抗原檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒化epatitis C virus,肥V)感染而引起的嚴(yán)重威脅人 類健康的傳染性疾病。全球約有1.3-1.7億HCV感染者，大約20 %可W自然清除，80%發(fā)展為 HCV慢性感染。10-20 %的HCV慢性感染會進(jìn)一步發(fā)展為慢性進(jìn)行性肝病，包括肝硬化、肝細(xì) 胞癌等。HCV是一種非甲非乙型肝炎病毒，后命名為丙型肝炎病毒，歸屬于肝炎病毒屬 化epacivirus)，黃病毒科(Flaviviridae)。HCV病毒體呈球形，為單股正鏈RNA病毒。HCV- RNA全長約為9.化b，包括一個(gè)位于基因中央的開放閱讀框(0RF)。該閱讀框編碼3000多氨基 酸的前體多聚蛋白，其通過宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10個(gè)具有獨(dú)立功能的HCV蛋 白，根據(jù)功能的不同分別命名為核屯、蛋白Core(C)，包膜蛋白（envelope proteinHJ化1、 E2)，p7和非結(jié)構(gòu)蛋白（non s1:;ruc1:ural p;rotein)NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。NS3蛋白是 HCV病毒復(fù)制中重要的功能蛋白之一，發(fā)揮絲氨酸蛋白酶，解旋酶和ΝΤΡ酶活性，成為當(dāng)今 HCV診斷，治療和預(yù)防的研究熱點(diǎn)。
[0003] 由于多數(shù)丙肝患者不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，大部分病人直到出現(xiàn)肝硬化甚至肝癌 時(shí)，才發(fā)現(xiàn)自己患有丙肝。因此早期診斷、早期治療非常重要。
[0004] 目前我國阻斷丙型肝炎傳播的主要方法是：1、酶聯(lián)免疫吸附法化LISA)檢測丙型 肝炎抗體(抗-HCV)篩選供血員，然而抗-HCV的出現(xiàn)是在HCV感染后的6-12周(窗口期），所W 抗-HCV陰性并不能排除攜帶HCV具有傳染性的可能，存在漏檢的可能性。2、HCV-RNA檢測存 在W下問題:價(jià)格昂貴，國產(chǎn)為200元，進(jìn)口為400元。3、由于RNA易降解，易出現(xiàn)假陰性，因此 對樣本要求高；易出現(xiàn)假陰性、假陽性結(jié)果，對檢測人員的要求高。
[0005] 目前國內(nèi)已有的丙肝抗原檢測只針對核屯、抗原化CV-CAg)，HCV核屯、抗原的檢測也 可縮短肥V診斷的"窗口期"，然而核屯、抗原是HCV結(jié)構(gòu)區(qū)的一部分，檢出率低，若能對非結(jié)構(gòu) 區(qū)抗原進(jìn)行聯(lián)合檢測，可能將提高檢出率。
[0006] 血清中可存在游離的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3,其保守性相對較高，可用于血清學(xué)診斷。本 公司產(chǎn)品丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法），針對丙肝非結(jié)構(gòu)蛋白NS3,聯(lián)合上 述檢測方法可W避免丙型肝炎篩查漏診的發(fā)生，縮短窗口期，具有早期診斷丙型肝炎的臨 床價(jià)值。
[0007] HCAg是HCV復(fù)制的直接指標(biāo)，在血液中含量少，為了研究HCV在宿主體內(nèi)有無復(fù)制， 對他人有無傳染性，W及解決HCV感染的早期診斷，需要用特異性強(qiáng)、敏感度高的抗-HCV McAb建立敏感、特異和快速的血液中HCAg直接檢測試劑。由于丙型肝炎病毒的高度變異性， 人們在設(shè)計(jì)測定丙肝抗原的試劑盒時(shí)，自然地把注意力集中在病毒基因序列相對保守的結(jié) 構(gòu)蛋白核屯、抗原。因此，目前商品化的試劑盒都是針對核屯、抗原，忽略了非結(jié)構(gòu)蛋白NS3抗 原作為抗原祀點(diǎn)的可行性。國際上美國強(qiáng)生公司已推出了用雙抗體夾屯、法定性或定量檢測 血清樣品中總的或游離的HCV核屯、抗原化ISA試劑，雅培公司采用化學(xué)發(fā)光法定量檢測血清 或血漿樣品的HCV核屯、抗原化ISA試劑。但其試劑價(jià)格昂貴，不適合在國內(nèi)普及應(yīng)用。最近， 國外有報(bào)道:NS3抗原區(qū)域具有相對保守的抗原決定簇和較高的抗原性，是目前HCV抗體診 斷試劑盒的關(guān)鍵抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的：一種丙型肝炎病毒NS3抗原檢 測試劑盒，包括如下主要成分:抗HCV-NS3單克隆抗體包被板、HCV-NS3校準(zhǔn)品、樣品稀釋液、 濃縮的抗體酶結(jié)合物、濃縮的抗體酶結(jié)合物稀釋液、濃縮洗涂液、單組份TMB顯色液、終止 液、封板膜。
[0010] 進(jìn)一步地，所述抗HCV-NS3單克隆抗體包被板為兩種抗HCV-NS3單克隆抗體包被的 酶標(biāo)板。
[0011] 進(jìn)一步地，所述濃縮的抗體酶結(jié)合物為第Ξ種抗HCV-NS3單克隆抗體與辣根過氧 化物的酶結(jié)合物。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于： 包括如下步驟：
[0013] (1)準(zhǔn)備試劑盒和待測樣本，將濃縮洗涂液和濃縮的抗體酶結(jié)合物分別進(jìn)行稀釋；
[0014] (2)加入準(zhǔn)備好的待測樣本、HCV-NS3校準(zhǔn)品和樣品稀釋液，輕輕震蕩均勻，封板， 37°C振蕩溫浴40min;
[0015] (3)洗板6次，拍干，加入稀釋后的濃縮的抗體酶結(jié)合物，封板，37°C振蕩溫浴 30min;
[0016] (4)洗板6次，拍干，加入單組份TMB顯色液，封板，37°C振蕩溫浴lOmin;
[0017] (5)加入終止液，lOmin內(nèi)在酶標(biāo)儀上ii定0D值；
[001引（6)處理數(shù)據(jù)。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述試劑盒在檢測丙型肝炎病毒中的應(yīng)用。
[0020] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有W下優(yōu)勢：
[0021] (1)本發(fā)明應(yīng)用純化HCV基因工程表達(dá)抗原HCAg對Ba化/c小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫， 共免疫3次，小鼠產(chǎn)生抗體滴度高達(dá)1:25600,取得了良好的免疫效果，所獲的五株抗-HCV McAb只與HCV抗原蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，同皿V重組蛋白和大腸桿菌化-21菌體均無交叉反應(yīng)，具有 良好的特異性。經(jīng)鑒定，該抗體均屬IgGl型，K鏈。
[0022] (2)本發(fā)明制備的抗-HCV McAb具有W下特點(diǎn)：1)純化HCV基因工程表達(dá)抗原蛋白 效價(jià)高，純度好，為成功免疫動物和細(xì)胞融合打下了良好的基礎(chǔ);2)所建立的5株單克隆雜 交瘤細(xì)胞株分泌的抗-HCV蛋白效價(jià)高，特異性良好，保存于液氮中多次復(fù)蘇傳代后仍能穩(wěn) 定分泌抗體，用化ISA測定效價(jià)均未降低;3)所獲得的抗-HCV McAb同時(shí)含有抗HCV核屯、蛋白 和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3,為建立靈敏而有較寬檢測范圍的HCAg檢測試劑奠定了基礎(chǔ)。
[00剖 （3)本發(fā)明通過對242份肥V-NS3抗原陽性樣品的基因分型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，化型178 份，占73.6%，2a型53份，占21.9%，3a型4份，占1.7%，3b型5份，占2.1 %，6a型2份，占 0.8%，說明本發(fā)明試劑盒可W覆蓋在我國流行的HCV主要基因型。
[0024] (4)本發(fā)明在對1245例臨床乙型肝炎患者血清樣本的檢測中，應(yīng)用本發(fā)明試劑盒 測得HCV-NS3抗原陽性率為59 %，與HCV-RNA陽性重合率為80 %，與抗-HCV陽性重合率為 64%。
[0025] (5)本發(fā)明在對319名丙肝患者進(jìn)行針對NS3的藥物（Simprevir)療效的對比研究 中，應(yīng)用本發(fā)明試劑盒監(jiān)測患者治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn);丙肝患者在接受針對NS3治療時(shí)，在監(jiān) 測治療效果方面，本發(fā)明試劑盒顯示出較HCV-RNA檢測方法更高的靈敏度。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例一
[0027] 單克隆抗體的制備材料與方法
[002引 1.1材料
[0029] 純化HCV基因工程表達(dá)抗原HCAg，為中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，NS3 抗原的氨基酸位置為175-423，蛋白質(zhì)1.275g/L;
[0030] RPM1640和胎牛血清購自GibcoBRLP公司；
[0031] SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；
[0032] Ba化/c小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中屯、；
[0033] 單克隆抗體IgG亞類鑒定試劑為Sigma公司產(chǎn)品；
[0034] 抗-HCV ELISA檢測試劑盒由本所制備；
[0035] 抗-HCV McAb分片斷鑒定試劑為INN0GE肥TICS N.V.公司產(chǎn)品。
[0036] 1.2 方法
[0037] 1.2.1動物免疫
[0038] 取肥V重組抗原蛋白300mg/L與完全福氏佐劑等量混合制成乳化劑，共免疫Ba化/c 小鼠5只。第1次免疫l(K)yg/只，皮下多點(diǎn)注射，2周后用不完全福氏佐劑第2次免疫，劑量、途 徑與第1次相同。2周后尾靜脈取血測定效價(jià)，抗-HCV效價(jià)達(dá)1:1000~1:5000時(shí)供融合用。融 合前3d用抗原直接腹腔脾區(qū)加強(qiáng)免疫1次。
[0039] 采用常規(guī)間接化ISA法測定抗-HCV:包被聚苯乙締板的純化重組HCAg濃度為5mg/ L，酶標(biāo)記抗體為羊抗鼠 IgG，工作濃度為1:5000，酶標(biāo)儀450皿波長測定0D值。P/N值> 2.1倍 為陽性，< 2.1倍為陰性(N值<0.05，按0.05計(jì)算）。
[0040] 1.2.2細(xì)胞融合及克隆化和腹水制備
[0041] (1)免疫脾細(xì)胞的制備
[0042] 取已免疫Ba化/c小鼠，眼球放血供檢測抗體用。無菌操作取出脾臟，輕輕清洗并去 除結(jié)締組織，置于銅網(wǎng)上擠壓研磨，并通過網(wǎng)孔擠到溶液中，離屯、l〇〇〇r/min，5min，棄上清， 重懸于溶液中制成脾細(xì)胞懸液，加臺吩蘭染液作細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0043] (2)髓瘤細(xì)胞液制備
[0044] 將骨髓瘤細(xì)胞置于37°C5%C02培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)。融合當(dāng)天收集處于對數(shù)生長期 的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，離屯、lOOOr/min，5min，棄上清，重懸于液體后作細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0045] (3)細(xì)胞融合
[0046] 分別吸取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞懸液按5:1混合，置于離屯、管內(nèi)充分混勻后離屯、，棄 上清，輕輕彈擊管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻成糊狀。取50%的聚乙二醇(PEG)0.7mL加入混合 細(xì)胞中促進(jìn)融合，嚴(yán)格控制作用時(shí)間在2~3min內(nèi)，立即加入不完全培養(yǎng)液稀釋，使PEG中止 作用。離屯、80化/min，7min，棄上清。加入lOmL HAT培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，并加入已鋪成飼養(yǎng) 細(xì)胞層的96孔板中，每孔0.1血，置37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4~5d后換液1次，8~10加寸取 上清，用化ISA法測抗-HCV，進(jìn)行初篩，陽性孔進(jìn)行亞克隆。
[0047] (4)雜交瘤細(xì)胞的克隆化及腹水制備
[0048] 將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細(xì)胞用加樣器反復(fù)吹打均勻后，取少許細(xì)胞懸液 置另一無菌小瓶中。將此細(xì)胞懸液準(zhǔn)確地進(jìn)行系列稀釋，直至每毫升含10個(gè)細(xì)胞。將稀釋好 的細(xì)胞懸液接種于已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板中，每孔O.lmL，即每孔含一個(gè)細(xì)胞，置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5d左右在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆生長情況。反復(fù)克隆3次，確定 陽性單克隆細(xì)胞株，最后克隆株編號，置液氮中保存。取出部分陽性克隆株轉(zhuǎn)入24孔板，繼 而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將接種的雜交瘤細(xì)胞吹打下來，l〇(K)r/min離屯、lOmin，棄上 清，沉淀物用無血清培養(yǎng)液懸浮混勻，并將細(xì)胞調(diào)至（1~2) X106個(gè)/mL。選擇