ul ;Ba恤I限制性內切酶 Iul; IOX 〇1151113的緩沖液加 1 ;dd肥023ul;
[0043] S5、將所得退火產物與所得的雙酶切的pLVX-shRNA2-puro空質粒用T4 DNA連接酶 連接，16°C，過夜，連接體系如下:退火產物Iul;
[0044] pLVX-shRNA2-puro雙酶切產物lul;T4DNA連接酶lul;10XT4DNA連接酶緩沖液 lul;d地20 6ul;
[0045] S6、將測序正確的菌液進行無內毒素質粒大提，提取的質粒W備轉染細胞;將magi'細胞培養(yǎng)到匯合度為80%時，傳代到6孔板中，24h后進行細胞轉染 ，按照 1 ipof ectamine?2000說明操作，轉染4她后檢測巧光；
[0046] S7、收集轉染后4她的細胞，提取RNA，-80°C備用，篩選出最有效的ShRNA后，用最有 效的ShRNA重新轉染細胞，待細胞匯合度大于90 %后，更換分化培養(yǎng)基;分化培養(yǎng)4days后提 取RNA和總蛋白，-80°C備用；
[0047] S8、在NBCI上找到牛的內參基因 e-act in和PSMA5的CDS區(qū)序列，用primer premie巧軟件設計引物，送華大基因合成，引物序列如下：
[004引 0-actin-F:5 ' CAGCAAGCAGGAGTACGATG3 '；
[0049] 0-actin-R:5'AGCCATGCCAATCTCATCTC3'；
[0050] PSMA5-F:5 ' CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3 '；
[0化 1 ] PSMA5-R:5 ' CTCTGAGCACCCTCTGAAGC3 '；
[0052]反應體系如下：2X FastSl:a;rt Universal SYBR Green Master(Rox)
[0化3] lOul;引物（上）0.4ul;引物（下）0.4ul;模板cDNA lul;d地20 8.化I;
[0化4] S9、按照如下程序進行實時巧光定量PCR:
[0化5]首先在95°C運行2min，之后40個PCR循環(huán)(95°C 10s;6(TC 34s);之后95°Clmin;55 °C 30s；95°C 30s O
[0056] SIO、采用法計算巧光定量結果，在4條設計的ShRNA序列中選取干擾效率最 高的一條，再轉染細胞，進行后續(xù)的Western blotting檢測。
[0化7] Western blotting檢測PSMA5蛋白表達變化
[005引首先將總蛋白用BCA試劑盒進行濃度測定，按每孔IOug的量上樣。電泳時間為70v， 3小時；120v，2小時。采用半干轉方法，15v，45min，將目的蛋白轉印到硝酸纖維素膜(NC化。 采用5%脫脂奶粉封閉化，一抗4°(：過夜解育。一抗為64?0^曰6181603，1:10000,3化0曰； Abeam)，PSMA5( 1:5000，27邸；cell signaling)。然后用TBST洗S次，每次 15分鐘。再解育二 抗，室溫3小時。二抗為Goat anti-RaW3it IgG-服L(ab6721，l:3000;Abcam)。最后用E化發(fā) 光液顯影，用化non Gis軟件進行灰度值分析。
[0059] 將測得的試驗數(shù)據利用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0進行分析。對數(shù)據進行單因素方差分 析(One-Way AN0VA) dP值小于0.05的表示有顯著性差異，小于0.0 l的表示有極顯著性差異。
[0060] 重組RNA干擾載體測序結果如圖1，結果顯示，4條ShRNA干擾序列W及1條陰性對照 序列均測序正確，初步表明RNA干擾載體構建成功。
[0061 ] 實時巧光定量結果顯示:如圖2中的A，細胞轉染4她后，shRNA-2組和陰性對照組的 PSMA5 mRNA相對表達量沒有顯著差異(p>0.05);shRNA-1組，shRNA-3組和shRNA-4組PSMA5 mRNA相對表達量顯著低于陰性對照組(p<0.05)，并且shRNA-4組的PSMASmRNA相對表達量 最低。因此，ShRNA-I，shRNA-3和shRNA-4均為有效的ShRNA干擾序列，其中干擾效果最好的 序列為shRNA-4。如圖帥的B，用最有效的shRNA-4重新轉染奶牛乳腺上皮細胞(MAC-T)，分 化4d后，結果顯示其PSMASmRNA相對表達量顯著低于陰性對照組(P <0.05)。
[0062] 如圖3，分化4d后，shRNA-4組PSMA5蛋白水平相對表達量顯著低于陰性對照組(P < 〇.〇5)。表明，3111?麻-4為口5145基因有效的3111?麻干擾序列，并且其在奶牛乳腺上皮細胞 (MC-T)中成功表達。
[0063] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W作出若干改進和潤飾，運些改進和潤飾也應 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構建與篩選及在奶牛乳腺上皮細胞中的表達，其特征在 于，包括如下步驟： 51、 在NCBI上查詢牛PSMA5基因的⑶S區(qū)序列，根據shRNA的設計原則在invitrogen的 shRNA在線設計網站上設計PSMA5基因的shRNA靶序列； 52、 選擇4條合適的shRNA革E1序列以及一條陰性對照序列，根據pLVX-shRNA2-puro質粒 的酶切位點以及shRNA的設計原則在選擇的shRNA靶序列上加上酶切位點、莖環(huán)結構和終止 轉錄的序列，送到華大基因合成； 53、 將正義鏈（100uM)5ul;反義鏈（100uM)5ul; 10X退火緩沖液5ul;ddH20 35ul混合后 置于水浴鍋中，95°C加熱5min后，關閉水浴鍋自然降溫至30°C以下，取樣電泳，切膠回收退 火產物，置于-20 °C備用； 54、 用EcoRl、BamHl限制性內切酶雙酶切pLVX-shRNA2-puro空質粒，37 °C，4h，酶切體系 如下:pLVX_shRNA2-puro空質粒20ul ;EcoRl限制性內切酶lul ;BamHl限制性內切酶lul; 10X CutSmart緩沖液5ul; ddH20 23ul; 55、 將所得退火產物與所得的雙酶切的pLVX-shRNA2-puro空質粒用T4 DNA連接酶連 接，16°C，過夜； 56、 將測序正確的菌液進行無內毒素質粒大提，提取的質粒以備轉染細胞;將MAC-T細 胞培養(yǎng)到匯合度為80 %時，傳代到6孔板中，24h后進行細胞轉染，按照1 ipofectamine?2000 說明操作，轉染48h后檢測熒光； 57、 收集轉染后48h的細胞，提取RNA，-80 °C備用，篩選出最有效的shRNA重新轉染細胞， 待細胞匯合度大于90 %后，更換分化培養(yǎng)基；分化培養(yǎng)4days后提取RNA和總蛋白，-80°C備 用； 58、 在NBCI上找到牛的內參基因 β-actin和PSMA5的CDS區(qū)序列，用primer premier5軟 件設計引物，送華大基因合成，引物序列如下： β-actin-F:5 ' CAGCAAGCAGGAGTACGATG3 '； β-actin-R:5 'AGCCATGCCAATCTCATCTC3 '； PSMA5-F:5 ' CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3 '； PSMA5-R:5，CTCTGAGCACCCTCTGAAGC3，； 反應體系如下：2X FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10ul;引物（上） 0.4111;引物（下）0.4111;模板。0嫩1111;(1詘20 8.2111; 59、 按照如下程序進行實時熒光定量PCR:條件如下 首先在 95°C 運行 2min，之后 40 個 PCR 循環(huán)（95°C10s;60°C34s);之后 95°Clmin;55°C30s; 95〇C30s； S10、采用2-ΛΛα法計算熒光定量結果，在4條設計的shRNA序列中選取干擾效率最高的 一條，再轉染細胞，進行后續(xù)的Western blotting檢測。2. 根據權利要求1所述的牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構建與篩選及在奶牛乳腺上皮細 胞中的表達，其特征在于，所述步驟S5中的連接體系如下:退火產物lul; pLVX-shRNA2-puro 雙酶切產物lul;T4 DNA連接酶lul;10X T4 DNA連接酶緩沖液lul;ddH20 6ul。3. 根據權利要求1所述的牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構建與篩選及在奶牛乳腺上皮細 胞中的表達，其特征在于，所述Western blotting檢測包括如下步驟:首先將總蛋白用BCA 試劑盒進行濃度測定，按每孔lOug的量上樣，電泳時間為70v，3小時；120v，2小時;采用半干 轉方法，15v，45min，將目的蛋白轉印到硝酸纖維素膜(NC)上;采用5%脫脂奶粉封閉3h，一 抗4 °C過夜孵育;然后用TBST洗三次，每次15分鐘；再孵育二抗，室溫3小時；最后用ECL發(fā)光 液顯影，用Tanon Gis軟件進行灰度值分析。4. 根據權利要求3所述的牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構建與篩選及在奶牛乳腺上皮細 胞中的表達，其特征在于，所述一抗為GAPDH(abl81603，1:10000，36kDa;Abeam)，PSMA5(1: 5000,27KD;cell signaling)。5. 根據權利要求3所述的牛PSMA5基因 RNA干擾載體的構建與篩選及在奶牛乳腺上皮細 胞中的表達，其特征在于，所述二抗為Goat anti-Rabbit IgG-H&L(ab6721，l:3000; Abeam)〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了牛PSMA5基因RNA干擾載體的構建與篩選及在奶牛乳腺上皮細胞中的表達，首先設計出4條待選的shRNA序列以及1條陰性對照序列，構建RNA干擾載體，然后轉染到奶牛乳腺上皮細胞(MAC-T)中，最后利用實時熒光定量PCR和Western Blotting技術分別檢測PSMA5在奶牛乳腺上皮細胞中mRNA和蛋白水平的表達。本發(fā)明構建了PSMA5基因RNA干擾載體，轉染奶牛乳腺上皮細胞，并利用實時熒光定量PCR及western blotting的方法分別在mRNA和蛋白水平檢測PSMA5基因的表達情況，為進一步揭示PSMA5在乳腺的CLA內源性合成中的作用提供技術依據。
【IPC分類】C12N15/66, C12N15/85
【公開號】CN105713922
【申請?zhí)枴緾N201510791376
【發(fā)明人】金永成, 遲玉楊, 張晶, 沈景林, 周長海, 牛淑玲
【申請人】吉林大學
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2015年11月13日