一種透皮肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有透皮功能或透皮增強功能的多肽及編碼該多肽的核酸序列。該多肽能夠促進和/或增強其他物質(zhì)的透皮，這些物質(zhì)包括小分子活性物質(zhì)、大分子活性物質(zhì)如蛋白、核酸等。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明透皮肽的組合物，如美容制劑、美發(fā)制劑、藥物組合物等。
【專利說明】
一種透皮肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種具有增強型透皮功能的多 肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 透皮給藥系統(tǒng)或經(jīng)皮吸收系統(tǒng)（Transdermal Drug Delivery Systems/ Transdermal Thrapeutic Systems，簡稱TDDS/TTS)，指經(jīng)皮膚貼敷或涂抹方式用藥，藥物 由皮膚吸收進入全身血液循環(huán)并達到有效血藥濃度、實現(xiàn)疾病治療或預(yù)防的一種方法。其 主要特點：（1)透皮給藥系統(tǒng)可避免肝臟的首過效應(yīng)和藥物在胃腸道的滅活，藥物的吸收 不受胃腸道因素的影響并且減少用藥的個體差異；（2)維持恒定有效血藥濃度或生理效 應(yīng)，避免口服給藥引起的血藥濃度峰谷現(xiàn)象，降低毒副反應(yīng)；（3)減少給藥次數(shù)，提高治療 效能，延長作用時間，避免多劑量給藥，使大多數(shù)病人易于接受；（4)使用方便，患者可以自 主用藥，也可以隨時撤銷用藥。
[0003] 皮膚是最大、最易侵入的器官，皮膚遺傳病多達330余種，尚無根治措施?；蛑?療是將外源正常基因或基因片斷導(dǎo)入靶細胞，以糾正或補償基因缺陷，達到治療遺傳病的 生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)。經(jīng)皮給藥具有易操作、損傷小等優(yōu)點，避免了胃腸道和肝臟的消化和降解 作用。
[0004] 許多化學(xué)滲透增強劑被用來試圖打開皮膚屏障，但大多數(shù)效果不理想。如果沒有 物理方法的幫助，化學(xué)透皮增強劑難以有效地將親水性藥物(特別是分子量大于500Da的藥 物)通過未破壞的皮膚進入到血液循環(huán)，并達到治療所需的血藥水平。此外，現(xiàn)有的化學(xué)透 皮增強劑容易導(dǎo)致皮膚損傷、發(fā)炎、過敏、系統(tǒng)毒性等，在使用上收到很大限制。常用的物理 方法有離子電滲、微針等，以證明對多種藥物分子具有增進透皮的效果。但物理方法有很多 不足，包括使用特別儀器，成本高，劑型靈活性差等，而且在不同程度上有疼痛感，不適合家 庭使用等。
[0005] 因此需要開發(fā)出新型的能夠克服上述諸多不足的透皮增強劑，從而有效增強和/ 或方便活性分子透過皮膚，使得進入體循環(huán)的活性分析劑量增加或者到達靶器官、組織和 細胞的活性分子劑量增加。此外，新型透皮增強劑應(yīng)不會導(dǎo)致皮膚損傷、發(fā)炎、過敏、系統(tǒng)毒 性等，并能夠用于大分子量藥物如多肽、蛋白和核酸分子的透皮給藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種透皮增強多肽，該透皮增強肽具有SEQ ID No 1 所示的序列。SEQ ID No 1:ACSSTKKHCG。
[0007] 本發(fā)明的第二個方面是提供一種核苷酸序列，該核苷酸序列含有編碼SEQ ID No 1所示的多肽序列的核苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明的第三個方面是提供一種包含上述透皮增強肽的組合物，這種組合物可以 是美容制劑、美發(fā)制劑或藥物組合物。在一種優(yōu)選情況下，該美容制劑包含至少一種透皮增 強劑，和至少一種皮膚養(yǎng)護、皮膚機能改善或者皮膚色澤調(diào)節(jié)的有效成分，所述透皮增強劑 含有SEQ ID No 1所示的多肽序列。在一種優(yōu)選情況下，該美發(fā)制劑包含至少一種透皮增強 劑，和至少一種美發(fā)活性成分，所述美發(fā)活性成分包括任何具有促進毛發(fā)生長、防止毛發(fā)脫 落、改變毛發(fā)結(jié)構(gòu)、成分或色澤功效的分子，所述透皮增強劑含有SEQ ID No 1所示的多肽 序列。在一種優(yōu)選情況下，該藥物組合物包括至少一種治療某疾病的有效劑量的藥物活性 成分和至少一種透皮給藥增強劑，所述透皮增強劑含有SEQ ID No 1所示的多肽序列。進一 步優(yōu)選的，所述藥物活性成分為小分子核酸;更優(yōu)選的，所述小分子核酸選自小分子干擾核 酸(siRNA)、微小核酸(miRNA)或反義核酸。
[0009] 本發(fā)明還提供一種透皮多肽輔助活性物質(zhì)透皮的方法，將透皮多肽與有效劑量的 活性物質(zhì)混合，所述活性物質(zhì)為小分子核酸，選自小分子干擾核酸（siRNA)、微小核酸 (miRNA)或反義核酸。
[0010] 有益效果:使用本發(fā)明的透皮增強肽，能夠在不損傷皮膚的情況下實現(xiàn)活性物質(zhì) 的透皮吸收。
【附圖說明】
[0011]圖1、多肽透皮效果研究。對照組包括空白對照(孵育過程中不加入任何噬菌體)和 表達不具有透皮能力的GLP1多肽(一種39個氨基酸的降糖多肽)的對照噬菌體。透皮肽噬菌 體為表達SEQ ID No 1序列的噬菌體。在培養(yǎng)平板上，噬菌斑顯示為藍色，藍色越深表示能 夠透過皮膚的噬菌體越多。在空白對照和表達GLP1多肽的對照噬菌體組中，均未在小鼠血 液中檢測到噬菌體的存在，表明在沒有輔助的情況下，噬菌體無法自主透過小鼠皮膚。對實 驗組而言，SEQ ID No 1序列形成的陽性克?。ㄋ{色斑)數(shù)較多，表明表達SEQ ID No 1序 列多肽的噬菌體具有較好的透皮能力。
[0012] 圖2、輔助熒光標記siRNA的透皮效果研究。在SEQ ID No 1序列多肽的作用下，大 量熒光標記的siRNA從皮膚表面迀移到角質(zhì)層和皮下組織中。研究結(jié)果表明，在化妝品基質(zhì) 存在的條件下，SEQ ID No 1序列多肽能高效輔助熒光標記siRNA的透皮。
【具體實施方式】
[0013] 以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常 規(guī)條件，如《分子克隆：實驗室手冊》（New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件或廠商提供的條件進行。
[0014]為了證明透皮多肽輔助噬菌體透皮的效果，建立了基于冰凍切片和激光熒光共聚 焦顯微鏡的siRNA透皮研究技術(shù)。我們將化妝品基質(zhì)、化學(xué)合成的SEQ ID No 1透皮多肽、 以及熒光標記的siRNA進行大鼠皮膚涂抹，利用冰凍切片和激光熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)， 對透皮過程進行了研究。我們的研究結(jié)果表明，在存在化妝品基質(zhì)的條件下，本研究鑒定的 透皮多肽仍能高效地輔助siRNA透過大鼠皮膚。另一方面，我們研究了SEQ ID No 1在動物 體內(nèi)輔助表皮生長因子(EGF)透皮的效果，結(jié)果表明該多肽能有效地輔助EGF透皮。
[0015] 實施例一、采用固相合成方法合成多肽SEQ ID No 1:ACSSTKKHCG。
[0016] 采用微波輔助多肽固相合成法：以Wang樹脂為固相載體，HBTU-HOBt為縮合劑， Fmoc為α-氨基保護基的合成策略。稱取0. lmmol的Fmoc-甘氨酸-Wang樹脂于固相反應(yīng)器中， 加入10mL的DCM溶脹樹脂30min，待樹脂充分溶脹，真空抽干溶劑。用20%哌啶/DMFlOmL洗滌 一次，向樹脂中加入20%哌啶/DMFlOmL并置于微波輔助固相合成儀中，于60°C，20W條件下反 應(yīng)3min脫除Fmoc保護基，依次用DCM、DMF洗漆，保護基脫除采用Kaiser法進行檢測，檢測呈 陽性可繼續(xù)反應(yīng)。將3eq的Fmoc-氨基酸-〇H、HBTU和HOBt用DMF溶解，滴加5eq的DIEA靜置 2min使其充分活化，加入固相反應(yīng)器中，于60°C，20W條件下反應(yīng)5min，縮合完成后，用DCM， DMF依次洗滌樹脂。重復(fù)以上各步反應(yīng)得到所需直鏈多肽，用TFA/TIS/H20為95: 2.5: 2.5溶 液10mL，常溫反應(yīng)2h去掉N-端和側(cè)鏈保護基并切除樹脂，用DCM洗滌三次，濾液濃縮至最小 體積后，加入30倍體積冰乙醚，在4°C條件下，10000r/min離心15min，棄去上清液，重復(fù)結(jié)晶 兩次，真空干燥得到多肽直鏈產(chǎn)物。將多肽溶于25%甲醇水溶液中，分5次每次間隔30min加 入2.5eq碘進行氧化反應(yīng)，室溫攪拌反應(yīng)2h后濃縮，得到粗產(chǎn)品。純化采用凝膠層析色譜S印 hadex G-15，洗脫液為50%甲醇水溶液，產(chǎn)物經(jīng)HPLC和ES1-MS進行鑒定。得到如下序列：SEQ ID No 1 ACSSTKKHCG 實施例二、動物實驗驗證透皮活性 本實施例是為了研究透皮多肽在小鼠水平的透皮效果，具體步驟如下。
[0017] 1.實驗前36小時給小鼠刮毛，得到2x2 cm無毛皮膚。
[0018] 2. 菌液（購自北京天恩澤）加入4 mL的如YX培養(yǎng)基，37Γ孵育， 180 rpm離心4h。
[0019] 3.將小鼠用3.5。/冰合氯醛麻醉，麻醉劑量為識取甚。
[0020] 4.在每只小鼠準備好的2過cm皮膚表面，加上_蛑噬菌體。
[0021] 5.半小時、一小時各取血混合加入1 mL步驟2制備的菌液中，37°C孵育， 120 rpm條件下離心40分鐘。
[0022] 6.將第二步混合液用藍白斑篩選的方法過夜，得到圖1所示結(jié)果。
[0023] 7.挑選藍色斑點，擴增提取質(zhì)粒，測序。
[0024] 實施例三、透皮多肽輔助siRNA透皮活性研究 本實施例是為了研究透皮多肽在大鼠水平的透皮效果，具體步驟如下。
[0025] 1 ·實驗前36小時給大鼠刮毛，得到2x2 cm無毛皮膚。
[0026] 2.將少量(約0.1克)化妝品基質(zhì)與化學(xué)合成的SEQ ID Nol多肽lmg、以及熒 光標記的siRNA(100 ng)進行充分混合。
[0027] 3.將混合物均勻地涂抹到已經(jīng)去毛的大鼠皮膚上，用保鮮膜包裹于皮膚上。
[0028] 4.1個小時后處死大鼠，分離皮膚，用PBS對皮膚表面進行清洗，隨后在液氮速 凍條件下，進行皮膚樣品的包埋和冰凍切片。利用共聚焦顯微鏡觀察siRNA的透皮效果。 得到圖2所示結(jié)果。從圖中我們可以看到，本發(fā)明的SEQ ID No 1所述的透皮增強肽能夠輔 助帶有熒光標記的s iRNA透過小鼠皮膚。
[0029] 實施例四、透皮多肽輔助表皮生長因子蛋白（EGF)透皮活性研究 本實施例是為了研究透皮多肽在大鼠體內(nèi)水平對蛋白的透皮增強效果，具體步驟如 下。
[0030] 隨機抽取10只SD大鼠，并將其平均分成共分2組，每組各5只（對照組EGF透皮給藥 組;實驗組SEQ ID Nol混合EGF(9:1)透皮給藥組）。
[0031] 1. 1ml烏拉坦麻醉后，在腹部剪出約2'2cm.2x:2 os的無毛區(qū)，在此部位對照組和實 驗組各給藥50ug。
[0032] 2.在給藥300min后采用心臟取血，4度3000轉(zhuǎn)離心收集血清。
[0033] 3.取100ul血清，EGF ELISA試劑盒(上海滬鼎生物科技有限公司）檢測。得到表1所 不結(jié)果。
[0034]在SEQ ID Nol多肽的作用下，給藥5小時后在大鼠體內(nèi)檢測到的EGF量高于對照 組，表明SEQ ID Nol多肽能高效輔助EGF的透皮。
【主權(quán)項】
1. 一種透皮增強多肽，其特征在于，具有SEQ ID No 1所示的序列。2. -種核苷酸序列，其特征在于，該核苷酸序列含有編碼SEQ ID No 1所示的多肽序 列的核苷酸序列。3. -種美容制劑，其特征在于包含至少一種透皮增強劑，和至少一種皮膚養(yǎng)護、皮膚 機能改善或者皮膚色澤調(diào)節(jié)的有效成分，所述透皮增強劑含有SEQ ID No 1所示的多肽序 列。4. 一種美發(fā)制劑，其特征在于包含至少一種透皮增強劑，和至少一種美發(fā)活性成分，所 述美發(fā)活性成分包括任何具有促進毛發(fā)生長、防止毛發(fā)脫落、改變毛發(fā)結(jié)構(gòu)、成分或色澤功 效的分子，所述透皮增強劑含有SEQ ID No 1所示的多肽序列。5. -種藥物組合物，其特征在于包括至少一種治療某疾病的有效劑量的藥物活性成分 和至少一種透皮給藥增強劑，所述透皮增強劑含有SEQ ID No 1所示的多肽序列。6. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物活性成分為小分子核酸、多肽 或蛋白。7. 如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述小分子核酸選自小分子干擾核酸 (s iRNA)、微小核酸(miRNA)或反義核酸。8. -種輔助活性物質(zhì)透皮的方法，其特征在于將SEQ ID No 1所述的透皮增強多肽與 有效劑量的活性物質(zhì)混合并施于皮膚表面。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述活性物質(zhì)為小分子核酸，選自小分子干擾 核酸(siRNA)、微小核酸(miRNA)或反義核酸。
【文檔編號】A61Q19/00GK106084006SQ201610462882
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】湯濤, 杜權(quán), 鄧艷, 東碩
【申請人】普銳尼斯生物科技有限公司