根據(jù)ShRNA的設(shè)計(jì)原則在invi化Ogen 的ShRNA在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站上設(shè)計(jì)PSMA5基因的ShRNA祀序列；
[0040] S2、選擇4條合適的ShRNA祀序列W及一條陰性對(duì)照序列，根據(jù)pLVX-shRNA2-puro 質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)W及ShRNA的設(shè)計(jì)原則在選擇的ShRNA祀序列上加上酶切位點(diǎn)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和 終止轉(zhuǎn)錄的序列，送到華大基因合成；
[0041 ] S3、將正義鏈（100uM)5ul;反義鏈（100uM)5ul; IOX退火緩沖液加 1;d地20 35ul混 合后置于水浴鍋中，95°C加熱5min，之后關(guān)閉水浴鍋?zhàn)匀唤禍?，溫度降?0°CW下，取樣電 泳，切膠回收退火產(chǎn)物，置于-20°C備用；
[0042] S4、用EcoRI、BamHI限制性內(nèi)切酶雙酶切pLVX-shRNA2-puro空質(zhì)粒，37°C，地，酶切 體系如下：pLVX-shRNA2-puro空質(zhì)粒20ul ;EcoRI限制性內(nèi)切酶I