一種香豆素衍生物、其制備方法以及由其制得的水凝膠的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種香豆素衍生物，具有式(Ⅰ)所示結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了所述香豆素衍生物的制備方法以及包含其作為聚合單體的水凝膠。本發(fā)明提供的香豆素衍生物通過結(jié)構(gòu)改性，可以方便地被引入水凝膠的共聚結(jié)構(gòu)中，反應(yīng)活性好，基團(tuán)的引入量可進(jìn)行控制，與其他改性劑共同引入水凝膠時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生影響，都具有良好的反應(yīng)活性，可共同作用改進(jìn)水凝膠性質(zhì)，同時(shí)，該香豆素衍生物制備過程簡便，成本較低。本發(fā)明提供的水凝膠由于引入了香豆素衍生物可具備優(yōu)異的自修復(fù)性能，在此基礎(chǔ)上還可進(jìn)一步改進(jìn)其生物相容性?；诖诵再|(zhì)，可廣泛用作生物相容性的自修復(fù)材料。
【專利說明】
-種香豆素衍生物、其制備方法從及由其制得的水凝膠
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體設(shè)及一種香豆素衍生物、其制備方法W及由 其制備的水凝膠。
【背景技術(shù)】
[0002] 自修復(fù)現(xiàn)象廣泛存在于生物體中，從血液凝固到皮膚修復(fù)。運(yùn)種特殊的生物過程 有助于生物體恢復(fù)完整性和延長壽命。模仿運(yùn)種自然的修復(fù)特性，損壞后具有自修復(fù)能力 的材料在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中是高度期望的。例如，如果應(yīng)用于組織工程中，自修復(fù)支架可W自 我修復(fù)在植入期間或之后可能發(fā)生的裂縫或損壞，因此使進(jìn)一步手術(shù)的需求最小化并且提 高治療的功效。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)基于各種策略開發(fā)了多種具有自我修復(fù)能力的智能材料，包括光敏 自修復(fù)聚合物等。香豆素類化合物是一類包括數(shù)百種衍生物的分子，一個(gè)世紀(jì)W前科學(xué)家 發(fā)現(xiàn)了其光敏性，目前已經(jīng)廣泛研究了其光裂解行為和可逆的光交聯(lián)性質(zhì)。香豆素部分在 UVA(長波UV)福照（320皿至400皿)下的[2+2]環(huán)加成形成環(huán)下燒環(huán)，另一方面，當(dāng)暴露于UVC (短波UV)福照(200nm至280nm)時(shí)，香豆素光二聚體發(fā)生裂解并釋放出原始的香豆素部分。 因此，含有香豆素結(jié)構(gòu)部分的聚合物在不同波長的UV光下展現(xiàn)出快速的光響應(yīng)和有效的光 可逆性?；谙愣顾仡惢衔锏男再|(zhì)，含有香豆素類化合物的聚合物也已有較多研究，并廣 泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括生物化學(xué)、有機(jī)-無機(jī)混合材料、液晶材料、光-電材料W及捕光/能 量轉(zhuǎn)移材料等等。
[0004] 近年來，也出現(xiàn)了對(duì)于含有香豆素類化合物的自修復(fù)材料的研究，如合成水凝膠 等。然而，由于通常需要使用如甲醒運(yùn)樣的交聯(lián)劑，運(yùn)些材料的細(xì)胞相容性存在缺陷。此外， 目前的合成水凝膠還具有細(xì)胞粘附性差的特點(diǎn)，對(duì)此，已有多項(xiàng)研究來改善水凝膠的生物 相容性和細(xì)胞粘附性，例如，使用聚陽離子如聚化-賴氨酸)來提高水凝膠的細(xì)胞相容性，又 如，引入4-氨基下基脈或脈基下胺W構(gòu)建具有與Ξ膚精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)結(jié)構(gòu) 相似的功能性兩性重復(fù)單元，該RGD存在于細(xì)胞外基質(zhì)化CM)中，含有RGD模擬單元的PAA水 凝膠顯示出了較好的細(xì)胞粘附性能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服現(xiàn)有水凝膠在自修復(fù)、生物相容性等方面存在的不足，本發(fā)明的一個(gè)目的 是提供一種香豆素衍生物，可用于改性水凝膠。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述香豆素衍生物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種聚酷胺水凝膠。
[000引本發(fā)明提供的香豆素衍生物具有式(I)所示結(jié)構(gòu)。
[0009]
[0010] 所述香豆素衍生物的制備方法為：^7-?基-4-甲基香豆素為起始原料，首先與2- 漠乙醇反應(yīng)得到式（Π )所示結(jié)構(gòu)的中間體，然后將所述中間體與丙締酷氯反應(yīng)即得，反應(yīng) 式為：
[0011]
[0012] 本發(fā)明提供的聚酷胺水凝膠為包括丙締酷胺類單體W及W上技術(shù)方案所述的香 豆素衍生物作為聚合單體共聚形成的聚合物;其中，所述香豆素衍生物按摩爾比為所述丙 締酷胺類單體的1~10%。
[0013] 優(yōu)選地，所述香豆素衍生物按摩爾比為所述丙締酷胺類單體的1~5 %。
[0014] 本發(fā)明所述的水凝膠中，所述丙締酷胺類單體可選自現(xiàn)有聚酷胺水凝膠常用的單 體種類，包括但不限于丙締酷胺、（甲基)丙締酷胺、二甲基丙締酷胺等。
[0015] 本發(fā)明所述的水凝膠中，由于添加了香豆素衍生物，可使水凝膠具備優(yōu)異的自修 復(fù)性能，在此基礎(chǔ)上，還可進(jìn)一步改進(jìn)所述水凝膠的性能，如生物相容性等，可添加帶有功 能基團(tuán)的酷胺或聚酷胺作為改性劑，從而改善水凝膠的生物相容性。
[0016] 本發(fā)明所述的水凝膠中，所述聚合單體還包括含脈基基團(tuán)的聚酷胺，其為W下單 體形成的共聚物：
[0017] 單體A:N，N'-亞甲基雙(丙締酷胺）；
[0018] 單體B:脈基下胺硫酸鹽；
[0019] 單體C: 1-(2-氨基乙基)-贓嗦；
[0020] 其中，所述單體A、單體B及單體C的摩爾比為3~20:1~10:1~5,所述共聚物的數(shù) 均分子量為1000~1800。
[0021] 如圖3所示，含脈基基團(tuán)的聚酷胺的片段端基含有雙鍵，并與其它部分(R2)形成超 枝化共聚物，其中m:n約為3~8:4~10。本發(fā)明所述的水凝膠中，所述含脈基基團(tuán)的聚酷胺 按摩爾比為所述丙締酷胺類單體的1~20%。
[0022] 優(yōu)選地，所述含脈基基團(tuán)的聚酷胺按摩爾比為所述丙締酷胺類單體的2~16%。
[0023] 本發(fā)明所述的水凝膠中，所述單體A、單體B及單體C的摩爾比還可W為12~16:4~ 8:2~5。
[0024] 本發(fā)明所述的水凝膠中，所述含脈基基團(tuán)的聚酷胺為將單體A、單體B及單體C在氨 氧化裡單水合物的催化下通過共聚反應(yīng)制得。所述共聚反應(yīng)可采用常規(guī)的共聚反應(yīng)設(shè)備或 工藝，也可添加可選的助劑、溶劑、引發(fā)劑等物質(zhì)。
[0025] 本發(fā)明提供的香豆素衍生物通過結(jié)構(gòu)改性，可W方便地被引入水凝膠的共聚結(jié)構(gòu) 中，反應(yīng)活性好，基團(tuán)的引入量可進(jìn)行控制。與其他改性劑共同引入水凝膠時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生影 響，都具有良好的反應(yīng)活性，可共同作用改進(jìn)水凝膠性質(zhì)，同時(shí)，該香豆素衍生物制備過程 簡便，成本較低。
[0026] 本發(fā)明提供的水凝膠由于引入了香豆素衍生物可具備優(yōu)異的自修復(fù)性能，在此基 礎(chǔ)上還可進(jìn)一步改進(jìn)其生物相容性。基于此性質(zhì)，可廣泛用作生物相容性的自修復(fù)材料。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明制備例1的合成路線圖。
[00%]圖2為本發(fā)明制備例1制得的香豆素衍生物(本文簡稱CMA)的1H NMR譜圖。
[0029] 圖3為本發(fā)明所述含脈基基團(tuán)的聚酷胺(本文簡稱PAA交聯(lián)劑)的合成路線示意圖。
[0030] 圖4為本發(fā)明制備例2制得的PAA交聯(lián)劑的1H NMR譜圖。
[0031] 圖5為本發(fā)明測(cè)試?yán)?的水凝膠自修復(fù)過程的巧光共聚焦顯微鏡圖像。
[0032] 圖6為本發(fā)明測(cè)試?yán)?的拉伸試驗(yàn)相關(guān)圖，其中，（a)圖為水凝膠切割、接觸圖像； (b)-(d)圖分別為拉伸試驗(yàn)所得的斷裂延長率、拉伸應(yīng)力、拉伸模量結(jié)果圖表。
[0033] 圖7為本發(fā)明測(cè)試?yán)?的拉伸試驗(yàn)測(cè)試過程圖像。
[0034] 圖8為本發(fā)明測(cè)試?yán)?的光可逆測(cè)試在不同條件下的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖，其中，曲線 1的樣品為水凝膠切割后修復(fù)30分鐘，曲線2的樣品為水凝膠切割后修復(fù)30分鐘，然后進(jìn)一 步暴露于254nm波長的UV光10分鐘，曲線3的樣品為水凝膠切割后修復(fù)30分鐘，然后進(jìn)一步 暴露于254nm波長的UV光30分鐘。
[0035] 圖9為本發(fā)明測(cè)試?yán)?所得的含有或不含CMA的水凝膠的溶脹比測(cè)試結(jié)果圖表。
[0036] 圖10為本發(fā)明測(cè)試?yán)?培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞后的活細(xì)胞/死細(xì)胞測(cè)試共聚焦顯微鏡圖 像。
[0037] 圖11為本發(fā)明測(cè)試?yán)?水凝膠上培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像。
[003引圖12為本發(fā)明測(cè)試?yán)?的MTTii試歸一化結(jié)果圖表。
[0039] 圖13為本發(fā)明測(cè)試?yán)?的BMSCs中的成骨基因表達(dá)量圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041] 所用材料2-漠-2-甲基丙酷基漠、丙締酷氯、7-徑基-4-甲基香豆素、2-漠乙醇、Ξ 乙胺、碳酸鐘、乙醇、乙酸、無水硫酸鋼、二氯甲燒、氯化鋼、DMS0、丙締酷胺、N，N'-亞甲基雙 (丙締酷胺KMBA)、脈基下胺硫酸鹽、1-(2-氨基乙基)-贓嗦(AEPZ)、N，N，N'，N'-四甲基乙二 胺(TEMED)、過硫酸錠(APS)和氨氧化裡化iOH)均購自Sigma-Al化ich公司，未進(jìn)行進(jìn)一步純 化。PBS lx粉末，Hoechst 33：M2，B切DIPY夠化 phallacidin，T〇-Pr〇-3艦化物和Live- Cell染色盒均購自InvitrogenD3-(4,5-二甲基嚷挫基-2)-2、5-二苯基四挫基漠化物(MTT) 細(xì)胞活力檢測(cè)盒是購自Biotium Inc.化ayward，CA)。0. C. T.化合物購自VWR FITC巧光染料 并且RT-PCR試劑盒購自Thermo Scientific。
[0042] UV 照射功率為 16mw/cm2。
[0043] IH NMR光譜使用Advance 300MHz光譜儀，W每百萬份(ppm)報(bào)告化學(xué)位移(δ)。
[0044] 制備例1端締基香豆素的制備
[0045] 如圖1所示合成路線。
[0046] 1、將7-徑基-4-甲基香豆素（5.0克，25.7毫摩爾）、2-漠乙醇（5.0克，40.0毫摩爾） 和碳酸鐘(3.0克，21.7毫摩爾）的混合物在50毫升乙醇中回流下加熱20小時(shí)。然后將混合物 冷卻至室溫，用乙酸和水稀釋。分離混合物，水層用乙酸萃取。將合并的有機(jī)層用硫酸儀干 燥，接著除去溶劑。得到的固體是足夠純的，無需進(jìn)一步純化即可用于下一步驟中。
[0047] 2、向Ξ乙胺(5.0克，6.89毫升，49.4毫摩爾）和步驟1所得的7-(2-?基乙氧基)-4- 甲基香豆素（5.0克，20.14毫摩爾）在80毫升二氯甲燒中的溶液中滴加丙締酷氯（5.0克， 4.48毫升，55.24毫摩爾）。在室溫下攬拌12小時(shí)后，加入水。分離混合物，用二氯甲燒萃取水 層。用氯化鋼水溶液洗涂合并的有機(jī)層，隨后用無水硫酸鋼干燥并除去溶劑W得到固體。將 粗產(chǎn)物從乙醇中重結(jié)晶，得到無色粉狀晶體。
[004引 1H NMR(卵m，CDC13)δ :，2.44(C出，S，3H)，4.28(C出-0-芳香性，t，2He)，4.55 (C出- 0C0,t，2Hf ),6.10(乙締，dd，lHh) ,6.28(芳香性，s，ma) ,6.38(乙締，dd，lHg) ,6.68(乙締， (1(1，1化），7.14(0-〔6出-，(1，1化），7.17(0-〔6出-，3，1肋），7.64(0-〔6出-，(1，1化）。參見圖2。
[0049] 制備例2PAA交聯(lián)劑的制備
[0050] 如圖3所示合成路線。
[0化1] 將MBA(234毫克，1.52毫摩爾）、脈基下胺硫酸鹽（138毫克，0.6毫摩爾）和AEPZ(52 毫克，0.4毫摩爾）溶解于水/甲醇(體積/體積=5/1，總共5毫升）中，同時(shí)攬拌。當(dāng)溶液澄清 時(shí)，向溶液添加 LiOH ·此0(25.2毫克，0.6毫摩爾）。然后將混合物緩慢攬拌，并讓其在45°C 下黑暗中反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)后，將溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)。通過冷凍干燥回收最終將產(chǎn)物并 將其儲(chǔ)存在-20°C的冰箱中備用。該產(chǎn)物的數(shù)均分子量為1250。
[0052] 1H NMR(卵m):S，1.5化 14+刖3，111，4證），2.0-3.0化2+冊(cè)+職+朋+刖0+化1+化2，111， 8址），3.17化15八，化扣，4.53曰11(14.62化1+冊(cè)，3，（化+2化），5.77(乙締，(1(1，2化8)，6.21(乙 締，dd，2H17) ,6.225(乙締，dd，2H16)。參見圖4。
[0053] 制備例3水凝膠的制備
[0054] 在1.0毫升的0150中添加4?5(0.20毫摩爾）和了6]\^0，再添加丙締酷胺（6.2毫摩 爾）、7-(2-甲基丙締酷氧基乙氧基)-4-甲基香豆素(0.31毫摩爾）和PAA交聯(lián)劑(0.97毫摩 爾），在65 °C下使之共聚。通過用大量DMS0洗涂，隨后暴露于水中幾小時(shí)，然后重復(fù)用水洗涂 得到純化后的凝膠狀物質(zhì)。
[0055] 也可按照表1的單體用量制備水凝膠。
[0056] 表1.
[0化7]
[0化引測(cè)試?yán)?水凝膠的自修復(fù)能力
[0059] (1)樣品制備
[0060] 取制備例3所述過程制備所得的水凝膠置于兩個(gè)玻璃蓋玻片(25毫米X25毫米)之 間用于自修復(fù)能力評(píng)價(jià)，用滅菌的PBS溶液徹底洗涂凝膠W除去化學(xué)殘余物。
[0061 ] (2)自修復(fù)水凝膠的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像
[0062] 將前述制備的水凝膠樣品用FITC巧光染料染色，然后用刀片經(jīng)過水凝膠的整個(gè)厚 度劃開一個(gè)裂縫，使經(jīng)平分的樣品在其切割截面接觸并且暴露于365nm的UV光照射30分鐘 W進(jìn)行自修復(fù)，通過共聚焦激光掃描顯微鏡(化SM)(Olympus FV1000 Japan)記錄UV修復(fù)過 程(λ = 365ηπι)，巧光圖像（圖5)顯示，在UV處理30分鐘后發(fā)生切割表面的自動(dòng)融合，表明水 凝膠的良好自修復(fù)能力。
[0063] (3)拉伸試驗(yàn)
[0064] 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)水凝膠的修復(fù)能力，進(jìn)行下述拉伸試驗(yàn)。首先通過刀片切割20毫 米長、4毫米寬和2毫米厚的水凝膠樣品，將樣品切割成兩半，然后使兩半材料在無壓力下保 持對(duì)齊和親密接觸（圖6的(a)圖），然后分別暴露于365nm的UV光照射10分鐘、20分鐘、30分 鐘和60分鐘，通過照射自修復(fù)過程之后，將連接棒固定到INST民ON⑥材料拉力機(jī)上，如 圖7所示，測(cè)試速率設(shè)為0.1毫米每分鐘，通過IN ST民ON⑧軟件記錄應(yīng)力-應(yīng)變曲線。在恒 定的溫度和室內(nèi)濕度下進(jìn)行所有拉伸測(cè)試，每組樣品個(gè)數(shù)為3個(gè)(n = 3)，同時(shí)測(cè)試無切割的 初始水凝膠樣品作為對(duì)照，W顯示水凝膠的修復(fù)效率。
[0065] 照射60分鐘的凝膠的拉伸強(qiáng)度(200.2±24.7kPa)是僅照射10分鐘的凝膠(44.9± 17.2kPa)的近乎5倍，表明香豆素基團(tuán)的引入改善了凝膠的自修復(fù)性能（圖6的（C)圖）。而 且，照射時(shí)間的增加還顯著改善了拉伸模量W及斷裂延長率。照射10分鐘、20分鐘、30分鐘 和60分鐘的凝膠分別表現(xiàn)出21.6%±7.2%、43.4%±5.2%、67.7%±10.4%和96.2%± 9.5%的斷裂延長率（圖6的（b)圖）。此外，還可W看出，60分鐘的修復(fù)使切割樣品恢復(fù)了 88.6%的起始拉伸模量(圖6的(d)圖），表明水凝膠的優(yōu)異修復(fù)效率。
[0066] (4)光可逆測(cè)試
[0067] 為了驗(yàn)證水凝膠的光可逆性質(zhì)，向機(jī)械切分且隨后修復(fù)的樣品施加另一波長的UV 光(λ<280ηπι)。具體而言，將20毫米長、4毫米寬和2毫米厚的水凝膠樣品切成兩半，隨后使其 修復(fù)30分鐘，使修復(fù)樣品分別進(jìn)一步暴露于254nm波長的UV光10分鐘和20分鐘，再次用 INST民ON⑩測(cè)試儀按照前述方法記錄其拉伸強(qiáng)度和斷裂延長率。
[0068] 圖8顯示隨著暴露時(shí)間增加，凝膠強(qiáng)度提高幅度降低，其可能是由于形成的環(huán)下燒 環(huán)在254nm的UV福照下的光裂解造成的。
[0069] 測(cè)試?yán)?水凝膠的溶脹試驗(yàn)
[0070] 在24孔板中制備了如前所述的水凝膠，然后稱重并浸入室溫下含PBS緩沖液(抑= 7.4)的小瓶中。在設(shè)計(jì)的時(shí)間間隔，該水凝膠從溶液中取出，拭去任何的可見表面水分后稱 重，使用下式計(jì)算吸收的緩沖液的百分量：
[0071] 水（％) = (Wt-W0)/W0X100
[0072] 其中，Wt是在稱重時(shí)間的水凝膠重量，WO是初始稱量的水凝膠重量。為了減少誤 差，所有溶脹比率結(jié)果均得自Ξ份樣品。
[0073] 如圖9所示，含或不含CMA的水凝膠的溶脹比率均隨時(shí)間而逐漸增大。含有CMA的水 凝膠具有比不含CMA的凝膠稍低的溶脹比率，其可能源于交聯(lián)密度的改變，但相差不大，說 明CM沒有降低水凝膠的溶脹性質(zhì)。
[0074] 測(cè)試?yán)?水凝膠的體外生物相容性測(cè)試
[0075] (1)在水凝膠上的細(xì)胞培養(yǎng)和生長
[0076] 取制備例3所述過程制備所得的水凝膠置于玻璃蓋玻片(直徑：10毫米），將玻璃蓋 玻片置于PBS溶液中2小時(shí)，W除去化學(xué)殘余物，再將玻璃蓋玻片取出并在生物安全的罩中 在UV光下照射30分鐘，最后，將涂覆水凝膠的玻璃蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿（35毫米X 10毫 米）中，用補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS，GIBC0)、1.0X10抓L-l的青霉素(Sigma)和100毫克/升 鏈霉素（Sigma)的Du化ecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，GIBCO)在37°C在5%C02下 培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs，來自ATCC，USA)。根據(jù)來自Invitrogen Inc.，Canada的方法 進(jìn)行活/死染色W評(píng)價(jià)水凝膠，使用水凝膠進(jìn)行BMSCs的培養(yǎng)并且染色24小時(shí)和72小時(shí)，通 過化SM拍攝圖像。并W不含PAA的水凝膠作為對(duì)照。
[0077] 在培養(yǎng)24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞附著至水凝膠。培養(yǎng)72小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)了一些死細(xì) 胞，但是其大多數(shù)仍然是活的，如圖10所示（紅色為死細(xì)胞，綠色為活細(xì)胞，100微米比例 尺），BMSCs的數(shù)目在含有PAA交聯(lián)劑的水凝膠中顯著增加，然而，在對(duì)照組中觀察到顯著低 的細(xì)胞密度。結(jié)果表明，PAA交聯(lián)劑可能改善細(xì)胞對(duì)于水凝膠的附著。
[0078] 如圖11所示（200微米比例尺），細(xì)胞在水凝膠上生長24小時(shí)后觀察到細(xì)胞分布圖 案，圖像表明，細(xì)胞傾向于在一定的方向上排列。
[0079] (2)MTT 試驗(yàn)
[0080] 使用BMSCs在37°C下在96孔培養(yǎng)板中通過MTT試驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞活力。細(xì)胞先W每孔1 X104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔培養(yǎng)板中的水凝膠中，每兩天更換培養(yǎng)基，在指定的時(shí)間 點(diǎn)，將10微升MTT試劑添加至每個(gè)孔中并進(jìn)一步溫育4小時(shí)，然后從孔中除去溶液和將甲臘 晶體溶解于200微升DMS0中，記錄570皿處的吸光度(n = 3)。作為對(duì)照組，還評(píng)價(jià)了不含細(xì)胞 的水凝膠。將接種的細(xì)胞活力歸一化為100%，如圖12所示，本發(fā)明提供的水凝膠在培養(yǎng)24 和72小時(shí)后具有高的細(xì)胞活力。
[0081 ] (3)定量實(shí)時(shí)PCR分析
[0082]將100毫升培養(yǎng)基中的密度為每毫升2 X106個(gè)細(xì)胞的小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs) 接種到水凝膠上30分鐘，然后，向培養(yǎng)皿添加2毫升培養(yǎng)基。2天后，將封裝有細(xì)胞的水凝膠 轉(zhuǎn)移至含有成骨化學(xué)補(bǔ)充劑的FB巧h充的DMEM:50毫克/1111的心抗壞血酸-1-憐酸（Sigma)， lOmM的b-甘油憐酸醋（Sigma)和lOOnM地塞米松(Sigma)。將含有細(xì)胞的水凝膠溫育不同時(shí) 間，每兩天更換成骨培養(yǎng)基，在預(yù)定的時(shí)間間隔，用未附著的細(xì)胞抽吸介質(zhì)并且用DPBS洗涂 孔，然后，用液氮處理凝膠上的細(xì)胞并打碎，為了驗(yàn)證所有樣品中的成骨分化的基因表達(dá)， 總的RNA分離和cDNA合成使用TRIzo巧日Oligo dT(Thermo Scientific,USA)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法 進(jìn)行。通過SYB邸Green分析儀(Applied Biosystems ,USA)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)。擴(kuò)增 條件如下：在95°C保持10分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒，在60°C下1分鐘。使用 St邱OnePlus?實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)進(jìn)行熱循環(huán)和巧光檢測(cè)。通過Δ Ct 法測(cè)定了相對(duì)于GAPDH的mRNA的表達(dá)水平?；蛞餅?形式5 ' -3 '）：
[0083] SEQ ID N0：1
[0084] ALP-F：CTC CAA AAG CTC AAC ACC AAT G；
[0085] SEQ ID NO :2
[0086] ALP-R:ATT TGT CCA TCT CCA GCC G；
[0087] SEQ ID NO：3
[0088] BSP-F:CCA CAC TTT CCA CAC TCT CG；
[0089] SEQ ID NO :4
[0090] BSP-R:CGT CGC TTT CCT TCA CTT TTG；
[0091] 沈Q ID NO :5
[0092] COL I-F:AAC AGT CGC TTC ACC TAC AG；
[0093] SEQ ID NO：6
[0094] COL I-R:AAT GTC CAA GGG AGC CAC；
[0095] SEQ ID NO :7
[0096] 〇PN-F:CTA CGA CCA TGA GAT TGG CAG；
[0097] SEQ ID NO：8
[009引 0PN-R:CAT GTG GCT ATA GGA TCT GGG；
[0099] SEQ ID NO：9
[0100] OCN:F-ATTGTGACGAGCTAGCGGAC；
[0101] 沈Q ID NO :10
[0102] OCN:R-TCGAGTCCTGGAGAGTAGCC；
[0103] SEQ ID NO： 11
[0104] GAPDH-F:AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG；
[0105] SEQ ID NO： 12
[0106] GAPDH-R:TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA.
[0107] 如圖13所示（數(shù)值表示為平均值±SE(n = 3))，在BMSCs中的成骨基因（ALP、BSP、 O)L、0CN和0PN)表達(dá)在培養(yǎng)14天之后顯著上升。說明水凝膠具備良好的細(xì)胞附著性，從而具 備良好的生物相容性。
[0108] 骨誕蛋白（BSP)是一種重要的蛋白骨通用分化物，其可W表達(dá)為成骨細(xì)胞或分化 的干細(xì)胞。在第2天，發(fā)現(xiàn)BSP基因的表達(dá)增加并在第7天和第14天觀察到相同的趨勢(shì)。膠原 (C0L)是骨分化后期的關(guān)鍵標(biāo)志物，也發(fā)現(xiàn)C0L的表達(dá)水平隨時(shí)間增加。骨橋蛋白（0PN)是另 一種重要的與成骨相關(guān)的人類基因，起到骨的有機(jī)連接組件的作用，骨橋蛋白的表達(dá)相對(duì) 低于BSP和C0L，但0PN的表達(dá)在成骨細(xì)胞分化期間在7天和14天之后仍然具有正向趨勢(shì)。堿 性憐酸酶(ALP)是存在于人體內(nèi)的所有組織中的酶，其能夠從核巧酸或蛋白質(zhì)除去憐酸基 團(tuán)，ALP可W是用于骨代謝的標(biāo)記物，如果觀察到高水平的ALP，一般認(rèn)為已形成活性骨組 織，當(dāng)在水凝膠上培養(yǎng)BMSCs時(shí)進(jìn)行ALP表達(dá)的評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，水凝膠在兩周中均具有高的 ALP表達(dá)水平。骨巧素(OCN)是在骨的成骨細(xì)胞分化后期的關(guān)鍵標(biāo)志物，在兩周后OCN具有顯 著更高的表達(dá)。
[0109] 本發(fā)明提供的水凝膠具備良好的自修復(fù)能力和生物相容性。香豆素衍生物的引入 可使水凝膠顯示出明顯的自修復(fù)性質(zhì)，修復(fù)后的長時(shí)間內(nèi)還具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、應(yīng)力強(qiáng) 度W及大于96%的斷裂延長率。通過引入含有脈基基團(tuán)的PAA交聯(lián)劑，增強(qiáng)了細(xì)胞附著性 質(zhì)，從而增強(qiáng)了水凝膠的生物相容性?；谒z的性質(zhì)，可廣泛用作生物相容性的自修復(fù) 材料。
[0110] 除非特別限定，本發(fā)明所用術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。
[0111] 本發(fā)明所描述的實(shí)施方式僅出于示例性目的，并非用W限制本發(fā)明的保護(hù)范圍， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出各種其他替換、改變和改進(jìn)，因而，本發(fā)明不限于 上述實(shí)施方式，而僅由權(quán)利要求限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種香豆素衍生物，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)。2. 權(quán)利要求1所述香豆素衍生物的制備方法，其特征在于，從7-徑基-4-甲基香豆素為 起始原料，首先與2-漠乙醇反應(yīng)得到式（Π )所示結(jié)構(gòu)的中間體，然后將所述中間體與丙締 酷氯反應(yīng)即得，反應(yīng)式為：3. -種聚酷胺水凝膠，其特征在于，所述水凝膠為包括丙締酷胺類單體W及權(quán)利要求1 所述的香豆素衍生物作為聚合單體共聚形成的聚合物;其中，所述香豆素衍生物按摩爾比 為所述丙締酷胺類單體的1~10%。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的水凝膠，其特征在于，所述香豆素衍生物按摩爾比為所述丙締 酷胺類單體的1~5 %。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的水凝膠，其特征在于，所述丙締酷胺類單體選自丙締酷胺、 (甲基)丙締酷胺、二甲基丙締酷胺中的一種或多種。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的水凝膠，其特征在于，所述聚合單體還包括含脈基基團(tuán)的 聚酷胺，其為W下單體形成的共聚物： 單體A:N，N'-亞甲基雙(丙締酷胺）； 單體B:脈基下胺硫酸鹽； 單體C: 1-(2-氨基乙基)-贓嗦； 其中，所述單體A、單體B及單體C的摩爾比為3~20:1~10:1~5,所述共聚物的數(shù)均分 子量為1000~1800。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的水凝膠，其特征在于，所述含脈基基團(tuán)的聚酷胺按摩爾比為所 述丙締酷胺類單體的1~20%。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的水凝膠，其特征在于，所述含脈基基團(tuán)的聚酷胺按摩爾比為所 述丙締酷胺類單體的2~16%。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的水凝膠，其特征在于，所述單體A、單體B及單體C的摩爾比為12 ~16:4~8:2~5〇10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的水凝膠，其特征在于，所述含脈基基團(tuán)的聚酷胺為將單體A、 單體B及單體C在氨氧化裡單水合物的催化下通過共聚反應(yīng)制得。
【文檔編號(hào)】C08F220/56GK106083791SQ201610405497
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】邢孟秋, 商海濤, 魏泓
【申請(qǐng)人】深圳市前海金卓生物技術(shù)有限公司