一種聚蘋果酸的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聚蘋果酸的提取方法，將發(fā)酵培養(yǎng)聚蘋果酸和膜分離技術(shù)結(jié)合一起，在發(fā)酵進入穩(wěn)定期后，取樣進行膜過濾，透過的物質(zhì)進行分級提取，同時截留的大分子量的物質(zhì)以及菌體回流，繼續(xù)合成聚蘋果酸，摒棄了傳統(tǒng)的獨立發(fā)酵和提取過程，提高了工作效率，降低了提取工藝的成本，并且可以根據(jù)選擇不同截留分子量的超濾膜一次性提取不同分子量的聚蘋果酸，是一種高效制備不同分子量聚蘋果酸的有效方法。
【專利說明】
-種聚蘋果酸的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及高分子聚合物制備領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種聚蘋果酸的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 出芽短梗霉又名出芽巧霉，分類屬于半知菌綱，是一種具有酵母型和菌絲型形態(tài) 的多形真菌。出芽短梗霉在發(fā)酵過程中能夠合成聚蘋果酸、抗菌素、酶、胞外多聚糖及單細 胞蛋白等多種產(chǎn)物。有報道指出LIUSJ等利用出芽短梗霉發(fā)酵得到了聚蘋果酸，并發(fā)現(xiàn)聚蘋 果酸的產(chǎn)生是在對數(shù)期。
[0003] 聚蘋果酸是W蘋果酸為唯一單體合成的高分子聚合物，獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有 生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等優(yōu)良性質(zhì)。其次，它作為一種水溶性脂肪族聚 醋，具有高度水溶性、可化學(xué)衍生性。聚蘋果酸的獨特的性質(zhì)，使其在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治 理W及香精香料等許多方面有著廣闊的應(yīng)用前景。生物合成法合成聚蘋果酸主要是通過微 生物在發(fā)酵合成后，分泌到胞外，存在于發(fā)酵液中，再經(jīng)過后續(xù)的提取工藝即可得到聚蘋果 酸產(chǎn)品，和化學(xué)合成法相比，生物法具有成本低、反應(yīng)條件溫和、分子量相對較高等優(yōu)點，因 此生物法合成聚蘋果酸具有廣闊的發(fā)展前景。
[0004] 聚蘋果酸能夠應(yīng)用到藥物載體領(lǐng)域，其分子量是評價其作為藥物載體性能的重要 指標，能夠用作藥物載體的聚合物分子量范圍是1.5~200W)a，在該范圍內(nèi)，適當(dāng)提高聚蘋 果酸分子量，可W提高其載藥量，而當(dāng)分子量過高時，則難W穿過細胞膜而失去作為藥物載 體的性能。
[0005] 目前，有關(guān)微生物發(fā)酵合成聚蘋果酸的方法有多種，其中包括誘變獲得高產(chǎn)菌株、 優(yōu)化發(fā)酵條件W及培養(yǎng)基提高產(chǎn)量、復(fù)合添加生長因子提高產(chǎn)量等等，有關(guān)聚蘋果酸提取 方面的專利也有一些，包括有機溶劑提取法、全水化提取等等，實驗室曾經(jīng)采用改變發(fā)酵條 件或添加某一種生長因子的方法生產(chǎn)不同分子量的聚蘋果酸，該方法只能針對合成某一特 定分子量的聚蘋果酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種聚蘋果酸的提取方法，W解決現(xiàn)有技術(shù)中聚蘋果 酸分子量大，并且一次提取聚蘋果酸分子量單一的問題。
[0007] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是運樣實現(xiàn)的:一種聚蘋果酸的提取方法，包 括種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、分離提取及聚蘋果酸純度的測定，其中分離提取的方法如下：
[000引（1)當(dāng)種子液發(fā)酵培養(yǎng)48-6化時，開始將發(fā)酵液進行分離，在發(fā)酵罐出料口處安有 超濾膜，每隔8-12h從發(fā)酵罐出料口處膜過濾取出300~500ml的發(fā)酵液透過液，將菌體W及 大分子物質(zhì)截留在發(fā)酵罐中繼續(xù)反應(yīng)，同時往發(fā)酵罐中加入與透過液相同體積的發(fā)酵培養(yǎng) 基，獲得的發(fā)酵液依次經(jīng)過截留分子量為20KDa、10KDa、5邸a的超濾膜進行超濾；
[0009] (2)將步驟（1)中依次經(jīng)過=種超濾膜超濾獲得的=種濾液，分別進行活性炭脫 色，然后分別經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進行真空冷凍干燥，獲得=種分子量的聚蘋果酸。
[0010] 優(yōu)選，種子培養(yǎng)的方法為:將出芽短梗霉斜面活化4-化，然后用無菌水洗下抱子， 制備抱子懸液，將抱子懸液轉(zhuǎn)接到裝有種子培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-35°C，轉(zhuǎn) 速 160-200r/min，培養(yǎng) 30-6化。
[0011] 優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)的方法為:在無菌條件下，將種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐 中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速500-700r/min，罐壓為0.1 -0.3Mpa，通風(fēng)比1:6-1:4。
[0012] 優(yōu)選，聚蘋果酸純度的測定采用高效液相色譜法，首先稱取質(zhì)量為ml的聚蘋果酸， 配制成濃度為2g/L的溶液，然后用移液管取5血聚蘋果酸溶液加入等體積的Imol/L出S化溶 液，于ll〇°C條件下水解lOh，將聚蘋果酸完全水解為單體蘋果酸;然后用高效液相色譜法測 定水解前后蘋果酸的含量，結(jié)合蘋果酸的標準曲線得出聚蘋果酸中蘋果酸的含量，水解前 蘋果酸含量和水解后蘋果酸的含量之差為聚蘋果酸的含量m2,聚蘋果酸的純度為：
[0013] 優(yōu)選，種子培養(yǎng)基的組成為：薦糖80-120g/L，酵母膏2-4g/L，硫酸錠l-3g/L，下二 酸3-5邑/1，皿2口04 0.2-0.8邑/1，]\%504.7出0 0.05-0.15邑/1，2記04.7此0 0.03-0.06邑/1，其 余為蒸饋水。
[0014] 優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：薦糖100-300g/L，蛋白腺20-40g/L，K&P04 0.05- 0.13g/L，NaN〇3 3-5g/L，MgS〇4. 7出0 0.3-0.9g/L，KCl 0.2-0.8g/L，MnS〇4 0.01-0.08g/L， 其余為蒸饋水。
[0015] 優(yōu)選，種子培養(yǎng)基的組成為：薦糖lOOg/L，酵母膏3g/L，硫酸錠2g/L，下二酸4g/L， 1(出口04 0.5邑/1，1邑504?7出0 0.1邑/1，211504?7出0 0.05邑/1，其余為蒸饋水。
[0016] 優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：薦糖200g/L，蛋白腺30g/L，K此P〇4〇. Ig/L，化N03 4g/ ^1邑504*7出0 0.6邑/1，腺10.5邑/1，1記04 0.05邑/1，其余為蒸饋水。
[0017] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的一種聚蘋果酸提取方法，具有W下優(yōu)勢：
[0018] (1)本發(fā)明所述的一種聚蘋果酸的提取方法，將發(fā)酵培養(yǎng)聚蘋果酸和膜分離技術(shù) 巧妙的結(jié)合一起，在發(fā)酵進入穩(wěn)定期后，取樣進行膜過濾，透過的物質(zhì)分級提取，同時截留 的大分子量的物質(zhì)W及菌體回流，繼續(xù)合成聚蘋果酸，擬棄了傳統(tǒng)的獨立發(fā)酵和提取過程， 提高了工作效率，降低了提取工藝的成本。
[0019] (2)本發(fā)明所述的一種聚蘋果酸的提取方法，可W根據(jù)選擇不同截留分子量的超 濾膜一次性提取不同分子量的聚蘋果酸，是一種高效制備不同分子量聚蘋果酸的有效方 法。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容進一步說明。
[0021] 實施案例1:
[0022] (1)種子培養(yǎng)
[0023] 將出芽短梗霉斜面活化地，然后用無菌水洗下抱子，制備抱子懸液，將抱子懸液轉(zhuǎn) 接到含種子培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 °C，轉(zhuǎn)速16化/min，培養(yǎng)30h，其中種子培養(yǎng)基 組成為：薦糖80g/L，酵母膏2g/L，硫酸錠Ig/L，下二酸3g/L，K此P〇4 0.2g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.05g/L，aiS〇4 ? 7出0 0.03g/L，其余為蒸饋水；
[0024] (2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0025] 在無菌條件下，將步驟（1)中得到的種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速50化/min，罐壓0.1 Mpa，通風(fēng)比1:4，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為:薦糖lOOg/L， 蛋白腺20g/L，KH2P〇4 0.05g/L，NaN〇3 3g/L，MgS〇4.7H2〇 0.3g/L，KCl 0.2g/L，MnS〇4 O.Olg/L，其余為蒸饋水；
[00%] (3)發(fā)酵液分離、過濾
[0027]當(dāng)步驟(2)中種子液發(fā)酵培養(yǎng)48h時，開始將發(fā)酵液進行分離，在發(fā)酵罐出料口處 安裝有超濾膜，每隔化從發(fā)酵罐出料口處膜過濾取出300ml發(fā)酵液透過液，截留菌體W及大 分子物質(zhì)返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)反應(yīng)，同時往發(fā)酵罐中加入300ml發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得的發(fā)酵液 依次用截留分子量為20KDa、10KDa、5邸a的超濾膜進行超濾；
[00%] (4)聚蘋果酸的制備
[0029] 將步驟(3)中超濾獲得的=種分子量區(qū)間的濾液，分別進行活性炭脫色，然后分別 經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進行真空冷凍干燥；
[0030] (5)聚蘋果酸純度的測定
[0031 ]對步驟(4)中獲得的=種分子量的聚蘋果酸采用高效液相色譜法進行聚蘋果酸的 含量測定，測得聚蘋果酸的純度均達到80.44% W上。
[0032] 實施案例2:
[00削 （1)種子培養(yǎng)
[0034] 將出芽短梗霉斜面活化化，然后用無菌水洗下抱子，制備抱子懸液，將抱子懸液轉(zhuǎn) 接到含有種子培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35 °C，轉(zhuǎn)速20化/min，培養(yǎng)60h，其中種子培養(yǎng) 基組成為:薦糖120g/L，酵母膏4g/L，硫酸錠3g/L，下二酸5g/L，K出P〇4 0.8g/L，MgS〇4 ? 7此0 0.15g/L，aiS〇4 ? 7出0 0.06g/L，其余為蒸饋水；
[0035] (2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0036] 在無菌條件下，將步驟（1)中得到的種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速70化/min，罐壓0.3Mpa，通風(fēng)比1:6，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為:薦糖300g/L， 蛋白腺40g/L，KH2P〇4 0.13g/L，化N03 5g/L，MgS〇4.7H2〇 0.9g/L，KCl 0.8g/L，MnS〇4 0.08g/L，其余為蒸饋水；
[0037] (3)發(fā)酵液分離、過濾
[0038] 當(dāng)步驟(2)中種子液發(fā)酵培養(yǎng)54h時，開始將發(fā)酵液進行分離，在發(fā)酵罐出料口處 安裝有超濾膜，每隔IOh從發(fā)酵罐出料口處膜過濾取出400ml發(fā)酵液透過液，截留菌體W及 大分子物質(zhì)返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)反應(yīng)，同時往發(fā)酵罐中加入400ml發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得的發(fā)酵 液依次用截留分子量為20KDa、1 OKDa、5邸a的超濾膜進行超濾；
[0039] (4)聚蘋果酸的制備
[0040] 將步驟(3)中超濾獲得的=種分子量區(qū)間的濾液，分別進行活性炭脫色，然后經(jīng)過 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進行真空冷凍干燥；
[0041] (5)聚蘋果酸純度的測定
[0042] 對步驟(4)中獲得的=種分子量的聚蘋果酸采用高效液相色譜法進行聚蘋果酸的 含量測定，測得聚蘋果酸的純度均達到84.03% W上。
[0043] 實施案例3:
[0044] (I)種子培養(yǎng)
[0045] 將出芽短梗霉斜面活化4.化，然后用無菌水洗下抱子，制備抱子懸液，將抱子懸液 轉(zhuǎn)接到含有種子培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，轉(zhuǎn)速18化/min,培養(yǎng)40h，其中種子培 養(yǎng)基組成為：薦糖lOOg/L，酵母膏3g/L，硫酸錠2g/L，下二酸4g/L，K此P〇4 0.5g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.1邑/1，211504?7出0 0.05邑/1，其余為蒸饋水；
[0046] (2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0047] 在無菌條件下，將步驟（1)中得到的種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速60化/min，罐壓0.2Mpa，通風(fēng)比1:5，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為:薦糖200g/L， 蛋白腺30g/L，KH2P〇4 0.1g/L，NaN〇3 4g/L，MgS〇4*7出0 0.6g/L，KCl 0.5g/L，MnS〇4 0.05g/ L，其余為蒸饋水；
[004引（3)發(fā)酵液分離、過濾
[0049] 當(dāng)步驟(2)中種子液發(fā)酵培養(yǎng)60h時，開始將發(fā)酵液進行分離，在發(fā)酵罐出料口處 安裝有超濾膜，每隔12h從發(fā)酵罐出料口處膜過濾取出500ml發(fā)酵液透過液，截留菌體W及 大分子物質(zhì)返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)反應(yīng)，同時往發(fā)酵罐中加入500ml發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得的發(fā)酵 液依次用截留分子量為20KDa、1 OKDa、5邸a的超濾膜進行超濾；
[0050] (4)聚蘋果酸的制備
[0051] 將步驟(3)中超濾獲得的S種分子量區(qū)間的濾液，分別進行活性炭脫色，然后經(jīng)過 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進行真空冷凍干燥；
[0052] (5)聚蘋果酸純度的測定
[0053] 對步驟(4)中獲得的=種分子量的聚蘋果酸采用高效液相色譜法進行聚蘋果酸的 含量測定，測得聚蘋果酸的純度均達到83.95% W上。
[0化4] 實施案例4:
[00對 （1)種子培養(yǎng)
[0056] 將出芽短梗霉斜面活化地，然后用無菌水洗下抱子，制備抱子懸液，將抱子懸液轉(zhuǎn) 接到含有種子培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，轉(zhuǎn)速18化/min,培養(yǎng)40h，其中種子培養(yǎng) 基組成為:薦糖lOOg/L，酵母膏3g/L，硫酸錠2g/L，下二酸4g/L，K出P〇4 0.5g/L，MgS〇4 ? 7此0 0.1g/L，ZnS〇4 ? 7出0 0.05g/L，其余為蒸饋水；
[0057] (2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0058] 在無菌條件下，將步驟（1)中得到的種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速60化/min，罐壓0.2Mpa，通風(fēng)比1:5，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為:薦糖200g/L， 蛋白腺30g/L，KH2P〇4 0.1g/L，NaN〇3 4g/L，MgS〇4*7出0 0.6g/L，KCl 0.5g/L，MnS〇4 0.05g/ L，其余為蒸饋水；
[0059] (3)發(fā)酵液分離、過濾
[0060] 當(dāng)步驟(2)中種子液發(fā)酵培養(yǎng)60h時，開始將發(fā)酵液進行分離，在發(fā)酵罐出料口處 安裝有超濾膜，每隔IOh從發(fā)酵罐出料口處膜過濾取出400ml發(fā)酵液透過液，截留菌體W及 大分子物質(zhì)返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)反應(yīng)，同時往發(fā)酵罐中加入400ml發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得的發(fā)酵 液依次用截留分子量為20KDa、1 OKDa、5邸a的超濾膜進行超濾；
[0061] (4)聚蘋果酸的制備
[0062] 將步驟(3)中超濾獲得的=種分子量區(qū)間的濾液，分別進行活性炭脫色，然后經(jīng)過 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進行真空冷凍干燥；
[0063] (5)聚蘋果酸純度的測定
[0064] 對步驟(4)中獲得的=種分子量的聚蘋果酸采用高效液相色譜法進行聚蘋果酸的 含量測定，測得聚蘋果酸的純度均達到85.12% W上。
【主權(quán)項】
1. 一種聚蘋果酸的提取方法，包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、分離提取及聚蘋果酸純度的測 定，其特征在于分離提取的方法如下： (1) 當(dāng)種子液發(fā)酵培養(yǎng)48_60h時，開始將發(fā)酵液進行分尚，在發(fā)酵罐出料口處安有超濾 膜，每隔8_12h從發(fā)酵罐出料口處膜過濾取出300~500ml的發(fā)酵液透過液，將菌體以及大分 子物質(zhì)截留在發(fā)酵罐中繼續(xù)反應(yīng)，同時往發(fā)酵罐中加入與透過液相同體積的發(fā)酵培養(yǎng)基， 獲得的發(fā)酵液依次經(jīng)過截留分子量為20KDa、10KDa、5KDa的超濾膜進行超濾； (2) 將步驟（1)中依次經(jīng)過三種超濾膜超濾獲得的三種濾液，分別進行活性炭脫色，然 后分別經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進行真空冷凍干燥，獲得三種分子量的聚蘋果酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚蘋果酸的提取方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)的方法 為:將出芽短梗霉斜面活化4-5h，然后用無菌水洗下孢子，制備孢子懸液，將孢子懸液轉(zhuǎn)接 到裝有種子培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-35°C，轉(zhuǎn)速160-200r/min，培養(yǎng)30-60h。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚蘋果酸的提取方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的方法 為:在無菌條件下，將種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速 500-700r/min，罐壓為0 · 1-0 · 3Mpa，通風(fēng)比 1:6-1:4。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚蘋果酸的提取方法，其特征在于所述聚蘋果酸純度的 測定采用高效液相色譜法，首先稱取質(zhì)量為ml的聚蘋果酸，配制成濃度為2g/L的溶液，然后 用移液管取5mL聚蘋果酸溶液加入等體積的lmol/L H2S〇4溶液，于110°C條件下水解10h，將 聚蘋果酸完全水解為單體蘋果酸;然后用高效液相色譜法測定水解前后蘋果酸的含量，結(jié) 合蘋果酸的標準曲線得出聚蘋果酸中蘋果酸的含量，水解前蘋果酸含量和水解后蘋果酸的 含量之差為聚蘋果酸的含量m2,聚蘋果酸的純度為：5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種聚蘋果酸的提取方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的組 成為:蔗糖80-120g/L，酵母膏2-4g/L，硫酸銨 l-3g/L，丁二酸3-5g/L，KH2P〇4 0 · 2-0 · 8g/L， MgS〇4 · 7H20 0.05-0.15g/L，ZnS〇4 · 7Η200· 03-0.06g/L，其余為蒸餾水。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種聚蘋果酸的提取方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組 成為：蔗糖100-30(^/1，蛋白胨20-4(^/1，1〇12?040.05-0.138/1，恥腸3 3-58/1，]\%504.7!120 0.3-0.9g/L，KCl 0.2-〇.8g/L，MnS〇4 0.01_0.08g/L，其余為蒸餾水。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種聚蘋果酸的提取方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的組 成為：蔗糖l〇〇g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨2g/L，丁二酸4g/L，KH 2P〇4 0 · 5g/L，MgS〇4 · 7H20 0.1g/L，ZnS〇4 · 7H20 0.05g/L，其余為蒸餾水。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種聚蘋果酸的提取方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組 成為：蔗糖 200g/L，蛋白胨 30g/L，KH2P〇4 0.1g/L，NaN034g/L，MgS〇4 · 7H20 0.6g/L，KCl 0.5g/L，MnS〇4 0.05g/L，其余為蒸餾水。
【文檔編號】C12R1/645GK105925626SQ201610409712
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】殷海松, 喬長晟, 邊艷慧, 陳珊, 湯衛(wèi)華, 劉鵬, 張樂, 牛紅軍, 劉鑫龍, 張軼斌, 馬倩影, 劉晨
【申請人】天津市輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司