一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒及其用途。本發(fā)明提供一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標(biāo)記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、包被有LP抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒以患者的尿液或痰液作為檢測(cè)樣本，結(jié)合近紅外熒光檢測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)出患者標(biāo)本中特異性、可溶性LP抗原。
【專利說(shuō)明】
-種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外黃光檢測(cè)試劑盒及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)試劑 盒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 軍團(tuán)菌屬的模式菌是嗜肺軍團(tuán)菌化egionella Pneumo地ila)，占軍團(tuán)菌的90% (路鳳，程義斌，王仲，等.呼吸系統(tǒng)疾病就診患者嗜肺軍團(tuán)菌感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].環(huán) 境與健康雜質(zhì)，2012, 27(3) :203-205),其散發(fā)病例占社區(qū)獲得性肺炎的1% -15%、醫(yī)院 內(nèi)感染肺炎的3. 8%、診斷困難的不典型肺炎的4%-11% (陸風(fēng)，金銀龍，程義斌，等.軍 團(tuán)菌病的流行概況[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2008, 35(2) :78)。軍團(tuán)病化egionnaires disease)主要是由嗜肺軍團(tuán)菌引起的一種細(xì)菌性呼吸道傳染病。針對(duì)尿液中LP抗原的 檢測(cè)方法主要有RIA、及EIA等（張旭，馬妮，鄭洪.環(huán)境中軍團(tuán)菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn) 展.[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009, 19(1) :210-241)。但是，RIA法具有放射性，EIA耗時(shí)較 長(zhǎng)且感染初期血清中抗體含量達(dá)不到檢測(cè)水平，不適合臨床檢測(cè)應(yīng)用。我國(guó)現(xiàn)階段對(duì)于嗜 肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)技術(shù)水平仍相對(duì)滯后（朱家馨，陳文思，黃靜，等.一種國(guó)產(chǎn)嗜肺軍團(tuán)菌抗 原檢測(cè)試劑盒的初步評(píng)價(jià)[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010, 26巧）：1637-1638)。因此，開發(fā)一種可 W快速準(zhǔn)確的檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的方法已成為臨床檢測(cè)研究中亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅 外巧光檢測(cè)試劑盒及其用途，用于建立高效可行的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)技術(shù)， 解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅 外巧光檢測(cè)試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標(biāo)記有 免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、包被有LP抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。 陽(yáng)〇化]優(yōu)選的，所述免疫巧光探針為L(zhǎng)P抗體包被的近紅外巧光乳膠微球顆粒。
[0006] 更優(yōu)選的，所述巧光乳膠微球顆粒的直徑為140-160nm。
[0007] 近紅外光（NIR)，是介于可見光（VI巧和中紅外光（MIR)之間的電磁波，ASTM定義 NIR為波長(zhǎng)在780nm-2526皿范圍內(nèi)的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或巧光強(qiáng)度很 小，可避免背景干擾。同時(shí)由于散射光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大 為減少。
[0008] 本發(fā)明第二方面提供所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)試劑盒的制備方法，包 括如下步驟：
[0009] 1)用憐酸鹽緩沖液將巧光乳膠微粒離屯、清洗并將乳膠顆粒分散（將巧光乳膠微 粒用PH7. 3,0.0 lmol/L的憐酸鹽緩沖溶液清洗，10000巧m離屯、lOmin，離屯、后的沉淀物用憐 酸鹽緩沖液復(fù)溶，并用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將乳膠微粒分散，此步驟重復(fù)兩次），在清洗好的 乳膠顆粒中加入LP抗體；加入邸CA使抗體與顆粒偶聯(lián)；再加入乙醇胺封閉乳膠顆粒上多 余的基團(tuán)，制備獲得探針溶液；
[0010] 2)利用微量蛋白點(diǎn)膜系統(tǒng)將含有LP抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘 干備用；
[0011] 3)用制備好的探針溶液浸潤(rùn)玻璃纖維薄膜，真空干燥機(jī)中干燥備用；
[0012] 4)將包被LP抗體的硝酸纖維素膜、標(biāo)記有免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、樣品 墊、吸水紙及背板組裝制備成嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)試劑盒。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟1中，憐酸鹽緩沖液為0. 009-0.0 llmol/l，PH7. 25-7. 35的憐酸 鹽緩沖液。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟1中，巧光乳膠微粒的直徑為140-160nm。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟1中，乳膠顆粒、LP抗體、邸CA的重量比為9-11 :0. 9-1. 1 : 0. 9-1. 1。
[0016] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，乳膠顆粒、LP抗體、邸CA的投料量分別為lmg、100ug、 lOOugo
[0017] 所述步驟1中乙醇胺的加入量為適量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整乙醇 胺的用量。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟2中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可選取適當(dāng)濃度和抑的PBS緩沖液。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟2中，含有LP抗體的緩沖溶液中LP抗體的濃度為1. 8-2. 2mg/ ml。
[0021] 優(yōu)選的，所述步驟2中，LP抗體的噴加量為0. 9-1. lul/cm。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟2中，烘干的具體條件為36-38Γ烘箱烘干。
[0023] 優(yōu)選的，所述LP抗體的制備方法如下：
[0024] 1)抗原的制備：將嗜肺軍團(tuán)菌菌株接種在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用生理鹽水從平板上 洗脫細(xì)菌，離屯、獲取菌泥（同時(shí)去除平板被洗脫的液體成分），菌泥加適量PBS緩沖液超聲 破裂，過陰離子柱純化，用化C1水溶液洗涂，再用化C1水溶液洗脫，洗脫液裝透析袋，用PEG 包埋吸水濃縮，獲取抗原；
[0025] 優(yōu)選的，所述嗜肺軍團(tuán)菌菌株購(gòu)自ATCC。
[00%] 優(yōu)選的，所述抗原的制備過程中的培養(yǎng)條件具體為：37°C、5% C02的條件下培養(yǎng)， 3-5天后洗下菌苔。
[0027] 優(yōu)選的，所述抗原的制備過程中的培養(yǎng)基為緩沖活性碳酵母瓊脂培養(yǎng)基度CYE)。
[0028] 優(yōu)選的，所述離屯、獲取菌泥的條件為4500-550化pm。
[0029] 優(yōu)選的，所述用化化水溶液洗涂時(shí)，化Cl的溶液濃度為45-55mM。
[0030] 優(yōu)選的，所述用化Cl水溶液洗脫時(shí)，化Cl的溶液濃度為135-165mM。
[0031] 2)單克隆抗體的制備：
[0032] 動(dòng)物免疫對(duì)小鼠進(jìn)行免疫；
[0033] 優(yōu)選的，所述對(duì)小鼠進(jìn)行免疫具體包括如下步驟：第一次免疫時(shí)抗原加等量的福 氏完全佐劑充分乳化，第二次及第Ξ次抗原加等量福氏不完全佐劑充分乳化，細(xì)胞融合前 腹腔直接注射抗原加強(qiáng)免疫，一免抗原加福氏完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0.1 mg/鼠，15 天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐劑，抗原量為0. 2mg/鼠，25天后Ξ免抗原加福氏不 完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0. 2mg/鼠，10天后剪尾己取血測(cè)化ISA效價(jià)，選取效價(jià)大于 10萬(wàn)倍的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，水劑腹腔注射抗原Img/鼠，Ξ天后取脾臟細(xì)胞融合；
[0034] 細(xì)胞融合：處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，制備B淋己細(xì)胞懸浮液，將B淋己細(xì)胞與 準(zhǔn)備好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的同系SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，制備雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行雜交瘤 細(xì)胞篩選；
[0035] 優(yōu)選的，所述單克隆抗體的制備過程中雜交瘤細(xì)胞篩選的具體方法為：用HAT培 養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，2周后即可篩選出骨髓瘤細(xì)胞與B淋己細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞。
[0036] 雜交瘤細(xì)胞的克隆化：克隆細(xì)胞生長(zhǎng)的各個(gè)孔檢測(cè)100%抗體陽(yáng)性為止；
[0037] 優(yōu)選的，所述克隆化的方法是有限稀釋法。
[003引抗體的制備：將小鼠首先腹腔注射石蠟，1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，1-2周 后，用注射器抽取腹水，純化后即可獲得大量的單克隆抗體。優(yōu)選的，所述腹腔內(nèi)接種雜交 瘤細(xì)胞時(shí)，將雜交瘤細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到IX 105個(gè)/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接種。
[0039] 優(yōu)選的，所述單克隆抗體的制備過程中，小鼠為6-8周齡BALB/C小鼠。
[0040] 優(yōu)選的，單克隆抗體的純化：選擇化Trap巧rotein A FF 5ml預(yù)裝色譜柱純化抗 體，收集純化的抗體備用。
[0041] 本發(fā)明第Ξ方面提供所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)試劑盒在嗜肺軍團(tuán)菌 抗原檢測(cè)領(lǐng)域的用途。
[0042] 所述用途具體為使用所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)試劑盒對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌 抗原進(jìn)行檢測(cè)。 陽(yáng)0創(chuàng)近紅外光（NIR)是介于可見光（VI巧和中紅外光（MIR)之間的電磁波，ASTM定義 NIR為波長(zhǎng)在780nm-2526皿范圍內(nèi)的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或巧光強(qiáng)度很 小，可避免背景干擾。同時(shí)由于散射光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大 為減少。隨著激光巧光、傳感器、免疫檢測(cè)裝置的建立，近紅外巧光分析儀在免疫測(cè)定領(lǐng)域 中顯示出極大的優(yōu)越性。
[0044] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒W患者的尿液或疲液作為檢測(cè)樣本，結(jié)合近紅外巧光 檢測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)出患者標(biāo)本中特異性、可溶性LP抗原。LP抗原近紅外巧光檢 測(cè)法靈敏度高，特異性好，檢測(cè)過程中樣品收集及處理簡(jiǎn)單，可快速準(zhǔn)確的獲得結(jié)果，非常 適合突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)和基層使用。
[0045] 嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，特異型好，可應(yīng)用到臨床檢測(cè)中， 為臨床治療提供定性依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 細(xì)菌培養(yǎng)是LP感染檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但LP的培養(yǎng)條件苛刻，耗時(shí)長(zhǎng)，不適合臨床檢 測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；因感染LP第3-6周后患者血清中抗體含量才能達(dá)到檢測(cè)水平，達(dá)不到疾病 早期診斷的要求，故血清抗體檢測(cè)常用于LP感染的流行病學(xué)回顧性調(diào)查。LD患者在感染 1-3天后即可由尿液排出具有熱穩(wěn)定性及抗膜蛋白酶活性的LP 0-多糖抗原，該抗原在尿 液中的濃度比血清中高30-100倍。與EIA相比，近紅外巧光檢測(cè)法操作更簡(jiǎn)便，耗時(shí)更短， 是更理想更有發(fā)展前景的檢測(cè)手段。
[0047] 本發(fā)明所提供的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)法，實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果顯示，該法 對(duì)LP1型抗原的最低檢出量為lOng/ml，不與其他血清型抗原及多種細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)，與 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果較一致，具有較高的敏感性和特異性。由于嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)條件要求苛刻，可 能導(dǎo)致陽(yáng)性樣品漏檢。整體而言，近紅外巧光法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的可信度及各項(xiàng)性能均已 達(dá)到臨床定性檢測(cè)的要求，有望用于由嗜肺軍團(tuán)菌引發(fā)的軍團(tuán)病的快速早期診斷。
[0048] W下通過特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書 所掲露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可W通過另外不同的具體實(shí) 施方式加 W實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可W基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0049] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"運(yùn)個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0050] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)W及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可W使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0051] 除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。運(yùn)些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor L油oratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons，化w York,1987and periodic updates ;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ;METH0DS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds. )，Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, C虹omatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press, Totowa，1999 等。
[0052] 本發(fā)明各實(shí)施例中試驗(yàn)菌種由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；交叉實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌由本實(shí)驗(yàn) 室培養(yǎng)保存。近紅外巧光檢測(cè)儀，由上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司開發(fā)提供。 陽(yáng)〇5引實(shí)施例1
[0054] 1.疲液采集及保存 陽(yáng)化5] 患者在醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo)下，用力咳出呼吸道深部的疲液，吐至無(wú)菌廣口瓶?jī)?nèi)，立即蓋 緊蓋子保存?zhèn)溆?，待處理的樣本?yīng)置于4°C冰箱保存。
[0056] 2.尿液采集及保存
[0057] 患者在醫(yī)務(wù)人員的指導(dǎo)下清洗并收集清晨第一次尿液，收集的尿液裝在干凈無(wú)菌 的容器中保存?zhèn)溆谩Ｄ蛞簶颖驹?-8°C條件下可W保存72小時(shí)，如需保存更長(zhǎng)時(shí)間，則必須 將樣品保存在-20°C環(huán)境下。應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品，否則會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。樣品不可 保存在自動(dòng)除霜冰箱中。 陽(yáng)化引 3.抗原的制備：
[0059] 從ATCC購(gòu)買嗜肺軍團(tuán)菌菌株，接種在緩沖活性碳酵母瓊脂培養(yǎng)基度CY巧上， 37°C、5% C02的條件下培養(yǎng)，3-5天后用生理鹽水從平板上洗脫細(xì)菌，500化pm離屯、獲取菌 泥（同時(shí)去除平板被洗脫的液體成分），菌泥加適量PBS緩沖液超聲破裂，過陰離子柱純化， 用50mM化C1洗涂，再用150mM化C1洗脫，洗脫液裝透析袋，用陽(yáng)G包埋吸水濃縮，獲取抗 原。
[0060] 4. LP單克隆抗體的制備： 陽(yáng)06U 動(dòng)物免疫：選擇6-8周齡BALB/C小鼠進(jìn)行免疫，第一次免疫時(shí)抗原加等量的福氏 完全佐劑充分乳化，第二次及第Ξ次抗原加等量福氏不完全佐劑充分乳化，細(xì)胞融合前3 天腹腔直接注射抗原加強(qiáng)免疫，一免抗原加福氏完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0.1 mg/鼠， 15天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐劑，抗原量為0. 2mg/鼠，25天后Ξ免抗原加福 氏不完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0. 2mg/鼠，10天后剪尾己取血測(cè)化ISA效價(jià)，選取效價(jià) 大于10萬(wàn)倍的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，水劑腹腔注射抗原Img/鼠，Ξ天后取脾臟細(xì)胞融合； 陽(yáng)06引細(xì)胞融合：采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，制備B淋己細(xì)胞懸 浮液，將B淋己細(xì)胞與準(zhǔn)備好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的同系SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，制備雜交瘤 細(xì)胞；
[0063] 雜交瘤細(xì)胞篩選：用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，2周后即可篩選出骨髓瘤細(xì)胞與B淋己 細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞；
[0064] 雜交瘤細(xì)胞的克隆化：克隆化的方法是有限稀釋法，按照實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法進(jìn)行， 克隆化3-4次，直至克隆細(xì)胞生長(zhǎng)的各個(gè)孔檢測(cè)100%抗體陽(yáng)性為止； W65] 抗體的制備：取BALB/C小鼠，首先腹腔注射石蠟，1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì) 胞，將雜交瘤細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到1X 1〇5個(gè)/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接種。1-2周后，用注 射器抽取腹水，即可獲得大量的單克隆抗體。
[0066] 單克隆抗體的純化：選擇化Trap巧rotein A FF 5ml預(yù)裝色譜柱純化抗體，收集純 化的抗體備用。
[0067] 5.免疫巧光LP抗體顆粒制備： W側(cè)用0. 01mol/L，PH7. 3 + 0. 05的憐酸鹽緩沖液將直徑為150皿的巧光乳膠微粒離屯、 清洗2遍并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒中加入LP抗體；加入邸CA使抗體與顆粒 偶聯(lián)；加入乙醇胺封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)按每毫克微球乳膠100微克的待標(biāo)記抗體， 100微克的邸CA用量標(biāo)記。每毫克的微球乳膠最后加20微克的乙醇胺進(jìn)行封閉。
[0069] 6.試劑盒的制備： 陽(yáng)070] 用0. 01M pH7. 2的PBS緩沖液稀釋LP抗體至最適濃度2. Omg/ml，利用微量蛋白點(diǎn) 膜系統(tǒng)將溶液噴加到適當(dāng)孔徑的硝酸纖維素膜上，按lul/cm的量進(jìn)行噴膜，37°C烘箱烘干 備用。
[0071] 用制備的巧光乳膠微粒-抗體復(fù)合物浸潤(rùn)玻璃纖維薄膜，真空干燥機(jī)中干燥備 用。
[0072] 將包被LP抗體的硝酸纖維素膜、標(biāo)記有免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、 吸水紙及背板組裝制備成嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)試劑盒。 陽(yáng)〇7引 實(shí)施例2
[0074] 嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)法與疲液細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)： 陽(yáng)0巧]疲液細(xì)菌培養(yǎng)：
[0076] 將疲液進(jìn)行預(yù)處理（采用lug/ml膜酶溶液與玻璃碎片振蕩相結(jié)合的方法對(duì)疲液 進(jìn)行前處理后再接種培養(yǎng)），預(yù)處理后的樣品立即接種在GVPC選擇性培養(yǎng)基上，對(duì)疑似嗜 肺軍團(tuán)菌的菌落進(jìn)行革蘭染色，并將革蘭染色陰性的疑似菌落接種在BCYE-a和BCYE-Cys 瓊脂平板上，37°C溫箱培養(yǎng)2d。凡是在BCYE-a培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在BCYE-切S培養(yǎng)基上不生 長(zhǎng)的菌落即可認(rèn)為是嗜肺軍團(tuán)菌。
[0077] 試劑盒檢測(cè)： 陽(yáng)07引待測(cè)樣品為疲液稀釋液，使用0. 01M pH7. 2的PBS緩沖液稀釋，稀釋比例為1 :1。
[0079] 待測(cè)樣品及試劑盒均平衡至室溫開始檢測(cè)，用滴管在每個(gè)試劑盒的加樣孔內(nèi)滴加 3滴樣本（約120-150U1)。15分鐘時(shí)，用近紅外巧光檢測(cè)儀檢測(cè)巧光信號(hào)，并用巧光儀器 進(jìn)行判斷，分析儀的對(duì)巧光信號(hào)的檢測(cè)范圍是AD值0-10000,根據(jù)儀器的性能，CUTOFF值為 50,檢測(cè)AD值大于等于50為陽(yáng)性結(jié)果。
[0080] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比驗(yàn)證。用于細(xì)菌培養(yǎng)的疲液樣本與尿液樣本來(lái)自相 同的患者。嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧光檢測(cè)法與疲液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果如表1所示： W81]表 1
[0082]
[0084] Sensitivity = 75%
[00 化]Specificity = 94. 11 %
[0086] 此外，W尿液為待測(cè)樣品時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果與疲液細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果相符。
[0087] 實(shí)施例3
[0088] 交叉實(shí)驗(yàn)：
[0089] 在嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外檢測(cè)試劑盒分別滴加制備好的糞腸球菌、尿腸球菌、大 腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、克雷伯菌、乳酸桿菌、淋病奈瑟菌、綠脈假單胞菌、大腸桿菌、人型 支原體、解脈脈原體、金黃色葡萄球菌、鏈球菌及幽口螺旋菌菌液（1 X l〇6cFU/ml)，進(jìn)行交 叉實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，檢測(cè)W上細(xì)菌是否對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外巧 光檢測(cè)試劑與細(xì)菌交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，各細(xì)菌交叉實(shí)驗(yàn)中均無(wú)交叉反應(yīng)發(fā)生：
[0090] 表 2
[0091]
[0092] 由實(shí)施例2中的表1和實(shí)施例3中的表2可W看出，在共30份臨床樣本的檢測(cè)中， 經(jīng)近紅外巧光檢測(cè)法檢測(cè)LP陽(yáng)性為4例，陰性為26例；疲液細(xì)菌培養(yǎng)LP陽(yáng)性樣本為3例， 陰性樣本為27例。本方法的靈敏度為75%，特異性為94. 11% ;不與其他細(xì)菌發(fā)生交叉反 應(yīng)；最低測(cè)出量為lOng/ml，穩(wěn)定性及重復(fù)性良好。
[0093] 綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。
[0094] 上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人±皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所掲示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從 加樣端開始依次為樣品墊、標(biāo)記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、包被有LP抗體的硝酸纖 維素膜和吸水紙。2. 如權(quán)利要求1所述的一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所 述免疫熒光探針為L(zhǎng)P抗體包被的近紅外熒光乳膠微球顆粒。3. 如權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒的制 備方法，包括如下步驟： 1) 用磷酸鹽緩沖液將熒光乳膠微粒離心清洗并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒 中加入LP抗體；加入EDCA使抗體與顆粒偶聯(lián)；再加入乙醇胺封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)， 制備獲得探針溶液； 2) 利用微量蛋白點(diǎn)膜系統(tǒng)將含有LP抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘干備 用； 3) 用制備好的探針溶液浸潤(rùn)玻璃纖維薄膜，真空干燥機(jī)中干燥備用； 4) 將包被LP抗體的硝酸纖維素膜、標(biāo)記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、吸 水紙及背板組裝制備成嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒。4. 如權(quán)利要求3所述的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟1中，熒光乳膠微粒的直徑為140-160nm。5. 如權(quán)利要求3所述的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟1中，乳膠顆粒、LP抗體、EDCA的重量比為9-11 :0.9-1. 1 :0.9-1. 1。6. 如權(quán)利要求3所述的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟2中，LP抗體的噴加量為：1. 8-2. 2mg/ml的抗體溶液按0. 9-1. lul/cm的噴量 制備免疫硝酸纖維素膜。7. 如權(quán)利要求3所述的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述LP抗體的制備方法如下： 1) 抗原的制備：將嗜肺軍團(tuán)菌菌株接種在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用生理鹽水從平板上洗脫 細(xì)菌，離心獲取菌泥，菌泥加適量緩沖液超聲破裂，過陰離子柱純化，洗滌后洗脫，洗脫液裝 透析袋，用PEG包埋吸水濃縮，獲取抗原； 2) 單克隆抗體的制備： 動(dòng)物免疫：對(duì)小鼠進(jìn)行免疫； 細(xì)胞融合：處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，制備B淋巴細(xì)胞懸浮液，將B淋巴細(xì)胞與準(zhǔn)備 好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的同系SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，制備雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞 篩選； 雜交瘤細(xì)胞的克隆化：克隆細(xì)胞生長(zhǎng)的各個(gè)孔檢測(cè)100%抗體陽(yáng)性為止； 抗體的制備：將小鼠首先腹腔注射石蠟，1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，1-2周后， 用注射器抽取腹水，純化后即可獲得大量的單克隆抗體。8. 如權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述的嗜肺軍團(tuán)菌抗原近紅外熒光檢測(cè)試劑盒在嗜 肺軍團(tuán)菌抗原檢測(cè)領(lǐng)域的用途。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK105823874SQ201510006063
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月6日
【發(fā)明人】姜小華
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第八五醫(yī)院