一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)co的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種熒光探針，特別涉及一種B0DIPY類(lèi)熒光探針、其合成方法及其在 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的應(yīng)用，屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 多年來(lái)，一氧化碳(carbon monoxide，C0)因其極易與血紅蛋白結(jié)合，形成碳氧血 紅蛋白，使血紅蛋白喪失攜氧的能力和作用，造成組織室息，嚴(yán)重時(shí)死亡。一直以來(lái)，C0被人 們認(rèn)為是一種有毒氣體。20世紀(jì)70年代，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體可以?xún)?nèi)源性產(chǎn)生C0，它在體內(nèi)主要是 由血紅素氧化酶酶解血紅素產(chǎn)生。C0與其它氣體信號(hào)小分子N0、H 2S-樣，在機(jī)體調(diào)節(jié)的生 理和病理方面都起著重要作用。C0的主要生理作用是為心肌局部缺血和再灌注時(shí)組織損傷 提供保護(hù)。相比傳統(tǒng)直接給機(jī)體吸入C0氣體，過(guò)渡金屬羰基復(fù)合物的C0釋放分子(CORMs)被 認(rèn)為是臨床上防止心肌局部缺血和再灌注時(shí)組織損傷的潛在藥物。內(nèi)源性氣體信號(hào)分子因 其具有持續(xù)產(chǎn)生、傳播迅速等特別。目前的 C0檢測(cè)技術(shù)，如硫酸鈀-鉬酸銨比色式法、電化學(xué) 法、氣相色譜法、紅外線(xiàn)一氧化碳檢測(cè)法等，往往需要延后處理或破壞的組織或產(chǎn)生細(xì)胞裂 解產(chǎn)物。
[0003] 近年來(lái)，用于檢測(cè)體內(nèi)⑶的熒光探針，比較少見(jiàn)。如以B0DIPY為熒光母體(Brian ff.Michel,Alexander R.Lippert,and Christopher J.Chang,J.Am.Chem.Soc.2012,134, 15668-15671)探針，以及以雙光子染料香豆素衍生物為熒光母體(K. Zheng，W. Lin，L. Tan， H.Chena and H.Cuia，Chem.Sci. ,2014,5,3439-3448.)的熒光探針。以上兩種探針的響應(yīng) 基團(tuán)都是以芐胺形成的環(huán)鈀化物，雖然選擇性好，但反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)(lh或30min)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針及其制備方 法和應(yīng)用，該類(lèi)熒光探針結(jié)構(gòu)新穎、靈敏度高、光穩(wěn)定性好。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006] -種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針，結(jié)構(gòu)式如下：
[0007]
[0008]其中，R為H、-CH3、-CH2CH3 或-COOEt。
[0009] 本發(fā)明合成新型環(huán)鈀基 ?夠?qū)0的響應(yīng)性更快更靈敏，其與B0DIPY結(jié) 合后不僅提高了對(duì)C0的選擇性，而且實(shí)現(xiàn)更快更靈敏的檢測(cè)C0。
[0010] 一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)co的熒光探針的制備方法，將對(duì)硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯和三 氟化硼乙醚，或?qū)ο趸郊柞Ｂ取⒍谆量┭苌锖腿鹨颐逊磻?yīng)生成硝基苯基氟 硼二吡咯(硝基苯基B0DIPY)，然后將硝基苯基B0DIPY中的硝基還原成氨基，再加入亞硝酸 鹽和3，5-二甲基苯酚偶氮化反應(yīng)，最后加入鈀鹽進(jìn)行環(huán)鈀化反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物，即檢測(cè)細(xì) 胞內(nèi)C0的熒光探針(ACP-C0)。
[0011]本發(fā)明合成方法簡(jiǎn)單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0012]優(yōu)選的，所述二甲基吡咯為2,4_二甲基吡咯。
[0013] 其反應(yīng)過(guò)程如下：
[00141
[0015] 其中，R為H、-CH3、-CH2CH3 或-COOEt。
[0016] 優(yōu)選的，步驟如下：
[0017] (1)將對(duì)硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或?qū)ο趸郊柞Ｂ群投谆量┭苌锶?解于溶劑1中，加熱回流后冷卻，加入溶劑2,加入三氟化硼乙醚升溫反后得到5,5_二氟-1， 3，7，9-四甲基-10-(4-硝基苯基)-5Η-4λ 4，5λ4-二吡咯[1，2-c: 2 '，Γ -f ] [ 1，3，2 ]二氮雜硼， 即硝基苯基B0DIPY;
[0018] (2)將硝基苯基B0DIPY和甲酸銨溶于溶劑中，然后加入Pd/C攪拌反應(yīng)后即得氨基 苯基 B0DIPY;
[0019] (3)將氨基苯基B0DIPY和濃鹽酸溶于溶劑中，加入亞硝酸鹽溶液，攪拌后，加入3， 5-二甲基苯酚的堿溶液攪拌后得到偶氮B0DIPY;
[0020] (4)將偶氮B0DIPY染料溶解于溶劑中，然后加入PdCl2,室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，即得檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（1)的具體步驟為:將對(duì)硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或 對(duì)硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生物溶解于CH 2C12中，加熱回流l_2h，冷卻后加入三乙胺、 甲苯，待反應(yīng)10-20分鐘后加入三氟化硼乙醚，升溫至50-60°C反應(yīng)2-4小時(shí)，旋干，用色譜柱 分離，所得固體即硝基苯基BODIPY;
[0022]所述的硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯或二甲基吡咯衍生物、三乙胺、甲苯、三氟化硼 乙醚及CH2CI2的用量比為7-10:7-20:3 · 5-5 · 5:30-50:3-6:20-50(g: g:mL:mL:mL:mL);色譜 柱分離洗脫劑比例為V?_:VjffiK=4-6:1。提高原料的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)提高硝基苯基BODIPY的 產(chǎn)率和純度。
[0023]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（2)的具體步驟為：將硝基苯基B0DIPY、甲酸銨溶于 CH2C12,然后加入Pd/C，常溫?cái)嚢?-3小時(shí)后過(guò)濾，將濾液旋干得氨基苯基B0DIPY;所述的硝 基苯B0DIPY、甲酸銨、Pd/C、CH 2C12的用量比例為:5~10:50~70:l~5 :10-30(g:g:g:mL)<^ 高原料的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)提高氨基苯基B0DIPY的產(chǎn)率和純度。
[0024]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（3)的具體步驟為：將氨基苯基B0DIPY、濃鹽酸溶于DMF 中，加入亞硝酸鈉水溶液，在〇-5°C下攪拌3-4h，然后將其緩慢滴加到3,5-二甲基苯酚的 NaOH溶液中，在0-5 °C下攪拌4-5h，過(guò)濾后的濾渣色譜柱分離，得黃色固體偶氮B0DIPY;
[0025] 所述的氨基苯基B0DIPY、濃鹽酸、DMF、亞硝酸鈉、3,5-二甲基苯酚、似0!1、水的用量 比為 1-3:3-5:10-15:3-5:3-5:4-8:20-30(g:mL:mL:g :g:g:mL)。色譜柱分離洗脫劑比例為 VjiWi: Ve麵=1-3:2。提高原料的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)提高偶氮B0DIPY的產(chǎn)率和純度。
[0026] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟⑷中的溶劑為CH30H;所述的偶氮BODIPY、CH 3OH、PdCl2的 用量比例為5~10:10~30:10~20(g:mL:g)。提高原料的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)提高檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的 熒光探針的產(chǎn)率和純度。
[0027] -種上述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0中的應(yīng)用。
[0028] 一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的方法，步驟為：
[0029] (1)將上述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針溶解于生理鹽水、緩沖溶液或者培養(yǎng)液中，配 制成儲(chǔ)備液儲(chǔ)存待用；
[0030] (2)將步驟(1)中的儲(chǔ)備液加入含有細(xì)胞組織的適當(dāng)緩沖液進(jìn)行測(cè)試。
[0031] 一種檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)C0的方法，步驟為：
[0032] (1)將含有上述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針的緩沖溶液5-10μΜ加入培養(yǎng)好的細(xì)胞放 于培養(yǎng)箱是孵育8-12分鐘；
[0033] (2)將細(xì)胞用生理PBS緩沖液洗去多余的探針，然后進(jìn)行激光共聚焦顯微成像，如 果是檢測(cè)內(nèi)源性物質(zhì)，剛是直接進(jìn)行共聚焦成像，而如果是外加檢測(cè)的，剛是加了待檢測(cè)物 質(zhì)后，再次孵育8-12分鐘，然后進(jìn)行成像。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0035] 1.合成簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，檢測(cè)過(guò)程中不需要長(zhǎng)時(shí)間的孵育；
[0036] 2.選擇性高，其它生物活性小分子不干擾；
[0037] 3.檢測(cè)波長(zhǎng)512nm處于可見(jiàn)光區(qū)，對(duì)細(xì)胞損傷小。有利細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行C0的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1是本發(fā)明的探針ACP-C0熒光強(qiáng)度和C0RM-2濃度變化的關(guān)系；橫坐標(biāo)是波長(zhǎng) (nm)，縱坐標(biāo)是熒光強(qiáng)度;該圖為512nm處的熒光光譜；
[0039] 圖2是本發(fā)明的探針ACP-C0的相對(duì)于生物體內(nèi)常見(jiàn)的活性小分子的選擇性實(shí)驗(yàn)；
[0040] 圖3是本發(fā)明的探針ACP-C0的相對(duì)熒光強(qiáng)度和C0RM-2濃度的工作曲線(xiàn);橫坐標(biāo)是 C0RM-2的濃度，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度；
[0041 ]圖4是本發(fā)明的探針ACP-C0對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)的激光共聚顯微成像；圖a與圖b 為細(xì)胞成像圖，圖c為前兩者的疊加圖，圖d為細(xì)胞明場(chǎng)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] (1)將對(duì)硝基苯甲酰氯(7g)、2，4-二甲基吡咯（7g)溶解CH2C1 2(20mL)中，加熱回流 lh。冷卻后加入三乙胺(3.5g)、甲苯(30ml)。待反應(yīng)15分鐘后加入三氟化硼乙醚(3g)，升溫 至50度反應(yīng)3小時(shí)，旋干，用色譜柱分離(洗脫劑:V?鍵:5:1 )，旋干得橙色固體硝基 苯基 B0DIPY。
[0045] 核磁及質(zhì)譜表征：
[0046] 4匪1?(4001抱，0)(：13):3 = 1.36(8,6!〇,2.57(8,6!〇,6.02(8,2!〇,7.54((1, J = 8Hz， 2H),8.39(d ,J = 8Hz,2H)
[0047] ESI-MS:calculated for[M_H]-=368.1，found 368.1。
[0048] (2)將硝基苯基B0DIPY(5g)、甲酸銨（50g)溶于CH2Cl 2(10mL)，然后加入Pd/Cl2 (1 g)，常溫?cái)嚢?小時(shí)，過(guò)濾，濾液旋干得氨基苯基BODIPY。
[0049] 核磁及質(zhì)譜表征：
[0050] ^NMRC^OMHz.CDCb) ：5 = 1.49(s,6H) ,2.54(s,6H) ,3.89(s,2H) ,5.97(s,2H), 6.79(d ,J = 4Hz,2H),7.01(d ,J = 8Hz,2H)
[0051] ESI-MS:calculated for[M+H] + = 340.2,found 340.2〇
[0052] (3)將氨基苯基BODIPY(lg)、濃HCl(3mL)溶于DMF(lOmL)中，加入亞硝酸鈉（3g)水 溶液（10mL)，在0-5 °C下攪拌3h，然后將其緩慢滴加到3，5-二甲基苯酚(3g)的Na0H( 4g)溶液 中，在0-5 °C下攪拌4h，過(guò)濾，濾渣溶解旋干，色譜柱分離(洗脫劑:V；a瞧=1:1)，得黃 色固體偶氮B0DIPY。
[0053]核磁及質(zhì)譜表征：
[0054] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5=1.44(s,6H),2.47(s,12H),6.21(s,2H),6.63(s,2H), 7.56(d ,J = 8Hz,2H),7.95(d ,J = 8Hz,2H),10.07(s,lH)
[0055] ESI-MS:calculated for[M-H]_ = 471.2,found 471.2〇
[0056] (4)將偶氮B0DIPY(5g)溶解于CH30H(10mL)中，然后加入PdCl 2(10g)，室溫?cái)嚢柽^(guò) 夜，過(guò)濾得黃色固體。
[0057]核磁表征：
[0058] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5 = 1.50(s,6H) ,2.20(s,6H) ,2.47(s,6H),6.23(s,2H), 6.60(s，2H)，7.35(d，J = 8Hz，lH)，7.56(s，lH)，8.12(d，J