一種澳洲堅果總rna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種澳洲堅果總RNA的提取方法，該方法首先以澳洲堅果為供試材料，采集幼嫩葉片，通過預(yù)處理、抽提、沉淀、洗滌、去DNA及電泳檢測，獲得澳洲堅果總RNA。通過本發(fā)明的方法獲得的澳洲堅果總RNA純度高、完整性好，縮短了抽提時間，為澳洲堅果的基因克隆和分子水平遺傳分析奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種澳洲堅果總RNA的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及澳洲堅果生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及澳洲堅果總RNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]提取木本植物高質(zhì)量RNA是進(jìn)行其分子生物學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)。目前，常用提取植物總RNA的方法有:改良CTAB法、Trizol法和熱硼酸鹽法，這三種方法大多適用于草本植物，對于木本植物則適用性不大。澳洲堅果屬于山龍眼科，是一種原產(chǎn)于澳洲的樹生堅果，享有“干果之王”的美譽。但是澳洲堅果作為一種木本植物，其組織細(xì)胞內(nèi)成分復(fù)雜，含有較多的多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在對提取完整性好、純度高的RNA帶來困擾。而且，到目前為止本領(lǐng)域中尚未見澳洲堅果總RNA提取方法的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于為了解決探索澳洲堅果分子育種方面的關(guān)鍵技術(shù)問題，提供一種澳洲堅果總RNA提取方法。
[0004]本發(fā)明實現(xiàn)過程如下:
[0005]—種澳洲堅果總RNA的提取方法，該方法包括以下步驟:
[0006]I)稱取澳洲堅果葉片用液氮將其研磨成粉末后轉(zhuǎn)至離心管中，迅速加入預(yù)熱的2X CTAB于離心管中，在50?75°C的溫度條件下進(jìn)行水浴；
[0007]2)待步驟I)完成后，立即加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)于步驟I)的離心管中，在3?5°C、10000?12000印111的條件下離心12?18111；[11;
[0008]3)將步驟2)的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，重復(fù)步驟2);
[0009]4)將步驟3)的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入LiCl溶液，在-85?-70°C溫度條件下沉淀；
[0010]5)待步驟4)完成后，在3?5°C、10000?12000rpm的條件下離心25?40min，棄上清，用乙醇洗滌沉淀，吹干，加入30?50yL DEPC水溶解RNA;
[0011]6)待步驟5)完成后，進(jìn)行去DNA處理后保存。
[0012]其中，步驟I)中采用新鮮的、幼嫩的澳洲堅果葉片。步驟I)中2X CTAB的配方為:CTAB 2g、NaCl 8.18g、10mL IM Tris-HCl和4mL 0.5M EDTA配制10mL的2XCTAB。步驟I)中加入2XCTAB后先進(jìn)行劇烈振蕩25?40s再進(jìn)行水浴，水浴時間為5?7min。
[0013]步驟2)中加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)后，先進(jìn)行劇烈振蕩、開蓋放氣，然后再進(jìn)行離心處理。
[0014]步驟4)中LiCl的加入濃度為8.0mol/L，沉淀后LiCl的最終濃度為4.0mol/L，沉淀時間為0.9?1.2h。
[0015]步驟5)中用乙醇洗滌沉淀需要在冰上操作；先用500yL75 %乙醇洗滌沉淀I次、再用500yL無水乙醇洗滌沉淀I次;5)中溶解RNA的DEPC水濃度為0.1 %。
[0016]步驟6)中去DNA處理的反應(yīng)體系:5XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser2.0yL、總RNA 10yL，補(bǔ)足RNase Free H2O至20yL，反應(yīng)程序:42°C、2min。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明是在無核糖核酸酶的條件下進(jìn)行澳洲堅果總RNA的提取。在本領(lǐng)域中，植物組織總RNA的提取易受到多糖、多酚的干擾，而通過本發(fā)明的方法獲得的澳洲堅果總RNA純度高、完整性好，縮短抽提時間，為澳洲堅果的基因克隆和分子水平遺傳分析開辟一條新的道路。
【具體實施方式】
[0018]為加深對本發(fā)明理解，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，該實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。在本發(fā)明基礎(chǔ)上作出的修改或改進(jìn)，若對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，則屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。以下內(nèi)容中如涉及數(shù)量或比例，如無特別說明，均表示質(zhì)量單位或質(zhì)量比例。
[0019]實施例1:
[0020]該澳洲堅果總RNA的提取方法，采用澳洲堅果為試驗材料，通過適宜的預(yù)處理、抽提、沉淀、洗滌、去DNA及電泳檢測，獲得澳洲堅果總RNA。
[0021]步驟1、材料預(yù)處理
[0022]選取澳洲堅果品種Own ChoiCe(0.C)為供試材料，采取澳洲堅果幼嫩葉片和成熟葉片，經(jīng)滅菌ddH20洗滌后，用滅菌濾紙吸干，分別稱取葉片0.2g放入研缽中，用液氮將其研磨成粉末后轉(zhuǎn)至2.0mL的離心管中，迅速加入600yL、800yL、I OOOyL預(yù)熱的2 X CTAB于離心管中，立即劇烈振蕩30s，65°C水浴4min、6min、8min。
[0023]步驟2、抽提
[0024]立即加入1/5體積、1/2體積、等體積的氯仿/異戊醇(24:1)于步驟I)的離心管中，4°C、11 ,OOOrpm離心15min，需劇烈振蕩、開蓋放氣。
[0025]步驟3、將步驟2的上清液轉(zhuǎn)入新的2.0mL的離心管中重復(fù)步驟2。
[0026]步驟4、沉淀
[0027]將步驟3的上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL的離心管中，加入1/3體積、等體積的LiCl，_80°C冰箱中沉淀30111；[11、111、211。
[0028]步驟5、洗滌
[0029]待步驟4完成后，4 °C、11，OOOrpm離心30min，棄上清，用500yL75 %乙醇洗滌沉淀2次，或用500yL75%乙醇洗滌沉淀I次、再用500yL無水乙醇洗滌沉淀I次；吹干，加入30yLDEPC水溶解RNA。
[0030]步驟6、消除基因組DNA
[0031]待步驟5完成后，進(jìn)行去DNA處理，電泳檢測其完整性，并保存于-80°C備用。消除基因組DNA的體系為:5 XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser 2.0yL、總RNA 10yL，補(bǔ)足RNase Free H2O至20yL，反應(yīng)程序:42°C、2min。
[0032]實施例2:
[0033]該澳洲堅果總RNA的提取方法，采用澳洲堅果為試驗材料，通過適宜的預(yù)處理、抽提、沉淀、洗滌、去DNA及電泳檢測，獲得澳洲堅果總RNA。
[0034]步驟1、材料預(yù)處理
[0035]選取澳洲堅果品種Ikaika(333)為供試材料，采取新鮮的、幼嫩的澳洲堅果葉片，經(jīng)滅菌ddH20洗滌后，用滅菌濾紙吸干，分別稱取葉片0.2g放入研缽中，用液氮將其研磨成粉末后轉(zhuǎn)至2.0mL的離心管中，迅速加入600yL、800yL、100yL預(yù)熱的2 XCTAB于離心管中，立即劇烈振蕩358，60°(^水浴4111；[11、6111；[11、8111；[11。
[0036]步驟2、抽提
[0037]立即加入1/5體積、1/2體積、等體積的氯仿/異戊醇(24:1)于步驟I)的離心管中，5°C、12，OOOrpm離心12min，需劇烈振蕩、開蓋放氣。
[0038]步驟3、將步驟2的上清液轉(zhuǎn)入新的2.0mL的離心管中重復(fù)步驟2。
[0039]步驟4、沉淀
[0040]將步驟3的上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL的離心管中，加入1/3體積、等體積的LiCl，-85°C冰箱中沉淀30111；[11、111、211。
[0041 ]步驟5、洗滌
[0042]待步驟4完成后，5 °C、12，OOOrpm離心30min，棄上清，用500yL75 %乙醇洗滌沉淀2次，或用500yL75%乙醇洗滌沉淀I次、再用500yL無水乙醇洗滌沉淀I次；吹干，加入50yLDEPC水溶解RNA。
[0043]步驟6、消除基因組DNA
[0044]待步驟5完成后，進(jìn)行去DNA處理，電泳檢測其完整性，并保存于-80°C備用。消除基因組DNA的體系為:5 XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser 2.0yL、總RNA 10yL，補(bǔ)足RNase Free H2O至20yL，反應(yīng)程序:45°C、2min。
[0045]當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于包括以下步驟: 1)稱取澳洲堅果葉片用液氮將其研磨成粉末后轉(zhuǎn)至離心管中，迅速加入預(yù)熱的2XCTAB于離心管中，在50?75 °C的溫度條件下進(jìn)行水?。? 2)待步驟I)完成后，立即加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)于步驟I)的離心管中，在3?5°C、10000?12000印111的條件下離心12?18111；[11; 3)將步驟2)的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，重復(fù)步驟2); 4)將步驟3)的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入LiCl溶液，在-85?-70°C溫度條件下沉淀； 5)待步驟4)完成后，在3?5°C、10000?12000rpm的條件下離心25?40min，棄上清，用乙醇洗滌沉淀，吹干，加入30?50yL DEPC水溶解RNA； 6)待步驟5)完成后，進(jìn)行去DNA處理后保存。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于:步驟I)中采用新鮮的、幼嫩的澳洲堅果葉片。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于:步驟I)中2X CTAB的配方為:CTAB 2g、NaCl 8.18g、10mL IM Tris-HCl和4mL0.5M EDTA配制10mL的2XCTAB。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于:步驟I)中加入2XCTAB后先進(jìn)行劇烈振蕩25?40s再進(jìn)行水浴，水浴時間為5?7min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于:步驟2)中加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)后，先進(jìn)行劇烈振蕩、開蓋放氣，然后再進(jìn)行離心處理。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于:步驟4)中LiCl的加入濃度為8.0moI/L，沉淀后LiCl的最終濃度為4.0moI/L，沉淀時間為0.9?1.2h。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于:步驟5)中用乙醇洗滌沉淀需要在冰上操作；先用500yL75 %乙醇洗滌沉淀I次、再用500yL無水乙醇洗滌沉淀I次;5)中溶解RNA的DEPC水濃度為0.1 %。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的澳洲堅果總RNA的提取方法，其特征在于:步驟6)中去DNA處理的反應(yīng)體系:5XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser2.0yL、總RNA 1yLjhMRNaseFree H2O至20yL，反應(yīng)程序:42°C、2min。
【文檔編號】C12N15/10GK106047867SQ201610693058
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月20日
【發(fā)明人】劉榮, 范建新, 劉清國, 韓樹全, 王代谷
【申請人】貴州省亞熱帶作物研究所