氣道上皮與氣道平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及細(xì)胞培養(yǎng)實驗器材，具體地說涉及一種氣道上皮與氣道平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]氣道平滑肌原代培養(yǎng)是體外研究氣道重塑的重要手段之一，也是對哮喘等氣道慢性炎癥性疾病進(jìn)行細(xì)胞分子水平研究的基礎(chǔ)。建立氣道平滑肌細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型對研究呼吸系統(tǒng)疾病，特別是氣道上皮細(xì)胞的損傷、炎癥對平滑肌細(xì)胞增生、肥大的作用尤為重要。
[0003]目前存在的氣道上皮和氣道平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)的裝置主要是Transwell小室。Transwell小室的底部濾膜材質(zhì)為聚苯二甲酸乙二醇酯(polythylene terephthalate，PET)，膜表面經(jīng)過鈦酸酯偶聯(lián)劑(titanate coupling agent，TC)處理，改善了細(xì)胞的貼壁性；另外，插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿包含有透明的B1pore膜，可直接透過膜觀察細(xì)胞。利用插入式培養(yǎng)皿可將氣道上皮細(xì)胞或氣道平滑肌細(xì)胞接種于可通透性的PET膜上，直徑為12 mm和30 mm的插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿可懸掛于24孔或6孔板上，其原理是將氣道上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞在同一培養(yǎng)基中的兩個層面上進(jìn)行培養(yǎng)，兩種細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)可以通過插入式培養(yǎng)皿的微孔膜在細(xì)胞間進(jìn)行交換。插入式培養(yǎng)皿為懸掛式設(shè)計，方便移液管操作，而且插入皿會自動歸位。
[0004]但上述Transwell小室存在以下缺陷:(I) Transwell小室中，生長于不同層面的氣道上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞通過濾膜進(jìn)行對話，并不符合實際生理情況。(2)尤其在共培養(yǎng)的短期作用觀察中，Transwell小室的濾膜在一定程度上，不利于細(xì)胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)的迅速擴(kuò)散和相互交流，導(dǎo)致介質(zhì)分布不均，影響細(xì)胞間對話。(3) Transwell小室的PET材質(zhì)濾膜，孔徑一般較小，最大不超過12 ym，僅有少數(shù)細(xì)胞可以通過，由于濾膜本身面積有限，且氣道上皮細(xì)胞系較氣道平滑肌原代細(xì)胞生長迅速，因此，濾膜上的氣道上皮細(xì)胞常會累積生長，導(dǎo)致位于內(nèi)層的氣道上皮細(xì)胞氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)獲取不足；氣道上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞的生長狀態(tài)難以協(xié)調(diào)一致。(4) Transwell小室費用較貴，難以應(yīng)用于大規(guī)模、大批次的細(xì)胞共培養(yǎng)。
【實用新型內(nèi)容】
[0005]發(fā)明目的:本實用新型的目的是提供一種低成本、建立培養(yǎng)體系簡捷有效、且便于后續(xù)實驗操作的氣道上皮與氣道平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)裝置。
[0006]技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述目的，本實用新型的氣道上皮與氣道平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)裝置包括:設(shè)有至少一個皿狀空間的容器、設(shè)于所述容器皿狀空間底面的若干根立柱、以及對應(yīng)任一皿狀空間內(nèi)被立柱穩(wěn)定在某一水平高度的尼龍網(wǎng)。
[0007]所述容器包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿的任意一種。優(yōu)選地，所述容器為12孔板。
[0008]任一皿狀空間內(nèi)的立柱設(shè)有3~6個。本實用新型的立柱是根據(jù)實際需要手動安裝在容器底壁的，立柱與尼龍網(wǎng)形成一個氣道上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。所述若干根立柱為底部熔融狀態(tài)下焊接在皿狀空間底面的玻璃柱，立柱的高度不超出皿狀空間高度的1/3~1/2。
[0009]氣道平滑肌細(xì)胞種植于容器皿狀空間的底壁，氣道上皮細(xì)胞種植于尼龍網(wǎng)上。培養(yǎng)時整個體系在培養(yǎng)基中，立柱需要方便設(shè)置且利于尼龍網(wǎng)的取出。所述若干根立柱距其頂端1/4~1/3處設(shè)有與所述尼龍網(wǎng)間隙配合的橫向切槽。進(jìn)一步地，在任一皿狀空間內(nèi)，立柱切槽的槽口方向面向皿狀空間的中心，所述尼龍網(wǎng)為圓形尼龍網(wǎng)。
[0010]所述尼龍網(wǎng)為300目~600目尼龍網(wǎng)，優(yōu)選為400目尼龍網(wǎng)，原因主要是:(I)尼龍網(wǎng)為柔性材料，方便細(xì)胞培養(yǎng)過程中用鑷子夾取和卡在切槽內(nèi)。(2)尼龍網(wǎng)同時具有一定韌性和表面摩擦力，卡在切槽內(nèi)的尼龍網(wǎng)不會下沉和漂浮。(3)氣道上皮細(xì)胞直徑一般十幾微米，不超過40 μ m，300目~600目尼龍網(wǎng)的直徑在23~48 μ m之間，其中400目尼龍網(wǎng)直徑為38μπι左右；氣道上皮細(xì)胞具有貼壁性強(qiáng)和生長速度快的特性，選擇網(wǎng)眼直徑略大于氣道上皮細(xì)胞的尼龍網(wǎng)，有利于細(xì)胞貼壁生長和自由穿越，同時有利于營養(yǎng)物質(zhì)的滲透。
[0011]利用本實用新型的培養(yǎng)裝置建立氣道上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)體系的處理步驟包括:
[0012](I)玻璃柱酸處理后進(jìn)行高壓滅菌，然后焊接到孔板內(nèi)底面；
[0013](2)冷卻后將焊接有玻璃柱的孔板紫外消毒，多聚賴氨酸包被，37° C過夜；
[0014](3)將氣道平滑肌細(xì)胞種植于孔板內(nèi)底面，48 h后全量換液，以后每2~3 d換液一次；
[0015](4)氣道平滑肌細(xì)胞種植第3 d，尼龍網(wǎng)75%酒精浸泡30 min，紫外消毒，多聚賴氨酸包被，37° C過夜；
[0016](5)離體培養(yǎng)2~4 d氣道上皮細(xì)胞系種植于尼龍網(wǎng)，24 h后全量換液，以后每2~3d換液一次；
[0017](6)氣道平滑肌細(xì)胞種植第5 d，條件培養(yǎng)基預(yù)孵氣道上皮細(xì)胞系24 h，收集條件培養(yǎng)基；次日，條件培養(yǎng)基半量更換平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基，37° C孵育24 h ;
[0018](7)氣道平滑肌細(xì)胞種植第7~9 d，更換新鮮平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基，將氣道上皮細(xì)胞系尼龍網(wǎng)小心反扣并卡在玻璃柱切槽內(nèi)，建立體系。
[0019]有益效果:(1)本實用新型設(shè)計合理、操作簡便、易行，克服了 Transwell小室氣道上皮細(xì)胞生長不易控制的問題。利用300目~600目尼龍網(wǎng)，可減緩上皮細(xì)胞生長速度，且上皮細(xì)胞可自由穿越尼龍網(wǎng)的兩面進(jìn)行生長，防止因復(fù)層累積生長導(dǎo)致內(nèi)層細(xì)胞營養(yǎng)不良。(2)本實用新型改良了 Transwell小室，氣道上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞生長在同一細(xì)胞外液的不同平面上，氣道上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)可以相互交換；同時通過反扣尼龍網(wǎng)，可以使氣道上皮細(xì)胞與氣道平滑肌細(xì)胞直接對話，相對于Transwell小室通過濾膜進(jìn)行分子生物交換，更直接、更接近于生理情況。(3)本實用新型應(yīng)用過程中