香豆素衍生物的制備、藥理作用及治療腦缺血的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物化學(xué)、藥理學(xué)與制劑領(lǐng)域，具體包括活性香豆素衍生物的合成與 純化、藥理作用機(jī)制研究、治療腦缺血、腦中風(fēng)、腦水腫、腦梗死、神經(jīng)功能損傷的用途、制 劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 香豆素類化合物是一類具有芳香氣味的天然產(chǎn)物，具有苯并α -吡喃酮母核，可 視為順式鄰羥基桂皮酸脫水形成的內(nèi)酯，是重要的藥用天然活性化合物，以香豆素為主要 有效成分的中藥-補(bǔ)骨脂、祖師麻、秦皮、蛇床子、前胡等，以苯并α -吡喃酮為基本母核，通 過化學(xué)合成與修飾的方法制備非天然的香豆素衍生物，對于探討與發(fā)現(xiàn)這一類結(jié)構(gòu)母核新 的藥理活性及構(gòu)效關(guān)系研究，具有重要的研究意義。
[0003] 瞬時(shí)感受器電位離子通道（transient receptor potential ion channel，TRP channel)是一類在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布很廣泛的陽離子通道蛋白，TRP家族主要由七 個(gè)亞族組成：TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA和TRPN。TRP受到多種因素的調(diào)節(jié)，包 括滲透壓、pH值、機(jī)械力以及一些內(nèi)、外源性配體和細(xì)胞內(nèi)信號分子，其參與生物體內(nèi)感覺 信息傳遞如視覺、溫度覺、痛覺和觸覺等，并且具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca 2+平衡等多種重要的生理功 能。
[0004] TRPV3通道于2002年首次被發(fā)現(xiàn)，有三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了其可以被溫?zé)釡囟?(32°C -39°C )激活。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該通道還可以被合成化合物2-APB、樟腦、胞內(nèi)氫離 子激活。TRPV3通道在人體內(nèi)分布廣泛，在感覺神經(jīng)元如背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和皮膚角 質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)。對于TRPV3的生理功能，目前研究認(rèn)為其與人體的溫度感受密切相關(guān)。 另外，由于TRPV3較為特殊的在皮膚角質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，一系列相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了 TRPV3與脫 發(fā)、瘙癢等皮膚疾病的相關(guān)性，但具體機(jī)制尚不明了。2012年，Lin et al首次發(fā)現(xiàn)了 TRPV3 突變導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的皮膚系統(tǒng)遺傳疾病一一Olmsted綜合癥，也暗示著TRPV3在生理、病 理過程中扮演的重要角色。
[0005] FlexStation3技術(shù)是一種基于鈣熒光的高通量篩選技術(shù)。它的主要原理是：應(yīng)用 可以與鈣離子特異性結(jié)合的染料孵育細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含有大量可結(jié)合鈣離子的未發(fā)光染料分 子。當(dāng)所表達(dá)通道激活后大量鈣離子內(nèi)流，與胞內(nèi)的染料結(jié)合并發(fā)出熒光。通過讀取熒光 值的強(qiáng)度，由其強(qiáng)度變化反應(yīng)離子通道的開合。該方法適用于96孔板或384孔板，可以一 次性篩選多種化合物，實(shí)現(xiàn)高通量篩選。
[0006] 研究離子通道活性及評估化合物對其作用的方法是利用電生理技術(shù)進(jìn)行檢測，因 其直接、靈敏的優(yōu)點(diǎn)而成為了檢測離子通道的"金標(biāo)準(zhǔn)"。電生理膜片鉗技術(shù)是應(yīng)用玻璃微 電極在細(xì)胞膜表面形成高阻封接，將細(xì)胞上的離子通道接入放大器、電極、浴液組成的電環(huán) 路，給予細(xì)胞不同刺激，通過人工鉗制細(xì)胞的膜電位而觀察記錄電環(huán)路中的電流改變情況， 從而反映離子通道的開合。
[0007] Transient receptor potential vanilloid-3 (TRPV3)是非選擇性通透|丐離子的 陽離子通道，在皮膚表皮細(xì)胞廣泛的表達(dá)。TRPV3可被非傷害性的溫覺刺激和傷害性的熱 覺刺激激活。隨著人們對TRPV3通道的研究加深，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變導(dǎo)致的TRPV3功能上調(diào)導(dǎo)致 皮膚潰爛、產(chǎn)生劇烈瘙癢及疼痛；敲除TRPV3,在AEW處理的慢性瘙癢模型中，搔抓反應(yīng)明顯 減少；而且在研究過敏性皮炎患者時(shí)發(fā)現(xiàn)TRPV3的表達(dá)量明顯增高。據(jù)此，人們認(rèn)為TRPV3 有可能成為治療瘙癢疾病的一個(gè)作用靶點(diǎn)。
[0008] 神經(jīng)細(xì)胞鈣離子超載的興奮毒性是腦缺血性損傷的病生理學(xué)機(jī)制。腦中風(fēng)是以 腦局部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的三大主要 殺手之一。長期以來，人們對腦中風(fēng)和缺血性腦損傷的關(guān)注焦點(diǎn)一直集中在控制和抑制 NMDA(N-甲基-D-天（門）冬氨酸）受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流，其理論依據(jù)在于NMDA受體作為谷 氨酸受體的亞型具有高鈣離子通透性。NMDA受體的病理性激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，使 得細(xì)胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)通路激活，引發(fā)延遲的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。然而，過去的20年里所有基 于阻斷NMDA受體功能所研發(fā)的抑制劑在只在臨床前有效，而在抗腦缺血的臨床試驗(yàn)中均 告失敗。這些研究結(jié)果提示，尋找非NMDA通路的分子靶點(diǎn)是探索腦缺血性損傷保護(hù)的新希 望。
[0009] 腦缺血性損傷和缺血再灌注損傷（在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的結(jié)構(gòu)破 壞不但未減輕反而加重）重要的病理特征表現(xiàn)為腦缺血引起的組織酸化和缺血引起的代 謝性酸中毒。其原因在于腦缺血激活了醣酵解的厭氧途徑，導(dǎo)致乳酸在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外間 隙的堆積。研究表明，乳酸酸中毒可以激活氫離子門控的非選擇性陽離子TRP通道和ASIC 通道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載而進(jìn)一步加重腦缺血性損傷（見說明書附圖）。我們近期的研究發(fā) 現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)氫離子濃度升高即細(xì)胞內(nèi)酸化可特異性激活增強(qiáng)TRPV3通道的功能，導(dǎo)致細(xì)胞 鈣超載并引起凋亡。這些研究結(jié)果提示，腦缺血引起的組織酸化以及缺血引起的代謝性酸 中毒激活TRPV3通道，過度激活的TRPV3導(dǎo)致細(xì)胞鈣離子內(nèi)流超載引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重 大腦細(xì)胞的缺血性損傷。
[0010] 技術(shù)方案
[0011] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位 為羥基取代。
[0012]
[0013] &、或、和、R2為甲基、氯甲基、三氟甲基、乙羧基、乙酸甲酯基、乙?；?、乙羧基、丁 基、苯基、氟、氯、溴中的任意一種或多種。
[0014] R3、或、和、R4為羥基
[0015] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)4位被三氟甲基取代，7、8位為羥基取 代。
[0016]
[0017] 7,8_ 羥基-4-三氣甲基-苯并P比喃-2-酮（7,8-dihydroxy-4-trifluo;romethyl-2H-chromen_2-〇ne)
[0018] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物，它結(jié)構(gòu)是如下任意一種或多種：
[0020] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物的制備。
[0021] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物的制備、后處理及純化方法。采用連苯三酚、間苯二 酚、3-甲氧基鄰羥基苯甲醛、或5-溴鄰羥基苯甲醛，與乙酰乙酸乙酯衍生物、丙酮二羧酸、 或丁酰乙酸乙酯衍生物在濃H2S04、70% H2S04、TiC14、哌啶、TUD的催化條件下生成香豆素 類化合物。
[0022] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)，衍生合成的其它同系列化合物的制備及后處 理方法。
[0023] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物制備調(diào)節(jié)瞬時(shí)離子通道蛋白TRPV3亞型的組合物。本 發(fā)明涉及香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位為羥基取 代。本發(fā)明涉及香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)4位被三氟甲基取代，7、8位為羥基取代。
[0024] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物用于瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白（transient receptor potential channels)中的TRPV亞型家族的分子生物學(xué)機(jī)制研究，通過 FlexStation3技術(shù)及電生理技術(shù)對該類化合物的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究。本發(fā)明涉及分 子生物學(xué)方法模型的搭建與實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析。
[0025] 7, 8_ 羥基 _4_ 三氣甲基-苯并吡喃 _2_ 酮（7, 8-dihydroxy-4-trif luoromethyl-2H-chromen-2-〇ne)電生理實(shí)驗(yàn) IC5。值=21±1· 0 μΜ〇
[0026] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物用于制備治療腦缺血的藥物組合物。本發(fā)明涉及香豆 素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位為羥基取代。本發(fā)明涉及 香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)4位被三氟甲基取代，7、8位為羥基取代。
[0027] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物作用于腦缺血動物模型的搭建與實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 及數(shù)據(jù)分析。
[0028] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物作用于制備治療腦缺血的藥物組合物。本發(fā)明涉及香 豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位為羥基取代。本發(fā)明涉 及香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)4位被三氟甲基取代，7、8位為羥基取代。
[0029] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物用于制備治療腦缺血、腦中風(fēng)、腦水腫、腦梗死、神經(jīng) 功能損傷中任意一種或多種疾病的藥物組合物。
[0030] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物作用于制備抑制腦缺血引起的神經(jīng)功能損傷及腦梗 死、降低腦水含量、緩解腦水腫現(xiàn)象中任意一種或多種疾病的藥物組合物。
[0031] 7,8_ 羥基 _4_ 三氣甲基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4_trif luoromethyl-2H-chromen-2_one)用于制備治療腦缺血、腦中風(fēng)、腦水腫、腦梗死、神經(jīng)功能損傷中任意一 種或多種疾病的藥物組合物，該化合物用于小鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積測定及腦水含 量，口服用量范圍是〇. l_500mg/kg，50、100、200mg/kg灌胃給藥可明顯抑制小鼠腦缺血引 起的神經(jīng)功能損傷及腦梗死、降低腦水含量、緩解腦水腫現(xiàn)象.
[0032] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物的制劑，每制劑單位含有l(wèi)_200mg的活性化合物。
[0033] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物的制劑，制劑類型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、 緩釋膠囊劑、凍干粉針劑、注射劑等。
[0034] 在小鼠腦缺血模型中，100mg/kg的化合物FHZ-1與20mg/kg的尼莫地平效果相當(dāng)。 該類化合物針對腦缺血的作用機(jī)制新穎有效，具有較好的市場應(yīng)用前景。
[0035] 該類化合物針對治療腦缺血、腦中風(fēng)、腦水腫、腦梗死、神經(jīng)功能損傷的作用機(jī)制 新穎有效，具有較好的市場應(yīng)用前景。
[0036] 本發(fā)明的香豆素類化合物
[0037] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位 為羥基取代。
[0038]
[0039] &、或、和、R2為甲基、氯甲基、三氟甲基、乙羧基、乙酸甲酯基、乙?；⒁音然?、丁 基、苯基、氟、氯、溴、中的任意一種或多種。
[0040] R3、或、和、心為羥基。
[0041] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物，苯并吡喃酮環(huán)4位被三氟甲基取代，7、8位為羥基取 代。
[0042] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物，它結(jié)構(gòu)是如下任意一種或多種：
[0043]
[0044] 本發(fā)明的香豆素類化合物的催化條件的選擇
[0045] 本發(fā)明采用Pechmann反應(yīng)進(jìn)行香豆素類化合物的合成，該反應(yīng)的基本類型為連 苯三酚與乙酰乙酸乙酯衍生物在濃H 2S04、70% H2S04、TiCl4、TUD的催化條件下生成香豆素 類化合物，本發(fā)明首先比較不同的催化劑對于Pechmann反應(yīng)的催化效率。
[0046] 本發(fā)明的預(yù)試驗(yàn)1:
[0047] 將lOmmol的連苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯與2ml濃H2S0 4混合攪拌均勾，室 溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入30ml水，有大量固體析出，過濾洗滌固體化 合物，將固體產(chǎn)物烘干，70%乙醇/水溶液重結(jié)晶。
[0048] 將lOmmol的連苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯與10ml70% ]^04混合攪拌均勾， 室溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入20ml水，有大量固體析出，過濾洗滌固體 化合物，將固體產(chǎn)物烘干，70%乙醇/水溶液重結(jié)晶。
[0049] 將lOmmol的連苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯與lmmol TiCl4混合攪拌均勾，室 溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入10ml乙酸乙酯，過濾除去反應(yīng)液中的固體， 將濾液蒸干，硅膠拌樣，色譜柱分離，洗脫劑比例為石油醚：乙酸乙酯（1:1)。
[0050] 將lOmmol的連苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯與lmmol TUD混合攪拌均勾， 130°C熔融條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入30ml甲醇溶解反應(yīng)物，硅膠拌樣， 色譜柱分離，洗脫劑比例為石油醚：乙酸乙酯（1:1)。
[0051] 本發(fā)明通過比較四種不同的催化條件，比較不同的乙酰乙酸乙酯衍生物的反應(yīng)條 件、后處理及目標(biāo)產(chǎn)物的收率，結(jié)果表明70% H2S04的催化條件下具有底物適應(yīng)性廣、后處 理簡單、收率較高等優(yōu)點(diǎn)，因此本發(fā)明在后面的反應(yīng)中采用70% H2S04作為Pechmann反應(yīng) 的催化條件合成了一系列的香豆素衍生物。
[0052] 本發(fā)明的香豆素類化合物的合成與純化
[0053] 本發(fā)明涉及香豆素類化合物的制備、后處理及純化方法。采用連苯三酚、間苯二 酚、3-甲氧基鄰羥基苯甲醛、或5-溴鄰羥基苯甲醛，與乙酰乙酸乙酯衍生物、丙酮二羧酸、 或丁酰乙酸乙酯衍生物在濃H 2S04、70% H2S04、TiCl4、哌啶、TUD的催化條件下生成香豆素類 化合物。
[0054]
[0055] 4_ 三氣甲基 _7,8_ 羥基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4-trif luoromethyl-2H-chromen_2-〇ne)
[0056] 將lOmmol的連苯三酸和lOmmol的三氟乙酰乙酸乙酯與10ml70% H2S(V?§合攪拌 均勻，室溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入20ml水，有大量固體析出，過濾洗 滌固體化合物，將固體產(chǎn)物烘干，70 %乙醇/水溶液重結(jié)晶。
[0057]
[0058] 4_ 乙駿基 _7,8-羥基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4_acetic ac i d-2H-chromen-2-〇ne)
[0059] 將lOmmol的連苯三酚和lOmmol的丙酮二羧酸與10ml70%職04混合攪拌均勻， 室溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入20ml水，有大量固體析出，過濾洗滌固體 化合物，將固體產(chǎn)物烘干，70%乙醇/水溶液重結(jié)晶
[0060]
[0061] 3_ 溴 _4_ 甲基 _7,8_ 羥基-苯并吡喃 _2_ 酮（3-bromo_7,8-dihydroxy-4_methyl -2H-chromen_2-〇ne)
[0062] 將lOmmol的連苯三酚和lOmmol的2-溴乙酰乙酸乙酯與10ml70% H2S04混合攪 拌均勻，室溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入20ml水，有大量固體析出，過濾 洗滌固體化合物，將固體產(chǎn)物烘干，70%乙醇/水溶液重結(jié)晶
[0063]
[0064] 3_ 氣-4-甲基-7-羥基-苯并吡喃-2-酮（3_f luor〇-7-hydroxy-4-methyl-2H-c hromen_2-〇ne)
[0065] 將lOmmol的間苯二酸和lOmmol的2-氟乙酰乙酸乙酯與10ml70 % H2S04混合攪 拌均勻，室溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入20ml水，有大量固體析出，過濾 洗滌固體化合物，將固體產(chǎn)物烘干，70%乙醇/水溶液重結(jié)晶
[0066]
[0067] 3_ 氣 _4_ 甲基 _7,8_ 羥基-苯并吡喃 _2_ 酮（3_f luoro-7,8-dihydroxy-4_methy l-2H-chromen_2-〇ne)
[0068] 將lOmmol的連苯三酸和lOmmol的2-氟乙酰乙酸乙酯與10ml70 % H2S04混合攪 拌均勻，室溫條件下反應(yīng)約6hr，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液加入20ml水，有大量固體析出，過濾 洗滌固體化合物，將固體產(chǎn)物烘干，70%乙醇/水溶液重結(jié)晶
[0069]