專利名稱：：具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物降解
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別地，涉及一種新苯胺降解菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：苯胺作為化學(xué)合成的芳香族化合物的典型代表，是重要的化工原料和精細(xì)化工中間體，由其制得的化工產(chǎn)品和中間體有300多種，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、印染、塑料等行業(yè)。目前，國(guó)內(nèi)每年生產(chǎn)苯胺80，000t以上，全世界每年排入環(huán)境中的苯胺約為30，000t。環(huán)境中所含的苯胺類污染物主要來(lái)自制藥、橡膠及其他許多化工廠的廢水中。苯胺是高毒高殘留物質(zhì)，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及其他臟器的損害，能與血紅蛋白結(jié)合成高鐵血紅蛋白，使其與氧結(jié)合能力下降而導(dǎo)致動(dòng)物中毒，同時(shí)被證實(shí)具有致癌性，是一種對(duì)人類構(gòu)成嚴(yán)重危害的物質(zhì)，已被美國(guó)EPA列為優(yōu)先控制的129種污染物之一，也被列入"中國(guó)環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單"中，工業(yè)排水中要求嚴(yán)格控制。世界各國(guó)科學(xué)家都十分重視對(duì)苯胺類污染物降解的研究，而生物降解具有效率高、成本低、反應(yīng)條件溫和以及無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是從廢水中去除苯胺類污染物的重要途徑之一。目前，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)苯胺的生物降解已開(kāi)展了大量研究工作，國(guó)內(nèi)外已分離到一些在好氧或厭氧條件下降解苯胺的細(xì)菌，主要有/^ew^/^/7as，等。大量研究表明從環(huán)境中分離篩選高效的苯胺降解菌，仍然是消除環(huán)境中苯胺污染的重要環(huán)節(jié)。本發(fā)明中的無(wú)色桿菌屬力c力ro/z7^a"er是活性污泥菌膠團(tuán)中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌之一。經(jīng)檢索專利和其他相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)利用無(wú)色桿菌屬JcAro;^&"er降解苯胺的報(bào)道。該降解菌的發(fā)現(xiàn)對(duì)工業(yè)廢水中苯胺類污染物的高效凈化具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容3本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株高效、耐受能力強(qiáng)的具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌，它的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。該菌屬于無(wú)色桿菌屬JcArcOTC^actersa，與JcArcffic^acterj^'ecAswo^'j'的同源性最高，申i青人4各其編號(hào)為adx-3，菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，凸?fàn)盥∑?。電鏡觀察，大小為(0.50.7)iimX(0.91.2)nm，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢菌；電子顯微鏡下觀察該菌體的形態(tài)為稍粗桿菌，革蘭氏染色陰性，氧化酶、過(guò)氧化氫酶陰性，硝酸鹽還原產(chǎn)氣。本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明的Jc力r，Wscfaradx-3用于污水體系中苯胺的降解，不僅有很高的降解效率和耐受濃度，同時(shí)^!c力ro/^^cferadx-3具有很好的自絮凝特性，污水處理中可發(fā)揮重要作用，增強(qiáng)系統(tǒng)的耐沖擊性。本發(fā)明的Jc力romc^a"ersaadx-3取自廢水處理單元，是廢水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌種，能適應(yīng)復(fù)雜的實(shí)際條件，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。木發(fā)明的具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌已于2008年10月29日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M208176。圖1為本發(fā)明的菌/^力M膨Z73c&r柳adx-3透射電鏡照片；圖2為本發(fā)明的菌Jc/ro歷oZac^rsaadx-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖；圖3為本發(fā)明的菌Jc力ro歷c^s"6^adx-3對(duì)不同初始濃度的苯胺的降解曲線；圖4為不同溫度下菌v4c力2YMo/^c"r邵.adx-3對(duì)苯胺的降解曲線；圖5為不同pH值下菌ZcArazoZ7ac砂.adx-3對(duì)苯胺的降解曲線。具體實(shí)施例方式本發(fā)明所的具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌為Jc力2y/^&"ersaadx-3。所述的Zc/ro歷oZ7a"er邵.adx-3來(lái)源于煉化污水處理廠曝氣池中的活性污泥中，經(jīng)馴化、分離、純化獲得，能以苯胺為唯一碳源和氮源。該菌屬于無(wú)色桿菌屬y4c力rowoZ^cter,與爿c/rcw7c^acter/iecAg〃c//2的同源性最高，申請(qǐng)人將其編號(hào)為adx-3，菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，凸?fàn)盥∑稹ｋ婄R觀察，大小為(0.50.7)umX(0.91.2)um，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢菌；電子顯微鏡下觀察該菌體的形態(tài)為稍粗桿菌(圖1)，革蘭氏染色陰性，氧化酵、過(guò)氧化氫酶陰性，硝酸鹽還原產(chǎn)氣；Jc力2^K^s"erw.adx-3的16Sr腿具有SEQIDNo.1的序列；爿c/LTOMAgcfer5^.adx-3的Genebank的登錄號(hào)為FJ169468;圖2為該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。所述//c力r咖Ws"er砂.adx-3已于2008年10月29日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M208176。本發(fā)明的t力r，o》a"er柳adx-3可用于工業(yè)廢水體系中苯胺的降解，具體方法可為將Jc力ro歷o^"ersaadx-3懸浮于含苯胺或其衍生物的污水中，在15-45°C，pH值為5-10的條件下培養(yǎng)。所述Jc力7Y^o^s"eradx-3在污水中的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為30-35°C，最佳為30。C，pH值條件優(yōu)選為pH7-pH8，最佳為pH8。以上述adx-3為活性成分的生物菌劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；該菌劑中可根據(jù)需要，添加可接受的輔料。本發(fā)明的Jc力r湖o&cter5aadx-3，當(dāng)投菌量為0.01g/L(按干重生物量計(jì)算)時(shí)，在30°C，180r/min，PH為7.2的條件下，對(duì)初始濃度為50-4000mg/L的苯胺均可完全降解，其最高耐受濃度達(dá)4500mg/L。下面根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，木發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1.^c力r咖Macfersp.adx-3的分離、純化及其鑒定1.爿c力r0歷0Z7ac力er5;.adx—3白勺分離及纟屯ik/(c/ro膨^3c^r柳adx-3是從浙江鎮(zhèn)海煉化污水處理廠曝氣池的活性污泥中取樣，經(jīng)馴化、分離及純化得到的一株革蘭氏陰性菌。具體步驟如下取浙江鎮(zhèn)海煉化污水處理廠曝氣池的活性污泥。在500mL錐形瓶中加入50mL污泥與50mL馴化培養(yǎng)液(0.024g/LKH2P04，0.024g/LNa異，0.0696g/LMgS047H20，0.022g/LCaCl22H20，0.005g/LFeCl"0.00003g/LCuS04H20，0.00013g/LMnS04H20，0.00023g/LZnCl2，0.00042g/LCoCl6H20，0.00015g/LNaMo042H20，0.00005g/LA1C136H20)，以及0.049mL苯胺(500mg/L)。每5d置換50mL培養(yǎng)液，加入O.049mL苯胺，并調(diào)pH為7.5左右，馴化30d。取5mL污泥與20mLMM培養(yǎng)液(O.24g/LKH2P04，0.24g/LNa2HP04，0.0696g/L5MgS04*7H20，0.022g/LCaCl22H20，0.005g/LFeCl3，0.00003g/LCuS04H20，0.00013g/LMnS04H20，0.00023g/LZnCl2，0.00042g/LCoCl6H20，0.00015g/LNaMo042肌0.00005g/LA1C136H20，121°C，20min滅菌)到250mL錐形瓶中，加入若干玻璃珠，搖床3(TC，180rpm/min振蕩lh，取振蕩后上清液，用滅菌去離子水稀釋10—10—7倍，各取0.lmL稀釋液于含苯胺200mg/L的麗固體培養(yǎng)基(上述麗培養(yǎng)基中加入1.5-2%瓊脂制得)平板上稀釋涂布，3CTC培養(yǎng)。4d后取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接入含苯胺200mg/L的MM液體培養(yǎng)基，取對(duì)苯胺有降解效果的菌株在平板上劃線分離，如此分離純化幾次，得到高效降解苯胺的純菌JcArajWoZ^cz^r5^.adx_3。JcAra歷oZscter5/.adx—3的透身才電lt照片如圖l所示?！筩力ro/z7o&jcter邵.adx-3菌株的生理生化特性如表1所示。表1.^c力ro^^s^er邵.adx-3菌株的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.JcAra^^s"er卬.adx-3的16SrDNA鑒定通過(guò)16SrRNA序列分析和Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，確定adx-3菌屬于無(wú)色桿菌屬JcAro邁oZa"ar。具體步驟如下以采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司的)提取和純化DNA。PCR擴(kuò)增，選用細(xì)菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20，引物序列分別為BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，PCR反應(yīng)程序設(shè)定為先94。C預(yù)變性4min;然后94。C變性1min，59。C退火lmin，72'C延伸1.5min，循環(huán)35個(gè)周期；然后72°C延伸10min;最后4°C保持10min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(華大基因)，測(cè)序得到SEQIDNo.1的序列。將爿c力ro膨力scter印.adx-3的16SrDNA測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明它與^c力iTMo6a"erA-ec力aw/z'j'(ABO10841)和Jc/^o范o&"er印a//ws(AY170848)同源性最高，圖2為該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。通過(guò)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)的分析，確定A^ro/z/o6sc/:er5^.adx-3屬于Jc/r譜。yfecter柳。將該菌命名為y4c力ro膨Zs"eradx-3。實(shí)施例2.Jc力r，o力s"eradx-3對(duì)苯胺降解性能檢測(cè)1.在以苯胺為唯一碳、氮源的條件下，考察adx-3對(duì)不同苯胺初始濃度的降解能力。發(fā)現(xiàn)當(dāng)苯胺初始濃度不超過(guò)4000mg/L時(shí)，adx-3對(duì)苯胺有較好的去除效果，當(dāng)苯胺濃度達(dá)4500mg/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)受抑制，120h內(nèi)苯胺降解率為25%左右。同時(shí)，隨著苯胺初始濃度的增加，降解抑制期變長(zhǎng)，降解期的苯胺降解速率變快。具體歩驟如下1)從固體培養(yǎng)基上接菌adx-3到含苯胺500mg/L的MM培養(yǎng)液中，3(TC，180rpm/min搖床培養(yǎng)24h，使其0D6。。=1.2±0.05。2)在14個(gè)裝有50mLMM培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中分別加入苯胺，其終濃度分別為50，100，200，300，500，700，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500mg/L。然后分別將步驟1)培養(yǎng)得到的菌懸液以干菌體接種量為0.01g/L(干重法測(cè)定)接種于上述錐形瓶中，30°C，180rpm/min搖床中振蕩培養(yǎng)。3)在步驟2)所述的培養(yǎng)過(guò)程中，定期取樣測(cè)定苯胺濃度和菌液濃度。苯胺濃度測(cè)定采用AgilentTechnologies1200SeriesHPLC分析。檢測(cè)條件EclipseXDB-C18反相柱(5iim，4.6X150mm);檢測(cè)波長(zhǎng)230nm;流動(dòng)相為0.2mL/L磷酸溶液/甲醇=75/25;流速0.8mL/min;進(jìn)樣量5uL;柱溫30。C。菌濃度測(cè)定JH722S可見(jiàn)分光光度計(jì)，在吸收波長(zhǎng)600nm處檢測(cè)菌液吸光度。苯胺濃度變化曲線如圖3中的a、b，苯胺初始濃度為504000mg/L的培養(yǎng)8液中，^c力roM^ac^r印.adx-3菌可較好降解苯胺，但各苯胺初始濃度條件下，抑制期的長(zhǎng)短和降解速率不同。隨著苯胺初始濃度的升高，抑制期時(shí)間變長(zhǎng)，說(shuō)明苯胺初始濃度越高，細(xì)菌適應(yīng)越慢。但一旦進(jìn)入降解期，苯胺初始濃度高的培養(yǎng)液中微生物降解速率快，這是因?yàn)榫晖耆m應(yīng)了生長(zhǎng)環(huán)境，高濃度的苯胺給菌株提供更充足的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)從事生命活動(dòng)并大量繁殖，而細(xì)菌數(shù)量增大后，所需的碳、氮源多，苯胺的降解速率相應(yīng)提高，二者相互促進(jìn)。菌濃度變化曲線如圖3中的c、d所示，可以看出，菌濃度隨著苯胺的降解逐漸升高。隨著苯胺初始濃度的升高，培養(yǎng)液中的碳、氮源的量變大，最大菌濃度遞增。但是這種增長(zhǎng)并不成正比，這說(shuō)明，A^ro/ffoybacters/.adx-3的生長(zhǎng)的限制因素不僅有苯胺的濃度，還有其它的因素。2.爿c/2YM7o/acferadx-3菌在不同纟顯度下的降解f寺性在不同溫度下實(shí)施降解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)adx-3菌在3035'C具有較高的苯胺去除率，從實(shí)際應(yīng)用的角度看，選擇3(TC較為適宜。具體步驟如下分取50mL應(yīng)培養(yǎng)液至6個(gè)250mL錐形瓶中，加入500mg/L苯胺后，將步驟1中的步驟1)制備得到的Jdro/^fe"erack-3菌懸液以干菌體接種量為0.01g/L接種于該培養(yǎng)液中，分別置于15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C的搖床中培養(yǎng)。取0h和15h的樣品，計(jì)算去除率。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，15。C時(shí)15h內(nèi)苯胺去除率最低，約30%，20°C、25。C時(shí)去除率稍高，65%左右，30°C、35"C時(shí)的去除率最高，在95%左右，達(dá)4(TC時(shí)去除率下降，約70%。這說(shuō)明細(xì)菌最適生長(zhǎng)、降解溫度處于3035°C之間，考慮到污水處理工藝的實(shí)際情況，adx-3菌的培養(yǎng)溫度選擇3(TC較為合理。3.爿cAra歷o/acz^r57.adx-3菌在不同pH值下的降解特性由不同起始pH值條件的降解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)adx-3菌的最適降解pH值為8。具體步驟如下在6個(gè)250mL錐形瓶中裝如50mLMM培養(yǎng)液，分別調(diào)節(jié)pH至5、6、7、8、9、10，將步驟l中的步驟l)制備得到的A7力r^o&"enAadx-3菌懸液以干菌體接種量為0.01g/L接種于培養(yǎng)液中，并分別加入苯胺500mg/L，30°C，180rap/min搖床中振蕩培養(yǎng)。取0h和15h的樣品，計(jì)算去除率。結(jié)果如圖5所示，pH值為5時(shí)，苯胺去除率最低，只有15%左右，隨pH值升高至8，去除率提高到95%，當(dāng)pH值為9時(shí)，去除率略有下降，約為80%，當(dāng)pH值為10時(shí)，去除率僅為40%左右。具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌的16SrDNA基因序列SEQIDNo.1表SEQUENCELISTING<110>浙江工業(yè)大學(xué)〈120>具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌及其應(yīng)用〈160〉1〈170>Patentlnversion3.1〈210〉1<211>1445<212>DNA<213>Achromobactersp<400>1ccttacacatgc3agtcg犯cggcagcacggacttcggtxtggtggcgagtggcgaacgg60gtgagtaatgt3tCgg6L6lCgtgcccagtagcgggggataactacgcgaaagcgtagctaa120taccgcatacgccctacggggg認(rèn)gcaggggatcg固gaccttgcactattggagcgg180ccgatatcggattagctagttggtggggt3acggctcacc卿gcgacgatccgtagctg240gtttg卿ggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggc300觀cagtggggaattttggacaatgggggaaacccLgatccagccatcccgcgtgtgcgat360gsaggccttcgggttgta肌gcacttttggacgtcatgggttaatacccc420gtgaaactgacggtacctgcagaateagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggta480atacgtagggtgcaagcgttactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggttcg540cagagcttaactttggaactgcatttttaactaccgggct600卿gtgtgtc卿gg鵬gtggaattccgcgtgtagcagtg朋atgcgtagatatgcgga660gg肌cetccgatggc,ggcagcctcctgggataacactgacgctcatgcacgaaagcgt720gggg3gcaaacsggattagataccctggtagtccacgccctaaacgstgtcaactagctg780ttggggtcttcggaccttggtsgcgcagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtac840ggtcgca卿ttaaaactca.Cgggg3CCCgcacaagcggtggatgatgtg900gattaattcgatgcaacgcgcctacccttgacatgtctggaattccgaag960已gatttgga已gtgctcgceiag卿accggaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctc1020gtgtcgtgsgatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctac1080ga朋gggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggeigg肪ggtggggatgacgtcaa1140gtcctcatggcccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcggg織gagggtc1200gcc犯cccgcg郷ggg鄉(xiāng)caatcccagaaacccgatcgtagtccggatcgcagtctgc1260aactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagteatcgcggatcagcatgtcgcggtgaata1320cgttcccgggtcttgtacaca.ccgcccgtc3C3CC3tgggagtgggttttaccagaagta1380gttagcctaaccgtaaggggggcgattaccacggtaggattcatgactggggtgaagtcg1440aacaa144權(quán)利要求1.一種具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌，其特征在于，它的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM208176。2.權(quán)利要求1所述具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌在降解苯胺類污染物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的降解苯胺類污染物為降解污水中苯胺類物質(zhì)及其衍生物，具體方法為將無(wú)色桿菌懸浮于含苯胺類物質(zhì)及其衍生物的污水中，在溫度為15-4(TC，pH值為5-10的條件下培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述無(wú)色桿菌在污水中的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為28-35°C，pH值條件為7-8。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述無(wú)色桿菌在污水中最佳培養(yǎng)溫度為30°C，最佳pH值條件為8。6.—種以權(quán)利要求1所述具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌為活性成分的生物菌劑。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種具有苯胺降解能力的無(wú)色桿菌，它的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，凸?fàn)盥∑?。電鏡觀察，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢菌；電子顯微鏡下觀察該菌體的形態(tài)為稍粗桿菌，革蘭氏染色陰性，氧化酶、過(guò)氧化氫酶陰性，硝酸鹽還原產(chǎn)氣。本發(fā)明可在好氧條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)苯胺類污染物的高效降解，且對(duì)苯胺的最高耐受濃度可達(dá)4500mg/l，對(duì)濃度≤4000mg/l的苯胺可實(shí)現(xiàn)完全去除，將在苯胺類工業(yè)廢水治理實(shí)踐中發(fā)揮重要作用。文檔編號(hào)C02F101/38GK101514330SQ20081016316公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2008年12月18日優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日發(fā)明者向正心,姜理英,張麗麗,陳建孟申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)