= 8Hz，lH)，9.75(s，lH)。
[0059] 實(shí)施例2
[0060] (1)將對硝基苯甲酰氯(0.14g)、2，4-二甲基吡咯(0.14g)溶解CH2C1 2 (2mL)中，加熱 回流lh。冷卻后加入三乙胺（0.35g)、甲苯（3ml)。待反應(yīng)15分鐘后加入三氟化硼乙醚 (0.3g)，升溫至50度反應(yīng)3小時(shí)，旋干，用色譜柱分離(洗脫劑:5:1)，旋干得橙 色固體硝基苯基B0DIPY。
[0061] 核磁及質(zhì)譜表征：
[0062] 4匪1?(4001抱，0)(：13):3 = 1.36(8,6!〇,2.57(8,6!〇,6.02(8,2!〇,7.54((1, J = 8Hz， 2H),8.39(d ,J = 8Hz,2H)
[0063] ESI-MS:calculated for[M_H]-=368.1，found 368.1。
[0064] (2)將硝基苯基BODIPY(lOg)、甲酸銨（lOOg)溶于CH2Cl 2(20mL)，然后加入Pd/Cl2 (2g)，常溫?cái)嚢?小時(shí)，過濾，濾液旋干得氨基苯基B0DIPY。
[0065] 核磁及質(zhì)譜表征：
[0066] ^NMRC^OMHz.CDCb) ：5 = 1.49(s,6H) ,2.54(s,6H) ,3.89(s,2H) ,5.97(s,2H), 6.79(d ,J = 4Hz,2H),7.01(d ,J = 8Hz,2H)
[0067] ESI-MS:calculated for[M+H] + = 340.2,found 340.2〇
[0068] (3)將氨基苯基B0DIPY( 2g)、濃HC1 (6mL)溶于DMF( 20mL)中，加入亞硝酸鈉（6g)水 溶液（1 OmL)，在0-5 °C下攪拌3h，然后將其緩慢滴加到3，5-二甲基苯酚(6g)的Na0H( 8g)溶液 中，在0-5 °C下攪拌4h，過濾，濾渣溶解旋干，色譜柱分離(洗脫劑:V；a瞧=1:1)，得黃 色固體偶氮B0DIPY。
[0069]核磁及質(zhì)譜表征：
[0070] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5=1.44(s,6H),2.47(s,12H),6.21(s,2H),6.63(s,2H), 7.56(d ,J = 8Hz,2H),7.95(d ,J = 8Hz,2H),10.07(s,lH)
[0071] ESI-MS:calculated for[M-H]_ = 471.2,found 471.2〇
[0072] (4)將偶氮B0DIPY(15g)溶解于CH30H(30mL)中，然后加入PdCl 2(30g)，室溫?cái)嚢柽^ 夜，過濾得黃色固體。
[0073]核磁表征：
[0074] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5 = 1.50(s,6H) ,2.20(s,6H) ,2.47(s,6H),6.23(s,2H), 6.60(s，2H)，7.35(d，J = 8Hz，lH)，7.56(s，lH)，8.12(d，J = 8Hz，lH)，9.75(s，lH)。
[0075] 實(shí)施例3
[0076] 本發(fā)明與實(shí)施例1相同，不同之處在于：將2,4_二甲基吡咯改為2，3,4_三甲基吡 咯。
[0077] 實(shí)施例4
[0078] 本發(fā)明與實(shí)施例1相同，不同之處在于:將2，4-二甲基吡咯改為2，4-二甲基-3-乙 基吡咯。
[0079] 實(shí)施例5
[0080] 本發(fā)明與實(shí)施例1相同，不同之處在于:將2，4-二甲基吡咯改為2，4-二甲基-3-吡 咯甲酸乙酯。
[0081 ]效果試驗(yàn)：
[0082] 1 ·分別用5 · ΟμΜ實(shí)施例 1 的探針ACP-⑶對0，10，20，30，40，50，60，70，80和90μΜ CR0M-2進(jìn)行熒光響應(yīng)測試，得到探針ACP-C0的熒光強(qiáng)度和C0RM-2濃度變化的關(guān)系；實(shí)驗(yàn)條 件：激發(fā)/發(fā)射波長= 495/512nm，50mM PBS/DMS0(pH 7 · 4，7:3，v/v)，37°C下孵育20min。橫 坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。探針的激發(fā)波長為495nm，發(fā)射波長為512nm，測試效 果顯示如圖1，可以看出，在512nm處熒光隨著C0RM-2濃度增大，熒光逐漸增強(qiáng)?？梢哉f明本 探針可以用于C0的檢測，其孵育時(shí)間僅為20min，時(shí)間短，檢測速度快。
[0083] 2.本發(fā)明實(shí)施例1的探針ACP-C0的選擇性實(shí)驗(yàn)。將5. ΟμΜ的探針ACP-C0分別與不同 的生物活性物質(zhì)如活性氧.〇H、HS-和巰基小分子Hcy、Cys、GSH以及還原性 物質(zhì)Vc、Fe 2+孵育，將其熒光強(qiáng)度與探針孵育C0RM-2對比。測試結(jié)果如圖2,可以說明本發(fā)明 的探針ACP-C0的選擇性高，其它生物活性小分子不干擾。
[0084] 3.本發(fā)明實(shí)施例1的探針ACP-⑶的相對熒光強(qiáng)度和⑶RM-2的濃度的工作曲線，如 圖3;橫坐標(biāo)為C0RM-2的濃度，縱坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度。
[0085] 4 .本發(fā)明實(shí)施例1的探針ACP-⑶對人肝癌細(xì)胞（HepG2)的激光共聚顯微成像； HepG2細(xì)胞由高糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像前，細(xì)胞貼壁于蓋玻片上，然后加入5μΜ探針的 PBS緩沖液，37°C孵育10分鐘，加入200μΜ C0RM-2,然后進(jìn)行激光共聚焦顯微成像。其結(jié)果如 圖4,圖a為405nm激光器激發(fā)下采集430-480nm的細(xì)胞核染料DAPI的細(xì)胞成像圖，可以觀察 到細(xì)胞核被染色，細(xì)胞保持很好的活性。圖b為488nm激光器激發(fā)下采集500-550nm的細(xì)胞成 像圖，探針ACP-C0其在細(xì)胞質(zhì)有明顯的染色。圖c為圖a與圖b的疊加圖，圖d為細(xì)胞明場圖， 以表明細(xì)胞在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中仍保持良好的細(xì)胞活力。
[0086]上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對發(fā)明保護(hù)范圍 的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需 要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測細(xì)胞內(nèi)CO的熒光探針，其特征是，結(jié)構(gòu)式如下：其中，R為 H、-CH3、-CH2CH3 或-COOEto2. -種檢測細(xì)胞內(nèi)CO的熒光探針的制備方法，其特征是，將對硝基苯甲酰氯、二甲基吡 咯和三氟化硼乙醚，或?qū)ο趸郊柞Ｂ?、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反?yīng)生成硝基 苯基氟硼二吡咯，然后將硝基苯基B0DIPY中的硝基還原成氨基，再加入亞硝酸鹽和3,5-二 甲基苯酚偶氮化反應(yīng)，最后加入鈀鹽進(jìn)行環(huán)鈀化反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物，即檢測細(xì)胞內(nèi)C0的熒 光探針。3. 如權(quán)利要求2所述的一種檢測細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針的制備方法，其特征是，步驟如 下： (1) 將對硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或?qū)ο趸郊柞Ｂ群投谆量┭苌锶芙庥?溶劑1中，加熱回流后冷卻，加入溶劑2,加入三氟化硼乙醚升溫反后得到5,5_二氟_1，3,7， 9-四甲基-10-(4-硝基苯基)-5Η-4λ 4,5λ4-二吡咯[1，2-(：:2'，1'-幻[1，3,2]二氮雜硼，即硝 基苯基B0DIPY; (2) 將硝基苯基B0DIPY和甲酸銨溶于溶劑中，然后加入Pd/C攪拌反應(yīng)后即得氨基苯基 B0DIPY； (3) 將氨基苯基B0DIPY和濃鹽酸溶于溶劑中，加入亞硝酸鹽溶液，攪拌后，加入3，5-二 甲基苯酚的堿溶液攪拌后得到偶氮B0DIPY; (4) 將偶氮B0DIPY染料溶解于溶劑中，然后加入PdCl2,室溫?cái)嚢柽^夜后，即得檢測細(xì)胞 內(nèi)C0的熒光探針。4. 如權(quán)利要求3所述的一種檢測細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針的制備方法，其特征是，所述步驟 (1) 的具體步驟為:將對硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或?qū)ο趸郊柞Ｂ群投谆量┭苌?物解于CH2C1 2中，加熱回流1-2h，冷卻后加入三乙胺、甲苯，待反應(yīng)10-20分鐘后加入三氟化 硼乙醚，升溫至50-60°C反應(yīng)2-4小時(shí)，旋干，用色譜柱分離，所得固體即硝基苯基B0DIPY; 所述的硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯或二甲基吡咯衍生物、三乙胺、甲苯、三氟化硼乙醚 及 CH2CI2 的用量比為 7-10:7-20:3.5-5.5:30-50:3-6:20-50，g:g:mL:mL :mL:mL;色譜柱分離 洗脫劑比例為Va鍵:4-6:1。5. 如權(quán)利要求3所述的一種檢測細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針的制備方法，其特征是，所述步驟 (2) 的具體步驟為:將硝基苯基B0DIPY、甲酸銨溶于CH2C12，然后加入Pd/C，常溫?cái)嚢?-3小時(shí) 后過濾，將濾液旋干得氨基苯基B0DIPY;所述的硝基苯B0DIPY、甲酸銨、Pd/C、CH 2C12的用量 比例為：5~10:50~70:1~5:10-30，g:g:g:mL。6. 如權(quán)利要求3所述的一種檢測細(xì)胞內(nèi)CO的熒光探針的制備方法，其特征是，所述步驟 (3) 的具體步驟為:將氨基苯基B0DIPY、濃鹽酸溶于DMF中，加入亞硝酸鈉水溶液，在0-5 °C下 攪拌3_4h，然后將其緩慢滴加到3，5-二甲基苯酚的NaOH溶液中，在0-5°C下攪拌4-5h，過濾 后的濾渣色譜柱分離，得黃色固體偶氮B0DIPY; 所述的氨基苯基B0DIPY、濃鹽酸、DMF、亞硝酸鈉、3,5-二甲基苯酚、似0!1、水的用量比為 1-3:3-5:10-15:3-5:3-5:4-8:20-30，g:mL:mL:g :g:g:mL;色譜柱分離洗脫劑比例為 Vn甲焼： V? 麵=1_3:2〇7. 如權(quán)利要求3所述的一種檢測細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針的制備方法，其特征是，所述步驟 (4) 中的溶劑為0130!1;所述的偶氮肋01?￥、0130!1、？(1(：1 2的用量比例為5~10:10~30:10~ 20，g:mL:g〇8. -種如權(quán)利要求1所述的檢測細(xì)胞內(nèi)CO的熒光探針在檢測細(xì)胞內(nèi)CO中的應(yīng)用。9. 一種檢測細(xì)胞內(nèi)C0的方法，其特征是，步驟為： (1) 將權(quán)利要求1所述的檢測細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針溶解于生理鹽水、緩沖或者培養(yǎng)液 中，配制成儲備液儲存待用； (2) 將步驟(1)中的儲備液加入含有細(xì)胞組織的適當(dāng)緩沖液進(jìn)行測試。10. -種檢測活細(xì)胞內(nèi)C0的方法，其特征是，步驟為： (1) 將含有權(quán)利要求1所述的檢測細(xì)胞內(nèi)C0的熒光探針的緩沖溶液5-10μΜ加入培養(yǎng)好 的細(xì)胞放于培養(yǎng)箱是孵育8-12分鐘； (2) 將細(xì)胞用生理PBS緩沖液洗去多余的探針，然后進(jìn)行激光共聚焦顯微成像，如果是 檢測內(nèi)源性物質(zhì)，剛是直接進(jìn)行共聚焦成像，而如果是外加檢測的，剛是加了待檢測物質(zhì) 后，再次孵育8-12分鐘，然后進(jìn)行成像。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測細(xì)胞內(nèi)CO的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，一種檢測細(xì)胞內(nèi)CO的熒光探針，結(jié)構(gòu)式如下：其中，R為H、-CH3、-CH2CH3或-COOEt。本發(fā)明合成新型環(huán)鈀基團(tuán)能夠?qū)O的響應(yīng)性更快更靈敏，其與BODIPY結(jié)合后不僅提高了對CO的選擇性，而且實(shí)現(xiàn)更快更靈敏的檢測CO。其制備方法是對硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，或?qū)ο趸郊柞Ｂ?、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反?yīng)生成硝基苯基氟硼二吡咯(硝基苯基BODIPY)，然后將硝基苯基BODIPY中的硝基還原成氨基，再加入亞硝酸鹽和3,5-二甲基苯酚偶氮化反應(yīng)，最后加入鈀鹽進(jìn)行環(huán)鈀化反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物，即檢測細(xì)胞內(nèi)CO的熒光探針(ACP-CO)。本發(fā)明合成方法簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C12Q1/02, C09K11/06, G01N21/64, C07F15/00
【公開號】CN105623647
【申請?zhí)枴緾N201610069351
【發(fā)明人】唐波, 王栩, 李勇, 解希雷, 李萌萌
【申請人】山東師范大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年1月29日