嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、carher1-nkt細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、CARHER1-NKT細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，所述嵌合抗原受體為HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、HER1ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。采用本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞治療晚期HER1陽(yáng)性腎癌時(shí)，能夠有效避免采用現(xiàn)有靶向HER1的藥物時(shí)引起的耐藥性，對(duì)腎癌細(xì)胞具有一定的特異殺傷活性，且對(duì)已經(jīng)過(guò)多次治療(如放療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等)但均無(wú)明顯療效的晚期HER1陽(yáng)性腎癌患者有一定的治療效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、CARHER1-NKT細(xì) 胞及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，具體地，設(shè)及過(guò)繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重組表達(dá)載體、工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞 (CARHER1-NKT細(xì)胞）及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] EGFR(epithelial growth factor receptor,表皮生長(zhǎng)因子受體）即肥R1，是原癌 基因c-erbBl的表達(dá)產(chǎn)物，屬于人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體（肥時(shí)家族，其本身具有酪氨酶激酶 活性，一旦與表皮生長(zhǎng)因子巧G巧組合可啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增 殖。肥Rl在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)肥Rl信號(hào)通路在腎癌病理發(fā)生中發(fā)揮重要的 作用，同時(shí)，與正常的腎組織相比，腎癌組織中肥Rl表達(dá)水平高達(dá)90%，其表達(dá)水平與腎癌 疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。盡管最近腎癌的治療已經(jīng)獲得一定的進(jìn)展，但是仍然未提高患者 的生存率，因此亟需探討新的療法來(lái)克服運(yùn)一困擾。
[0003] 目前，在治療晚期肥Rl陽(yáng)性腎癌患者時(shí)，抗肥Rl的藥物治療已經(jīng)處于臨床研究階 段，但是，臨床結(jié)果表明，僅部分腎癌患者采用抗肥Rl的藥物（如祀向肥Rl的小分子抑制 劑）治療有效，并且患者最終會(huì)產(chǎn)生一定的耐藥性，從而影響藥物的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用抗肥Rl的藥物治療晚期肥Rl陽(yáng)性腎癌 患者時(shí)引起的耐藥性的缺陷，提供一種嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基 因和重組表達(dá)載體、工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞（CAR肥Rl-NKT細(xì)胞）及其制備方法和 應(yīng)用，嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞在治療晚期肥Rl陽(yáng)性腎 癌時(shí)，能夠有效避免采用抗肥Rl藥物時(shí)引起的耐藥性，對(duì)腎癌細(xì)胞具有一定的特異祀向殺 傷活性，且對(duì)已經(jīng)過(guò)多次治療（如放療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等）但均無(wú)明顯療效的晚 期肥Rl陽(yáng)性腎癌患者有一定的治療效果。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞治療晚期肥Rl陽(yáng)性腎癌時(shí)，能夠有效避免采用 現(xiàn)有抗肥Rl的藥物治療時(shí)引起的耐藥性，對(duì)腎癌細(xì)胞具有一定的特異祀向殺傷活性，且對(duì) 已經(jīng)過(guò)多次治療（如放療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等）但均無(wú)明顯療效的晚期肥Rl陽(yáng)性 腎癌患者有一定的治療效果。
[0006] 因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為肥315〇。乂-〔08-〔0137-〔03(，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚、肥1?15。。乂、〔08 的較鏈區(qū)化inge區(qū)）和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第=方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了一種工程化肥Rl祀向性的MT細(xì)胞，所述MT細(xì)胞是上 述嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了一種工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞的制備方法，所述方 法包括：
[0011] 包裝攜帶pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得 到的病毒濃縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C。 [001引第六方面，本發(fā)明提供了上述方法制備得到的工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞。 [001引第屯方面，本發(fā)明提供了上述工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤 的制劑中的應(yīng)用。
[0014] 在與肥Rl陽(yáng)性腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明的嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞，即工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞能夠特異性 結(jié)合肥Rl抗原，增強(qiáng)免疫細(xì)胞祀向識(shí)別腎癌細(xì)胞表面肥Rl抗原的能力，加強(qiáng)對(duì)腎癌細(xì)胞的 特異殺傷活性，而且確實(shí)能夠有效避免采用現(xiàn)有抗肥Rl的藥物治療時(shí)引起的耐藥性，對(duì)已 經(jīng)過(guò)多次治療（如放療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等）但均無(wú)明顯療效的晚期肥Rl陽(yáng)性腎 癌患者有一定的治療效果。本發(fā)明的工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞為治療晚期肥Rl陽(yáng)性 腎癌提供了一種新的選擇，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
[0015] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的NKT細(xì)胞表型分析的結(jié)果。 陽(yáng)017] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWP化-CD8-CD137-CD3 C的限制性內(nèi)切酶MluI/ NdeI雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0018] 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C的限制性內(nèi) 切酶Mlul/Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0019] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，逆時(shí)針序列為正向基因片度，順時(shí)針為反向基因片段。
[0020] 圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含有嵌合抗原受體肥RlScFv-CDS-CD 137-CD3 C的病毒濃 縮液對(duì)NKT細(xì)胞的感染效率。
[0021] 圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì) 胞（CARHER1-NKT細(xì)胞）表型鑒定的結(jié)果。
[0022] 圖7為本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)人腎癌細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性分析圖。
[0023] 圖8為本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)晚期肥Rl陽(yáng)性的腎癌患者的治療過(guò)程中，不 同時(shí)間段患者的左腎病灶變化圖。
[0024] 圖9為本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)晚期肥Rl陽(yáng)性的腎癌患者的治療過(guò)程中，不 同時(shí)間段患者的肝臟病灶變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] W下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0026] 本發(fā)明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚、肥RlScFv、CD8的較鏈區(qū)和 跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。
[0027] 優(yōu)選情況下，所述嵌合抗原受體為肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C，由大鼠生長(zhǎng)激素 信號(hào)膚、肥RlScFv、CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào) 結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。進(jìn)一步優(yōu)選地，嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更 進(jìn)一步優(yōu)選地，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0028] 本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，所述基因具有如SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，編碼上述嵌合抗原受體的基因的核巧酸序列如 沈QID NO. 2所示。
[0029] 本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。優(yōu)選情況下，重組表達(dá)載體為慢病 毒表達(dá)載體。對(duì)于慢病毒表達(dá)載體沒(méi)有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 如293T包裝細(xì)胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NTK 細(xì)胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體為pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0030] 對(duì)于慢病毒表達(dá)載體pWP化-肥RlScFv-CDS-CD 137-CD3 C的制備方法沒(méi)有特 別的限定，可W為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3C的制備方法包括W下步驟： 陽(yáng)03U (1)從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞 內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，并克隆至載體pWP化-GFP中，構(gòu)建得到 pWP化-CD8-CD137-CD3C ;
[0032] 似合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和肥RlScFv的核巧酸序列， 并克隆至pWP化-CD8-CD137-CD3C中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后得到序列正確的 pWP化-肥RlScFv-CDS-CD 137-CD3 C。
[0033] 步驟（1)中，對(duì)于從NKT細(xì)胞CDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的 胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的方法沒(méi)有特別的限定，可W為本領(lǐng)域常用的 各種方法，例如可W為RT-PCR法。其中，NKT細(xì)胞可W通過(guò)分離人靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞， 然后進(jìn)行培養(yǎng)獲得。
[0034] 具體地，得到pWP化-CD8-CD137-CD3 C的方法可W包括：提取NKT細(xì)胞的總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄獲得NKT細(xì)胞cDNA，W得到的NKT細(xì)胞CDNA為模板，利用引物Pl (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQID NO. 13)和P4(SEQID NO. 14)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD137基因的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域 (SEQID NO. 4);利用引物 P5(SEQID NO. 15)和 P6(SEQID NO. 16)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得 CD3 C 基 因的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域（SEQID NO. 5)，將獲得的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，然后與Mlul/Ndel 雙酶切后的慢病毒表達(dá)載體pWP化-GFP連接。
[0035] 步驟（2)中，對(duì)于合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和肥RlScFv的核巧酸序列的方法 沒(méi)有特別的限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可W通過(guò)全基因合成技術(shù)合成。
[0036] 具體地，得到序列正確的pWP化-肥RlScFv-CDS-CD 137-CD3 C的方法可W包括： 通過(guò)全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和肥RlScFv融合基因的核巧酸序列 (沈QID NO. 8)，克隆至載體pGSI中，得到pGSI-肥RlScFv ;然后將pGSI-肥RlScFv進(jìn)行MluI 單酶切，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI單酶切得到的重組質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C連接，經(jīng) 測(cè)序鑒定，得到序列正確的pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C。其中，大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚 的核巧酸序列如SEQID NO. 6所示，肥RlScFv核巧酸序列如SEQID NO. 7所示。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是由上述嵌合 抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞（即CAR肥Rl-NKT細(xì)胞）。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞的制備方法，該方法包括：包 裝攜帶pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的病毒濃 縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C。 W39] 對(duì)于包裝攜帶pWP化-肥RlScFv-CDS-CD 137-CD3 C的慢病毒的方法沒(méi)有特 別的限定，可W為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的各種方法，優(yōu)選情況下，將慢病毒表達(dá)載體 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C 與輔助質(zhì)粒（如 PSPAX2、pMD2. G)共轉(zhuǎn)染 293T 包裝細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染48-7化時(shí)收集病毒上清，離屯、、過(guò)濾，在濾液中添加5 XPEGeooo-NaCl進(jìn)行混勻，離 屯、后棄上清，沉淀用0-4°C預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。 W40] 本發(fā)明的方法中，還包括通過(guò)如下方法制備N(xiāo)KT細(xì)胞：
[0041] (1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行第一階 段培養(yǎng)；
[0042] (2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段培養(yǎng)。
[0043] 優(yōu)選情況下，所述第一階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于第一 NKT 細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介 素-2和白介素-15 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為 30-70ng/mU和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mU和/或所述白介素-15的濃度為 30-70ng/mL。
[0044] 優(yōu)選情況下，所述第二階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞培 養(yǎng)于第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2 ; 進(jìn)一步優(yōu)選地，第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。 W45] 對(duì)于MT細(xì)胞培養(yǎng)基沒(méi)有特別的限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種用于培養(yǎng)MT細(xì) 胞的培養(yǎng)基，例如可W為GT-T551培養(yǎng)基。
[0046] 在制備N(xiāo)KT細(xì)胞時(shí)，對(duì)于第一階段培養(yǎng)和第二階段培養(yǎng)的條件沒(méi)有特別的限定， 可W為本領(lǐng)域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中進(jìn) 行培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W對(duì)培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知， 在此不再寶述。
[0047] 本發(fā)明制備得到的NKT細(xì)胞中，CD3+細(xì)胞平均比率〉90%，CD3 +CD8+細(xì)胞占總CD3 + 細(xì)胞的平均比率〉7〇%仰3+〔056+細(xì)胞占總〔03+細(xì)胞的平均比率〉15%。
[0048] 對(duì)于感染NKT細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種方法，優(yōu)選情 況下，該方法包括：
[0049] (1)在病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細(xì)胞進(jìn)行第一階段感染培 養(yǎng)；
[0050] (2)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng) 的細(xì)胞進(jìn)行第二階段感染培養(yǎng)。
[0051] 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將MT細(xì)胞培養(yǎng)于第S MT細(xì) 胞培養(yǎng)液中，所述第S NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介 素-2 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第S NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0052] 優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì) 胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液的具體組成可參見(jiàn)前述相應(yīng)內(nèi) 容，在此不再寶述。
[0053] 在感染NKT細(xì)胞時(shí)，對(duì)于第一階段感染培養(yǎng)和第二階段感染培養(yǎng)的條件沒(méi)有特別 的限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng) 箱中進(jìn)行培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W對(duì)培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員 所公知，在此不再寶述。
[0054] 具體地，感染NKT細(xì)胞的方法包括：取IX IO7-SX IO7個(gè)NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng) 液，加入2-4血新鮮GT-l'SSl培養(yǎng)液，再加入200-400 y L病毒濃縮液、2-4 y L 1 X 10 Smg/ 血魚(yú)精蛋白和終濃度為300-70011/血的比-2，置于30-37°(：、飽和濕度為3-6%的〇)2培養(yǎng) 箱中感染12-1化后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培 養(yǎng)基，再加入終濃度為300-700U/mL的IL-2、終濃度為30-7化g/ml的CD3單克隆抗體和終 濃度為30-7化g/mL的白細(xì)胞介素15,于30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-1她，獲得嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞。 陽(yáng)化日]進(jìn)一步優(yōu)選地，感染NKT細(xì)胞的方法還包括：
[0056] (3)先在白介素 -2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì) 胞的密度為80-90%時(shí)，再在CD3單克隆抗體、白介素 -2和白介素 -15存在下，將細(xì)胞進(jìn)行 擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0057] 優(yōu)選情況下，所述體外誘導(dǎo)的實(shí)施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培 養(yǎng)于所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液和第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液的具體組成可參見(jiàn)前述相 應(yīng)內(nèi)容，在此不再寶述。
[0058] 具體地，感染NKT細(xì)胞的方法還包括：將第二階段感染培養(yǎng)后獲得的慢病毒感染 的NKT細(xì)胞用IL-2的終濃度為300-700U/mL的GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密 度為80-90%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔1.5-2.5天加入比-2的終濃度為300-70011/ mL、CD3單克隆抗體的終濃度為30-7化g/ml、白細(xì)胞介素-15的終濃度為30-7化g/mL的 新鮮GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并將細(xì)胞擴(kuò)增至總量為1 X 109-2X 109個(gè)細(xì)胞。經(jīng) 過(guò)本發(fā)明的慢病毒對(duì)祀向肥Rl抗原的嵌合抗原受體進(jìn)行NKT細(xì)胞感染，其感染效率高 達(dá)30 % -60 %，而獲得的CARHER1-NKT細(xì)胞，其CD3+CD56+細(xì)胞占總CD3 +細(xì)胞的比率在 15% -40%范圍之內(nèi)。
[0059] 嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗原受體 的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，嵌合抗原受 體前體蛋白由大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚、肥RlScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信 號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，蛋白質(zhì)翻譯后在細(xì)胞內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切除 信號(hào)膚后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細(xì)胞的細(xì)胞膜上。該嵌合 抗原受體的蛋白氨基酸序列對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO. 2所示。該嵌合抗原受體W 基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào) 傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。 W60] 本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的工程化肥Rl祀向性的NKT細(xì)胞。
[006U 本發(fā)明還提供了工程化肥Rl祀向性的MT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的 應(yīng)用。優(yōu)選情況下，腫瘤是指晚期肥Rl陽(yáng)性腎癌，尤其為復(fù)發(fā)難治的晚期肥Rl陽(yáng)性腎癌。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，晚期肥Rl陽(yáng)性腎癌是指由于內(nèi)科或外科等原因?qū)е聼o(wú)法 進(jìn)行手術(shù)切除的IV期或復(fù)發(fā)性腎癌，癥狀表現(xiàn)為：血尿，腰部腫塊和腰痛等。 W創(chuàng) 實(shí)施例
[0063] W下的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0064] W下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到，其中： 陽(yáng)0化]NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551購(gòu)自TaKaRa公司。
[0066] 淋己細(xì)胞分離液購(gòu)自T抓公司。
[0067] CD3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白（retronectin)均購(gòu)自TaKaRa公司。
[0068] 重組人蛋白干擾素-丫、重組人白介素2、重組人白介素15均購(gòu)自protech公司。
[0069] 總 RNA 提取試劑盒 RNAiSO Reagent、高保真 DNA 聚合酶（PHmeSTA民K HS DNA Polymerase)、T4DNA 連接酶購(gòu)自 TaKaRa 公司。
[0070] Reve;rtAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自 F'ermentas 公司。
[0071] Bgl II、EcoRI、MluI、BamHI、NdeI、EcoR V購(gòu)自化rmentas 公司。
[0072] 修飾酶 Klenow Rra卵ent 購(gòu)自 F'ermentas 公司。
[0073] 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天 根生化科技有限公司。
[0074] pWP化-GFP、PSPAX2、pMD2. G 均購(gòu)自 Addgene 公司。
[007引 pGSI購(gòu)自北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。
[0076] Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0077] Lipofectamine?2000Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自 Invitrogen 公司。
[0078] 293T包裝細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。
[0079] 陽(yáng)Geooo-NaCl中陽(yáng)G6000終濃度為25. 5質(zhì)量％，化Cl終濃度為1. 2M，PEG6000和 化Cl均購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。
[0080] 胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAA公司。 陽(yáng)0川高表達(dá)肥Rl的小鼠Renca腎癌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[00間 Cell Counting Kit-S(CCKS)試劑盒購(gòu)自北京沃比森科技有限公司。
[0083] 所有引物均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。
[0084] 實(shí)施例1NKT細(xì)胞的制備
[00化](1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋己細(xì)胞分離液，通過(guò)密度梯度離屯、方 法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs)。
[0086] 似PBMCs洗S次后，采用含有0. 6體積％的人自體血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基 GT-巧51調(diào)整細(xì)胞終濃度為2 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL ;將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過(guò)終濃度為10 y g/mL 的retronectin包被的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為500U/mL的重 組人白介素2、50ng/ml CD3單克隆抗體和50ng/mL的重組人白介素-15,在37°C、飽和濕度 為5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0087] (3)培養(yǎng)第4天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未包被的培養(yǎng)瓶中，每2天按照細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量加入 NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551，控制細(xì)胞濃度為1 X IO8個(gè)細(xì)胞/mU并加入終濃度為500U/ml的 重組人白介素2 ;培養(yǎng)至第12天，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。結(jié) 果見(jiàn)圖 1，其中 CD3+:95. 04% ;CD3+CD8+:90. 99% ;CD3+CD56+:24. 12% ;CD8+CD56+:24. 63%。
[0088] 實(shí)施例2慢病毒表達(dá)載體pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C的構(gòu)建
[0089] (1) NKT 細(xì)胞 cDNA 的制備
[0090] 離屯、沉淀實(shí)施例1培養(yǎng)得到的NKT細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提 取細(xì)胞的總RNA，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevedAid? First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得MT細(xì)胞cDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0091] 似慢病毒質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的制備
[0092] 設(shè)計(jì)并合成如下引物序列（其中，下劃線標(biāo)記為保護(hù)堿基，方框?yàn)槊盖形稽c(diǎn)）： [0093：
[0094： 陽(yáng)0巧：
[0096：
[0097：
[0098：
[0099： 陽(yáng) 100; 陽(yáng) 101; 陽(yáng) 102; 陽(yáng) 103; 陽(yáng)10屯 .
[0105] W步驟（1)中NKT細(xì)胞CDNA為模板，用引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)28化P 的CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核巧酸序列如SEQID NO. 3所示，兩端分別含有MluI和Bgl II 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)146bp的CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu) 域，核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；用 引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)359bp的CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核巧酸序列如SEQID NO. 5所示，兩端分別含有EcoRI和NdeI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。各步PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相 同，W擴(kuò)增CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件參照PrimeSTAR''" 服DNA Polymerase的說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)體系巧OyL)如下： 陽(yáng)106] 雙蒸水：32. SuL 陽(yáng) 107] 5 X 反應(yīng) buffer : IOy L 陽(yáng)10引 dNTP混合物（每種2. 5mM) :4 y L 陽(yáng) 109] P3 (IOmM)=Iy L 陽(yáng)110] P4 (IOmM)=Iy L
[0111] NKT 細(xì)胞 cDNA (200ng/ul) : 1 y L 陽(yáng) 11引 PnmeSTA民'1' HS DNA Polymerase :0. 5 Ji L
[0113] 將上述PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn) 行DNA片段回收。得到片段后分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒 回收備用。
[0114] 慢病毒表達(dá)載體pWP化-GFP用Mlul/Ndel雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn) 行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、 CD3C片段通過(guò)T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化ansl-TlPhage Resistant化學(xué)感受 態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)1化后挑取單克隆，37°C，250巧m培養(yǎng)1化后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì) 粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和NdeI雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見(jiàn)圖2,其中，Ml : DNA分子量標(biāo)記D15000 ;1泳道：質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的未酶切片段；2泳道：質(zhì)粒 pWP化-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（75化P) ;M2 :DNA分子量標(biāo)記D2000。將鑒定正確的質(zhì) 粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的 重組質(zhì)粒命名為pWP化-CD8-CD137-CD3C，其中，CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)的核巧酸序列如 SEQID NO. 3所示，CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，CD3 C的胞 內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的核巧酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0115] (3)慢病毒質(zhì)粒 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C 的制備
[0116] 全基因合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和肥RlScFv融合基因的核巧酸序列，序列 如SEQID NO. 8所示，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，其5'端含有MluI酶切位 點(diǎn)、kozak序列，3'端含有MluI酶切位點(diǎn)，將前述融合基因克隆在質(zhì)粒pGSI中，命名為 pGSI-HERlScFv。質(zhì)粒經(jīng)MluI單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收目的片段備用。
[0117] pWP)(L-CD8-CD137-CD3 C質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊 脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收有大 鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和肥RlScFv的DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行連接，具體方法見(jiàn)說(shuō)明 書(shū)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化ansl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)1化后挑取 單克隆，37°C，250巧m培養(yǎng)1化后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi) 切酶Mlul/Ndel雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，Ml :DNA分子量標(biāo)記D2000 ;1泳 道：質(zhì)粒pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（82化p，75化p);2泳道：質(zhì)粒 pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C的未酶切片段；M2 :DNA分子量標(biāo)記D15000。將鑒定正確 的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正 確的重組質(zhì)粒命名為pWP化-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示，其中 包括大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚（核巧酸序列如SEQID N0.6所示）、抗肥Rl單鏈抗體（核巧酸序 列如SEQID NO. 7所示）、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的 胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，其中，該嵌合抗原受體W基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3 C 的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示， 對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。
[0118] 實(shí)施例3嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞的制備
[0119] (1)慢病毒的包裝和濃縮
[0120] 用分光光度計(jì)分別測(cè)定慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWP化-肥RlScFv-CDS-CD 137-CD3 C 和輔助質(zhì)粒PSPAX2、PMD2.G的濃度，S種質(zhì)粒W 4:2:1的質(zhì)量比用 Lipofectamine?2000Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染 4化、7化時(shí)收集病毒上清于50血EP管中，4°C，2000g離屯、lOmin，轉(zhuǎn)移兩次得到的上清至新 EP管中，用4. 5 ym濾器過(guò)濾病毒上清進(jìn)濾的病毒上清與5XPEG6000-NaCl按照4:1的體 積比混勻，4°C靜置化，然后4°C，1000 Og離屯、20min，棄上清，沉淀用1血的4°C預(yù)冷的無(wú)菌 PBS溶解，即得嵌合抗原受體的病毒濃縮液，按每管100 y L進(jìn)行分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?陽(yáng)12U 按照上述方法，利用慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWP化-GFP和輔助質(zhì)粒PSPAX2、pMD2. G共轉(zhuǎn) 染293T包裝細(xì)胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達(dá)GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液。
[0122] (2)慢病毒感染NKT細(xì)胞及感染后細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
[0123] 取實(shí)施例1的在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的IX 10 7個(gè)NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入 2血新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551、200 y L步驟（1)得到的病毒濃縮液、2 y L 1 X 10 6mg/mL 魚(yú)精蛋白，終濃度為500U/mL的重組人白介素2,置于37°C、飽和濕度為5 %的C〇2培養(yǎng)箱中 感染12小時(shí)后，棄培養(yǎng)液。同時(shí)用表達(dá)GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液對(duì)NKT細(xì)胞進(jìn)行 同步感染（得到的NKT細(xì)胞稱(chēng)為CART-GFP細(xì)胞），用于計(jì)算該病毒的感染效率。將感染后 的細(xì)胞轉(zhuǎn)至未經(jīng)CD3和retronectin包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入20血的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基 GT-T551，再加入終濃度為500U/mL的重組人白介素2、終濃度為50ng/ml的CD3單克隆抗體 和終濃度為50ng/mL的重組人白介素15,于37°C、飽和濕度為5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1她， 得到的NKT細(xì)胞稱(chēng)為CARHER1-NKT細(xì)胞。用相同的方法制備CARHER1-T細(xì)胞燈細(xì)胞的制備 方'法參貝胥文南犬：Yajin邑 Zhan邑，et al. Autologous CIK Cell Immunotherapy in Patients with Renal Cell Carcinoma after Radical Nephrectomy. Clinical Study, 2013 中 2. 4 部分CIK細(xì)胞的制備方法）。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該病毒的感染效率，結(jié)果如圖5所示， CARHER1-NKT細(xì)胞的感染效率為46. 52%。 陽(yáng)124] (3)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CARHER1-NKT細(xì)胞群 陽(yáng)1巧]將上述培養(yǎng)后的NKT細(xì)胞用重組人白介素2的終濃度為500U/mL的NKT細(xì)胞培 養(yǎng)基GT-T551進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密度為85%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加 入重組人白介素2的終濃度為500U/mL、CD3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml、重組人白介 素15的終濃度為50ng/mL的新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到總 量為1. 5 X 1〇9個(gè)細(xì)胞左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定，細(xì)胞表型一般 達(dá)到CD3陽(yáng)性細(xì)胞比例> 90% ;CD3CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞比例〉70% ;CD3CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞比例 〉15%，結(jié)果見(jiàn)圖 6，CD3+:90. 83%;CD3+CD4+:14. 48%;CD3+CD8+:80. 90%;CD3+CD56+:：M. 48%; CD8+CD56+:：M. 25%。 陽(yáng)1 %] 實(shí)施例4CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)小鼠腎癌細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性分析 [0127] 取高表達(dá)肥Rl的小鼠腎癌細(xì)胞Renca接種于96孔板，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜后，分 別取實(shí)施例3中制備的CARHER1-NKT細(xì)胞、CARHER1-T細(xì)胞和實(shí)施例1中培養(yǎng)的NKT細(xì)胞， W效祀比（殺傷細(xì)胞：祀細(xì)胞）5:1，10:1，20:1，40:1與Renca細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)4h的共 培養(yǎng)后，每個(gè)孔加入10 y L的CCK8進(jìn)行染色。同時(shí)設(shè)置殺傷細(xì)胞對(duì)照組分別為實(shí)施例3中 制備的CAR肥Rl-NKT細(xì)胞、CAR肥Rl-T細(xì)胞和實(shí)施例1中培養(yǎng)的NKT細(xì)胞，并加入相同量的 CCK8進(jìn)行染色；W及設(shè)置祀細(xì)胞對(duì)照組為未加入免疫細(xì)胞殺傷處理的Renca細(xì)胞，并加入 相同量的CCK8進(jìn)行染色。酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)胞調(diào)亡情況進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞調(diào)亡的量根據(jù)下面的公式 計(jì)算：調(diào)亡率={1-[(實(shí)驗(yàn)組-殺傷細(xì)胞對(duì)照組-祀細(xì)胞對(duì)照組）/實(shí)驗(yàn)組]} X 100 %，該公 式中，殺傷細(xì)胞對(duì)照組為只有殺傷細(xì)胞而未加祀細(xì)胞測(cè)得的吸光值，祀細(xì)胞對(duì)照組為只有 祀細(xì)胞而未加殺傷細(xì)胞測(cè)得的吸光值；實(shí)驗(yàn)組為加入相對(duì)應(yīng)的效祀比（殺傷細(xì)胞：祀細(xì)胞） 的免疫細(xì)胞殺傷處理后測(cè)得的吸光值，見(jiàn)圖7。嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C 修飾的MT細(xì)胞對(duì)高表達(dá)肥Rl的腎癌細(xì)胞具有特異殺傷活性，且CAR肥Rl-NKT細(xì)胞的特異 殺傷活性明顯優(yōu)于CARHER1-T細(xì)胞和NKT細(xì)胞。 陽(yáng)12引實(shí)施例5CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)晚期肥Rl陽(yáng)性的腎癌患者的治療效果
[0129] 取 5X IO8個(gè)肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 C 修飾的 NKT 細(xì)胞（即 CAR 肥Rl-NKT 細(xì) 胞），經(jīng)過(guò)100mL生理鹽水稀釋后，連續(xù)S天靜脈回輸?shù)酵砥诜蔙l陽(yáng)性的腎癌患者（在利用 本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞進(jìn)行祀向免疫治療前，已經(jīng)過(guò)多次治療（如放療、化療及其他藥 物對(duì)癥治療等），但均無(wú)明顯療效）體內(nèi)，回輸后對(duì)患者的治療狀況進(jìn)行評(píng)估。
[0130] 圖8為CAR肥Rl-NKT細(xì)胞回輸?shù)酵砥诜蔙l陽(yáng)性的腎癌患者體內(nèi)后，不同時(shí)間段患 者的左腎病灶變化圖。如圖8所示，CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)晚期肥Rl陽(yáng)性的腎癌患者治療前 一個(gè)月內(nèi)，疾病處于快速進(jìn)展的狀態(tài)，患者腎病灶最長(zhǎng)徑由3cm增至9cm ;經(jīng)過(guò)CARHER1-NKT 細(xì)胞免疫治療后4周，患者腎病灶停止增大，穩(wěn)定于9cm ;治療后8周復(fù)查患者腫瘤大小 與經(jīng)過(guò)CARHER1-NKT細(xì)胞治療前相仿，腎病灶穩(wěn)定于9cm ;治療后12周，患者腎病灶略有 縮小，腫瘤病情仍處于持續(xù)穩(wěn)定狀態(tài)。說(shuō)明治療后3個(gè)月內(nèi)患者的左腎病灶大小穩(wěn)定， CARHER1-NKT細(xì)胞能夠遏制腎癌的快速進(jìn)展，對(duì)晚期肥Rl陽(yáng)性的腎癌患者有一定的治療效 果。 陽(yáng)13U 圖9為CARHER1-NKT細(xì)胞回輸?shù)酵砥诜蔙l陽(yáng)性的腎癌患者體內(nèi)后，不同時(shí)間段患 者的肝臟病灶變化圖。如圖9所示，CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)晚期肥Rl陽(yáng)性的腎癌患者治療前， 患者肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶多發(fā)，處于快速增大的狀態(tài)；經(jīng)過(guò)CARHER1-NKT細(xì)胞免疫治療后4周，患 者肝右葉病灶停止增大，肝左葉病灶略有縮?。恢委熀?周，患者病灶處于穩(wěn)定狀態(tài)；治療 后12周，患者肝左葉病灶進(jìn)一步縮小，肝右葉病灶大小較治療前相仿，病灶內(nèi)部壞死明顯。 說(shuō)明CARHER1-NKT細(xì)胞能夠有效遏制高負(fù)荷腎癌的快速進(jìn)展，讓患者獲得較長(zhǎng)時(shí)間的疾病 穩(wěn)定期，對(duì)晚期肥Rl陽(yáng)性的腎癌患者有一定的治療效果。
[0132] W上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可W對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，運(yùn) 些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0133] 另外需要說(shuō)明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可W通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可 能的組合方式不再另行說(shuō)明。
[0134] 此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可W進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為HERlScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ， 包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、HERlScFv、⑶8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、⑶137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié) 構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨 基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體的基因，優(yōu)選地，所述基因具有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. 含有權(quán)利要求2所述的基因的重組表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為慢病毒 表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述慢病毒表達(dá)載體為pWPXL-HERlScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。4. 一種工程化HERl靶向性的NKT細(xì)胞，其特征在于，所述NKT細(xì)胞是由權(quán)利要求1所 述的嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞。5. -種工程化HERl靶向性的NKT細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 包裝攜帶PWPXL-HERlScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的 病毒濃縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述方法還包括通過(guò)如下方法制備N(xiāo)KT細(xì)胞： (1) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行第一階段 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第一階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng) 液中，所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介 素-15 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述⑶3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/ mL ； (2) 在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段培養(yǎng)；優(yōu)選地，所 述第二階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液 中，所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第二NKT 細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法包括： (1) 在病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細(xì)胞進(jìn)行第一階段感染培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將NKT細(xì)胞培養(yǎng)于第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液 中，所述第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介素-2 ;進(jìn) 一步優(yōu)選地，第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL ; (2) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì) 胞進(jìn)行第二階段感染培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一 階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法還包括： (3) 先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的 密度為80-90%時(shí)，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述體外誘導(dǎo)的實(shí)施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所 述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞 培養(yǎng)液中。9. 權(quán)利要求5-8中任意一項(xiàng)所述方法制備得到的工程化HERl靶向性的NKT細(xì)胞。10.權(quán)利要求4或9所述的工程化HERl靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑 中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤是指晚期HERl陽(yáng)性腎癌。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105924526SQ201510580581
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2015年9月11日
【發(fā)明人】郭業(yè)磊, 豐愷超, 王瑤, 伍志強(qiáng), 代漢仁, 王曉慧, 韓為東
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院