專利名稱：：將液體介質(zhì)與蛋白質(zhì)分離的方法將液體介質(zhì)與蛋白質(zhì)分離的方法本發(fā)明涉及用于將蛋白質(zhì)與液體介質(zhì)分離的方法。如今，借助于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成功地大規(guī)模產(chǎn)生生物活性物質(zhì)。建立的方法使得既能產(chǎn)生用于工業(yè)應(yīng)用、例如如食品生產(chǎn)的酶又能產(chǎn)生藥學(xué)上重要的重組蛋白質(zhì)。這涉及通過微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生并然后從培養(yǎng)基或細(xì)胞分開而制備的靶標(biāo)蛋白質(zhì)。這種生產(chǎn)過程分為用上游培養(yǎng)基制備物發(fā)酵和用于純化靶標(biāo)蛋白質(zhì)的系列下游步驟。蛋白質(zhì)純化過程的步驟的花費(fèi)通常超過總生產(chǎn)費(fèi)用的80%。純化通常涉及色鐠方法的使用，以便在生產(chǎn)流程中首先濃縮靶蛋白質(zhì)以及其次分離異種蛋白質(zhì)和其它污染物，例如內(nèi)毒素、病毒或DNA。如果色譜材料用了幾次，則必須不斷檢測(cè)它們的分離性能或可能的微生物污染。確認(rèn)和純化的花費(fèi)可以通過使用一次性材料而部分減少。為了成功地得到采用，這樣的一次性色譜材料必須可重復(fù)地產(chǎn)生高的分離性能以及要求耗費(fèi)的每個(gè)單位的低的投資。其對(duì)所關(guān)注的靶蛋白質(zhì)或干擾污染物應(yīng)該具有高的結(jié)合能力和快速的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。膨潤(rùn)土，以及更特別是它們的主要礦物成分蒙脫石，適于蛋白質(zhì)的可逆結(jié)合。膨潤(rùn)土以及其它相當(dāng)?shù)钠瑺罟杷猁}在此充當(dāng)天然的陽離子交換劑并且可以在低于它們的等電點(diǎn)的pH值下吸附蛋白質(zhì)。然而，鈉膨潤(rùn)土具有在水中充分膨脹的性質(zhì)。將數(shù)克鈉膨潤(rùn)土引入至水溶液中導(dǎo)致粘度大大增加，使得該液體介質(zhì)的處理更加困難。而且，因?yàn)槌浞值呐蛎洏O大地增加了過濾組合件或柱填充物的體積，由此阻塞了過濾器或柱，因此鈉膨潤(rùn)土在色譜柱中作為過濾介質(zhì)或用作填充物的使用非常復(fù)雜。因而，到目前為止唯一可能的工業(yè)應(yīng)用包括在每種情況下將鈉膨潤(rùn)土分批加入至待純化的液體介質(zhì)中，并在吸附蛋白質(zhì)后，再通過過濾分離所述膨潤(rùn)土或通過將純化的液體介質(zhì)擠出膨潤(rùn)土而將其分離。C.Buttersack，K.Novikow，A.Schaper和K.Buchholz(Zuckerind.119(1994)，No.4，pp,284-291)報(bào)道了片狀硅酸鹽用于從均質(zhì)化的甜菜濾過汁液分離酶的用途。通過吸附至鈉膨潤(rùn)土并隨后用pH緩沖液解吸而以簡(jiǎn)單的方式分離純的酶。研究證明，片狀礦物質(zhì)十分適于分離或濃縮蛋白質(zhì)。然而，處理這些片狀礦物質(zhì)是復(fù)雜的，因?yàn)樗鼈兇蟠笤黾恿怂械膽腋∫旱恼扯龋殡S著所述的片狀礦物質(zhì)崩解產(chǎn)生非常小的顆粒。因而通過將該片狀材料填充到柱中，然后將含有蛋白質(zhì)的流體經(jīng)過該柱的方式濃縮蛋白質(zhì)是非常困難的。如果沒有輔助措施，該柱因?yàn)槠瑺畹V物質(zhì)重復(fù)地膨脹而相對(duì)快地被阻塞。然而為了使得酶從柱中分離，作者提出將鈉膨潤(rùn)土包埋在藻酸鈣凝膠中。將加氫的勻漿液在pH=5.0下用泵經(jīng)過用固定化的膨潤(rùn)土珠粒填料的柱。在未吸附級(jí)分離開該柱后，用調(diào)節(jié)至pH-8的緩沖溶液洗脫酶。如作者所述，由于產(chǎn)生了高的費(fèi)用，固定于藻酸鈣中的鈉膨潤(rùn)土的使用不太適用于蛋白質(zhì)的工業(yè)化分離。DE1160812Al描述了使用大孔硅膠作為吸收劑增加啤酒的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法。嘩酒^1細(xì)磨的硅膠處理，所述硅膠具有200至400m7g的表面、大于0.6ml/g的孔體積和大于60A的孔直徑。GB752,669描述了將含硅污染物與含有胰島素的溶液分離的方法。在生產(chǎn)胰島素期間，后者可以通過將其吸附至二氧化硅或粘土以使得溶劑被分離而與有機(jī)溶液分離。然后可以用強(qiáng)堿水溶液再次洗脫所述胰島素。然而由于強(qiáng)堿pH，水胰島素溶液被從吸收劑脫離的含硅污染物污染。所述污染物是膠質(zhì)的，因而使得它們難以通過過濾分離。為了分離這些污染物，人們提出將水溶液調(diào)節(jié)至從6.5到9.0的pH，并隨后保持。沉淀形成，其可以容易地通過過濾分離。US4，605，621描述了用于固定化酶的方法，其中酶與有機(jī)改性的粘土反應(yīng)。使用的粘土是蒙脫石、鋰蒙脫石或蛭石，在粘土中至少部分陽離子被鎮(zhèn)離子和/或有機(jī)金屬陽離子替代，使得該粘土具有疏水性質(zhì)。US4,126,605描述了用于制備Y-球蛋白的方法，其中從血漿獲5得的Y-球蛋白級(jí)分被進(jìn)一步純化。為此，首先將Y-球蛋白吸收于含有水膠體例如羥乙基淀粉、明膠、右旋糖或白蛋白的水溶液中并用緩沖液調(diào)節(jié)pH的范圍為3.5至8.0。該溶液可以進(jìn)一步通過將其與粘土礦物質(zhì)的懸浮液混合而純化?？梢允褂玫恼惩恋V物質(zhì)是(例如)膨潤(rùn)土或蛭石。通過加入大約10重量％的量的有機(jī)溶劑、例如聚乙二醇，沉淀出基本含有污染物的第一級(jí)分?？梢岳缤ㄟ^離心而分離所述部分。然后在大約7.0-7.2的pH下加入最多16-24重量％的比例的更多有機(jī)溶劑。在該過程中，沉淀出非常純的Y-球蛋白級(jí)分，可隨后例如通過離心而分離該級(jí)分。EP0071647Al描述了用于將干擾素與水溶液分離的方法。為了該目的，將該溶液與含有硅酸的組合物混合?？梢允褂玫倪@種組合物的例子是膨潤(rùn)土、酸性粘土、高嶺土或硅酸鋁鎂。干擾素被該組合物吸附并可以用含有非離子表面活性劑的水溶液洗脫。合適的表面活性劑的例子是脫水山梨糖醇單烷基酯、多烷基酯或聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物。近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一類新的粘土材料，其具有非常好的關(guān)于生物分子吸附的性質(zhì)。這些材料，類似先前使用的粘土，是風(fēng)化的產(chǎn)物。然而，它們不再顯示出任何結(jié)晶性質(zhì)并因而是x-射線非晶形的。與先前使用的粘土比較，它們具有非常高比例的SiOz和非常高的孔體積。與例如鈉膨潤(rùn)土相反，它們?cè)谒胁慌蛎洝Ｔ诒旧暾?qǐng)的優(yōu)先權(quán)日期后公開的DE102005012639Al描述了利用這樣的粘土材料來將干擾生物分子與液體介質(zhì)分離的方法。因而，例如，這樣的粘土材料適用于使酒澄清或用于穩(wěn)定嘩酒。本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種可以、甚至是在工業(yè)規(guī)模上、用于將蛋白質(zhì)成功地從液體介質(zhì)分離的方法，并且在優(yōu)選的實(shí)施方案中，也應(yīng)該可以回收分離的蛋白質(zhì)，而后者不受到活性的不適當(dāng)喪失。該目標(biāo)通過具有權(quán)利要求1的特征的方法實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明方法的有利進(jìn)展是從屬權(quán)利要求的主題。本發(fā)明方法通過以下步驟將蛋白質(zhì)與液體介質(zhì)分離-提供含有蛋白質(zhì)的液體介質(zhì)，-提供粘土材料，其具有-大于150m7g的比表面。-大于0.35ml/g的孔體積。-大于40meq/100g的離子交換能力，以及-少于15ml/2g的水中沉降體積，-平衡所述粘土材料至pH為3.5至9.0。-用平衡的粘土材料處理所述液體介質(zhì)，并-將純化的、蛋白質(zhì)貧化的液體介質(zhì)與粘土材料分離。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)具有上述性質(zhì)的粘土材料能以工業(yè)應(yīng)用上感興趣的量結(jié)合蛋白質(zhì)。平衡所述的粘土材料至pH為3.5至9.0防止了吸附于該粘土材料上的蛋白質(zhì)的不可逆的失活或變性，從而使得所述蛋白質(zhì)能被回收，如果合適，不必接受它們活性的基本喪失。所述的平衡優(yōu)選以下面的方式進(jìn)行即用緩沖液處理粘土材料，所述緩沖液具有所關(guān)注的蛋白質(zhì)也是穩(wěn)定的并且不會(huì)受到過度失活的PH。對(duì)于所述的平衡，優(yōu)選使用隨后也用于純化液體介質(zhì)或所關(guān)注的蛋白質(zhì)的緩沖液。所述緩沖液優(yōu)選調(diào)節(jié)至大約與液體介質(zhì)中已經(jīng)調(diào)節(jié)到的pH相同。平衡時(shí)間取決于例如粘土材料的量或，如果所述粘土材料以填充物或柱的形式提供，取決于其維數(shù)(dimension)。如果柱非常小，則平衡時(shí)間可以、如果合適、僅為數(shù)秒，而對(duì)于非常大的柱或過濾組合件也可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間。平衡優(yōu)選進(jìn)行至少10秒，優(yōu)選至少30秒，特別優(yōu)選1—60分鐘。優(yōu)逸用待純化液體介質(zhì)或待純化蛋白質(zhì)還未加入的緩沖溶液進(jìn)行平衡。進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是用于本發(fā)明方法的粘土材料具有少于15ml/2g、優(yōu)選少于10ml/2g的低的沉降體積，即所述材料在水中僅可忽略地膨脹。由于粘土材料的低膨脹，待純化的且含有蛋白質(zhì)的液體介質(zhì)在將粘土材料加入至其中時(shí)粘度沒有顯示實(shí)質(zhì)性的增加。另外也可以將相對(duì)大的量的粘土材料引入至液體介質(zhì)中，以使得所關(guān)注的蛋白質(zhì)可以毫無問題地、甚至是與具有高的所述蛋白質(zhì)濃度的介質(zhì)分離。使用的粘土材料也可以毫無問題地通過過濾從所述液體介質(zhì)分離。由于低的膨脹度，該粘土材料不會(huì)阻塞過濾器。因此，當(dāng)濾掉蛋白質(zhì)貧化的液體介質(zhì)時(shí)僅需要相對(duì)低的壓力。使用的液體介質(zhì)原則上可以是任何來自生物源或含有蛋白質(zhì)的流體。該方法特別適用于從生物反應(yīng)器處理反應(yīng)混合物，以便以大的流體量分離或濃縮所關(guān)注的生物活性物質(zhì)。另一可能的用途是例如從體液例如尿或其它生物樣品分離蛋白質(zhì)。這使得蛋白質(zhì)能快速地從例如體液樣品分離和純化。為此目的，將樣品，例如體液或其它的含有蛋白質(zhì)的樣品加入到已經(jīng)預(yù)先平衡至合適的pH的粘土材料中。蛋白質(zhì)被吸附于粘土材料上，而液相可以分離。然后可以沖洗該粘土材料，優(yōu)選使用其PH大致對(duì)應(yīng)于含蛋白質(zhì)的液體介質(zhì)在施用至該粘土材料前已經(jīng)調(diào)節(jié)至的pH的緩沖溶液。這使得污染物能被洗掉，而蛋白質(zhì)保持吸附于粘土材料上并因而被進(jìn)"步純化。在沖洗步驟后，可以洗脫蛋白質(zhì)并然后將是濃縮的形式。如果合適，樣品必須以通常的方式、例如通過進(jìn)行粗過濾或通過緩沖樣品而制備。優(yōu)選將樣品緩沖至在平衡粘土材料期間已經(jīng)調(diào)節(jié)到的pH。這種樣品制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。推測(cè)為用于本發(fā)明方法的粘土材料充當(dāng)陽離子交換劑，伴隨堿金屬或堿土金屬離子從該粘土材料釋放并被蛋白質(zhì)所替代。蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)表面上含有帶電荷的氨基酸殘基，其能與粘土材料表面上的帶電荷的基團(tuán)相互作用。蛋白質(zhì)的凈電荷是圍繞所述蛋白質(zhì)的溶液的pH和所述蛋白質(zhì)的pl所決定的。蛋白質(zhì)的pl對(duì)應(yīng)于所述蛋白質(zhì)的凈電荷等于零時(shí)的pH。pl是蛋白質(zhì)的氨基酸組成和三級(jí)結(jié)構(gòu)所決定的。在酸性pH范圍內(nèi)，氨基酸(優(yōu)選強(qiáng)堿性氨基酸精氨酸、賴氨酸和組氨酸)質(zhì)子化，該蛋白表現(xiàn)出陽離子特征。在堿性pH艱圍內(nèi)，酸性基團(tuán)天冬酰胺和谷氨酰胺攜帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)是陰離子。蛋白質(zhì)和粘土材料之間的相互作用在接近等電點(diǎn)時(shí)很低，并隨著pH和pI之間差值增加而增加。因而優(yōu)選將介質(zhì)調(diào)節(jié)至與待分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差至少一個(gè)單位的pH。例如，如果蛋白質(zhì)具有5.5的pl，則優(yōu)選在低于大約4.5的pH下分離。用于本發(fā)明方法的粘土材料具有大于0.35ml/g、優(yōu)選大于0.5ml/g的孔體積(通過BJH方法測(cè)定(對(duì)于具有直徑在1.7-300nm范圍的孔，累加孔體積)，大于150m7g、優(yōu)選大于180m7g、特別優(yōu)選大于200m7g的比表面(BET表面)，以及大于40meq/100g的離子交換能力。該粘土材料的特征也在非常低的膨脹度。膨脹體積優(yōu)選對(duì)應(yīng)于沉降體積。適用于測(cè)定孔體積、比表面、離子交換能力和膨脹體積的分析方法在下文中詳述。特別優(yōu)選使用其離子交換能力大于40meq/100g、優(yōu)選范圍為45-75meq/100g的粘土材料。粘土材料優(yōu)選具有范圍為150-280m7g、特別優(yōu)選范圍為170-260</g的比表面(BET)。使用的粘土材料的孔體積優(yōu)選范圍為大于0.35ml/g、優(yōu)選大于O.5ml/g、特別優(yōu)選范圍為0.7-1.lml/g，并且非常特別優(yōu)選范圍為0.80-1.Oml/g。如上文所解釋的，用于本發(fā)明方法的粘土材料僅非常小程度地膨脹，對(duì)于水懸浮液的粘度增加不造成問題，例如其通常用鈉膨潤(rùn)土觀察到。將粘土材料室溫下保留在水中3天后，沉降體積優(yōu)選少于15ml/2g、優(yōu)選少于10ml/2g。室溫指大約15-25X:、特別是大約20C的溫度。使用的優(yōu)選粘土材料是天然存在的、天然活性的或不是天然活性的粘土材料，其優(yōu)選沒有經(jīng)歷任何化學(xué)修飾，更具體地講沒有用強(qiáng)酸脫鋁。該粘土材料，根據(jù)需要，可以被干燥合研磨至合適的顆粒尺寸。技術(shù)人員根據(jù)所打算的應(yīng)用而獲得顆粒尺寸。除了天然存在的粘土it料，具有上述性質(zhì)的合成產(chǎn)生的粘土材料原則上也可以使用。這種粘土材料可以例如，由水玻璃和合適的片狀硅酸鹽例如膨潤(rùn)土生產(chǎn)。然而，優(yōu)選使用來自天然來源的粘土材料。特別優(yōu)選使用以無水粘土材料計(jì)，作為人1203計(jì)的鋁含量少于11重量y。的粘土材料。該鋁含量?jī)?yōu)選大于2重量％，特別優(yōu)選大于4重量％，尤其優(yōu)選大于6重量％。鋁含量尤其優(yōu)選為8-10重量％的范圍。通過低的Al203含量。特別優(yōu)選使用僅具有低結(jié)晶度，即本身沒有分類為片狀硅酸鹽一類的粘土材料。所述低結(jié)晶度可以通過例如x-射線衍射測(cè)量法測(cè)定。特別優(yōu)選的粘土材料是基本上非晶形的，即它們的x-射線衍射圖片沒有顯示任何尖峰。因此，它們不屬于純凹凸棒石或蒙脫石的類。盡管不愿受該理論的束縛，但本發(fā)明人假定用于本發(fā)明方法的粘土材料包含由硅膠構(gòu)成的骨架。片狀硅酸鹽包埋在這種相對(duì)剛性的骨架中。通過錨定于該硅膠骨架中，該片狀礦物質(zhì)能夠極大地膨脹而不極大地增加其總體積。然后該膨脹的片狀硅酸鹽可用于大程度地吸附蛋白質(zhì)。硅膠是主相，而粘土相形成了該粘土材料的較小部分。據(jù)推測(cè)該粘土材料負(fù)責(zé)陽離子交換能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的粘土材料具有特殊的孔徑分布。該粘土材料的孔體積這里基本上通過具有直徑至少為14nm的孔產(chǎn)生。特別優(yōu)選的是，至少40%的總孔體積(通過BJH方法測(cè)定，參見下文)由直徑大于14nm的孔產(chǎn)生。優(yōu)選多于50%、并且尤其優(yōu)選多于60%的總孔體積由直徑大于14nm的孔產(chǎn)生?？讖椒植蓟蚩偪左w積通過氮孔隙率測(cè)定儀(DIN66131)測(cè)定并通過BJH方法(參見下文)評(píng)價(jià)吸附等溫線。為了防止蛋白質(zhì)變性，在施用至液體介質(zhì)前將粘土材料平衡至大約3.5-9.0、優(yōu)選4.0-6.0的pH。為了該目的，將粘土材料懸浮于合適的緩沖液、例如檸檬酸緩沖液、或諸如施用至例如由所述粘土材料制備的過濾組合件或柱的緩沖液中。這里緩沖液優(yōu)選具有為30-10Ommo1/1范圍的濃度。根據(jù)另一實(shí)施方案，粘土材料也可以分離蛋白質(zhì)之前通過用含鈉化合物、例如蘇打或含鐘化合物、例如碳酸鉀處理而活化。因此，該粘土材料的二價(jià)陽離子部分或優(yōu)選全部由鈉離子替代。如也由鉀膨潤(rùn)土的活化而已知的那樣，二價(jià)陽離子以通常的方式用鈉離子替代。將濕含量?jī)?yōu)選在10至70重量％之間、優(yōu)先在45至65重量％之間的濕粘土材料與對(duì)應(yīng)與于大約1.2至2.5當(dāng)量的粘土材料的陽離子交換能力蘇打以溶液形式噴淋于粘土材料上。然后可以干燥該粘土材料，并如果合適，將其研磨。所迷的活化可以進(jìn)一步增加該粘土材料吸附蛋白質(zhì)的能力。在最筒單的情況下，可以以下面的方式處理含有蛋白質(zhì)的液體介質(zhì)即將粘土材料直接或以懸浮液形式加至液體介質(zhì)中，并在一段孵化時(shí)間、優(yōu)選l-30分鐘、特別優(yōu)選5-20分鐘后，可以通過合適的方法、例如過濾或離心將其與所述液體介質(zhì)分離，從而對(duì)所述蛋白質(zhì)的介質(zhì)進(jìn)行貧化。根據(jù)另一實(shí)施方案，蛋白質(zhì)可以通過將液體介質(zhì)經(jīng)過至少部分由粘土材料形成的過濾組合件而分離。該過濾組合件原則上可以具有任何形式。合適的是例如用該粘土材料填料的濾筒(filtercartridge),一旦濾筒的吸附能力耗盡，可以用新的濾筒代替該濾筒?？梢詫⒇?fù)載了蛋白質(zhì)的濾筒或者丟棄或優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行處理操作，在該操作中吸附于粘土材料上的蛋白質(zhì)得以回收。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，通過預(yù)涂覆過濾而制備過濾組合件。這包括將粘土材料優(yōu)選與助濾劑例如硅藻土或PerlU"昆合。該粘土材料也可以與另外的吸收劑例如硅膠混合。在過濾過程中，粘土材料與助濾劑以及、如果合適、另外的吸收劑一起形成濾餅，所述濾餅形成用于后面的混濁物質(zhì)的過濾活性介質(zhì)和助濾劑顆粒。如果蛋白質(zhì)作為干擾物有待從液體介質(zhì)中除去，則該實(shí)施方案是特別合適的。優(yōu)選的是，在直接過濾之前，將助濾劑層用作過濾裝置的第一層?？梢允褂玫倪^濾裝置的例子是具有合適窄的篩目的篩。可以用于形成第一層的助濾劑的例子是硅藻土。該過程也稱為初步預(yù)涂敷。在隨后的過濾階段中，將根據(jù)本發(fā)明含有上述粘土材料的另外的助濾劑加入至懸浮液中。所述的助濾劑與渾濁的物質(zhì)顆粒一起形成稱作第二層的濾餅。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案，所述的方法通過色鐠法實(shí)施。這包括將粘土材料填充進(jìn)色鐠柱中并將液體介質(zhì)施加于該柱，蛋白質(zhì)有待與所述液體介質(zhì)分離。然后讓洗脫劑經(jīng)過該柱，使得蛋白質(zhì)由于ii吸附效果而分級(jí)成不同的級(jí)分。這對(duì)于分離生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)而言是特別令人感興趣的。這證明本發(fā)明方法中4吏用的粘土材料的優(yōu)點(diǎn)，這種材料以非常低的膨脹度而顯著。為了能夠?qū)⒏鶕?jù)本發(fā)明的粘土材料用于柱填充，有利的是通過篩選將所述材料調(diào)節(jié)至合適的顆粒尺寸。在此特別優(yōu)選的是特別除去粘土材料的微粒部分。將該粘土材料調(diào)節(jié)至優(yōu)選MOjum、尤其〉20pm、特別優(yōu)選〉30nm、特別是40至300jam范圍的顆粒尺寸。特別優(yōu)選的是，粘土材料在45ym網(wǎng)篩上具有>95%的初始重量的干篩殘余物，在63jLim網(wǎng)篩上具有>80%的干篩殘余物，而在150jnm網(wǎng)篩上具有>30%的干篩殘余物。本發(fā)明的方法優(yōu)選用于從液體介質(zhì)中獲得蛋白質(zhì)。為此目的，將蛋白質(zhì)吸附至粘土材料并，如果合適，通過進(jìn)一步的沖洗步驟進(jìn)行純化并然后從粘土材料再洗脫。吸附至粘土材料的蛋白質(zhì)可以通過各種方法洗脫。例如，可以逸過增加鹽濃度將蛋白質(zhì)從粘土材料的結(jié)合位點(diǎn)置換。也可以以吸附的蛋白質(zhì)的電荷受到修飾并因而后者不再被粘土材料結(jié)合的方式調(diào)節(jié)用于洗脫的溶液的pH。如果,皮提供用于將液體介質(zhì)和蛋白質(zhì)分離的粘土材料為液體介質(zhì)經(jīng)過其中的柱的形式，則吸附的蛋白質(zhì)可以、例如通過將鹽梯度以不同的蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度下洗脫，即吸附的蛋白質(zhì)得以分級(jí)的這樣一種方式經(jīng)過該柱而得以洗脫。蛋白質(zhì)通過特別是電的相互作用和/或范德華力等結(jié)合至本發(fā)明方法中使用的粘土材料等。用高鹽濃度的緩沖液洗脫減弱了充當(dāng)陽離子交換劑的粘土材料和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用。因此所迷的蛋白質(zhì)可從粘土材料上脫離和洗脫。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過改變pH洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。在這種情況下，洗脫劑的pH不，于液體介質(zhì)的pH。例如，蛋白質(zhì)可以以在其下它們是帶電荷的形式的pH施加。然后優(yōu)選調(diào)節(jié)溶液的pH以使其其低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，即蛋白質(zhì)總體帶正電荷。蛋白質(zhì)由于粘土材料的陽離子交換劑作用而結(jié)合。因此用于本發(fā)明方法的粘土材料充當(dāng)陽離子交換劑材料。如果pH隨后增加至達(dá)到或超過蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的程度時(shí)，在大多數(shù)情況下，蛋白質(zhì)總體帶負(fù)電荷。因此所述的蛋白質(zhì)再次從粘土材料脫離并可以洗脫。如果合適，洗脫劑可以與甘油或聚乙二醇類混合。這些化合物對(duì)粘土材料具有非常高的親和力并因此可促進(jìn)蛋白質(zhì)從粘土材料脫離。優(yōu)選包含水作為溶劑的液體介質(zhì)。用于本發(fā)明方法的粘土材料可以單獨(dú)使用或者與另外的吸附材料組合使用。該另外的吸附材料優(yōu)選選自硅膠、纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。粘土材料和另外的吸附材料優(yōu)選以1:10和10:1之間的比例。然而，取決于期望的應(yīng)用，也可使用在該特定范圍之外的比例。用于本發(fā)明方法的粘土材料具有非常高的載水能力但仍然保持可流動(dòng)。粘土材料具有優(yōu)選大于30重量％、尤其大于40重量％、特別優(yōu)選大于50重量％的水含量。本發(fā)明的方法基于下列實(shí)施例并結(jié)合附圖來進(jìn)行更詳細(xì)地描述，其中圖1:描述表示與相相關(guān)的本發(fā)明方法中使用的粘土材料對(duì)模型蛋白質(zhì)的吸附的圖；圖2:描述在50mM檸檬酸鹽緩沖液中記錄的用于本發(fā)明方法中的粘土材料對(duì)多種模型蛋白質(zhì)的吸附等溫線，以及圖3:描述表示與多種模型蛋白質(zhì)的施加速率相關(guān)的用于本發(fā)明方法中的粘土材料的負(fù)載的圖。分析方法表面/孔體積粘土材料的表面根據(jù)DIN66131在來自Micromeritics的ASAP2010型全自動(dòng)氮孔隙率測(cè)定儀上進(jìn)行測(cè)量。使用BJH方法(I.P.Barrett,L.G.Joyner，P.P.Haienda，J.Am.Chem.Soc.73(1951)，373)測(cè)定孔體積—通過合計(jì)通過BJH評(píng)估吸附等溫線而獲得的增加的孔體積測(cè)定詳細(xì)的孔徑大小范圍的孔體積。根據(jù)BJH方法的總孔體積指得是直徑為1.7-300nm的孔。水含量使用DIN/ISO787/2方法測(cè)定在105t:下產(chǎn)物的水含量。元素分析該分析是基于粘土材料或相應(yīng)產(chǎn)物的完全解聚。在固體溶解后，例如通過特定的分析方法例如如ICP對(duì)各種組分進(jìn)行分析和定量。離子交換能力通過在1051C下將要檢驗(yàn)的粘土材料干燥2小時(shí)來測(cè)定離子交換能力。然后將干燥了的粘土材料與過量的2NNH,C1的水溶液回流l小時(shí)。讓該混合物保持在室溫下16小時(shí)并然后過濾，隨后洗滌、干燥和研磨濾餅，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書通過氮測(cè)定(來自Leco公司的CHN分析儀)測(cè)定粘土材料中的冊(cè)4含量。交換了的金屬離子的比例和類型在濾出液中通過ICP-AES光镥法測(cè)定，X-射線衍射使用配備有銅陽極的來自Phillips的高分辨率粉末衍射儀(X'-Pert-MPD(PW3040))進(jìn)行X-射線成像。沉降體積的測(cè)定將100ml刻度的量筒裝滿100ml蒸餾水。使用匙形物，將2g待測(cè)量物質(zhì)緩慢地且每一情^ff以,約0.1-0.2g的部分施加至水的表面。在先前的部分沉淀后加入另一部分。在所迷的2g物質(zhì)加入并沉淀到量筒的底部后，將后者保留在室溫下1小時(shí)。隨后從量筒的刻度以ml/2g讀取沉降體積的高度。為了測(cè)定在水中儲(chǔ)存3天后的沉降體積，將該樣品混合物用Parafilnf密封并無振動(dòng)地放置在室溫下3天。然后從量筒的刻度讀取沉降體積。干篩殘余物的測(cè)定在45iim篩網(wǎng)上稱出約50g待檢驗(yàn)的風(fēng)干的粘土材料。所述篩連接至真空吸塵器，該真空吸塵器經(jīng)由在篩底部循環(huán)的吸氣槽通過所述篩抽而吸入所有比篩微細(xì)的部分。用塑料蓋將篩覆蓋并且接通真空吸塵器。5分鐘后，斷開真空吸塵器并通過重量差異而確定殘留在篩上的較粗大部分的量。濕篩殘余物的測(cè)定首先，通過在約930rpm下攪拌相應(yīng)量的待檢驗(yàn)的粘土材料至水中約5分鐘而制備51濃度的懸浮液。將該懸浮液在約1865rpm下再攪拌15分鐘并然后傾注通過期望篩目的篩。用自來水洗滌殘余物直至流出物澄清。然后將具有殘余物的篩置于超聲浴中5分鐘以除去剩余的微細(xì)部分。將剩下的殘佘物.用自來水簡(jiǎn)單洗滌，并重復(fù)超聲處理，如果合適，直到在所述超聲處理過程中沒有另外的微細(xì)物質(zhì)進(jìn)入水中。然后將篩干燥至重量恒定。將殘留再篩上的殘余物轉(zhuǎn)移至稱量過的瓷亞中稱重。粘土材料的特征a)粘土材料A:檢驗(yàn)適合于本發(fā)明方法的粘土材料(TonsiTEX1221I;Siid-ChemieAG,Moosburg，DE，(RohtonlagerRes.No.:03051))的物理化學(xué)性質(zhì)。獲得的結(jié)果總結(jié)在表l中。表l:粘土材料A的物理化學(xué)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1對(duì)于直徑在1.7和300nin之間的孔根據(jù)BHJ的累加孔體積。將本發(fā)明的硅酸鹽篩選至顆粒尺寸〉45pm，以^t其為可以容易地填充進(jìn)柱中的形式。篩選的材料在45pim篩網(wǎng)上具有>95%的干篩殘余物。該干篩殘余物在63Mm篩向上為85X以及在150nm篩網(wǎng)上為30%。進(jìn)一步檢驗(yàn)在表l中表征的粘土材料的具有特定孔徑的孔產(chǎn)生的孔體積比例。對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)總結(jié)在表2a至c中。表2a<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2b<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2c孔的相對(duì)孔體積比<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>b)粘土材料B:適合于實(shí)施本發(fā)明方法的i另一種粘土材料的物理化學(xué)性質(zhì)總結(jié)在表3中。表3粘土材料B的物理化學(xué)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>c)粘土材料A的堿性活化當(dāng)測(cè)定總離子交換能力(IUF)時(shí)，可由洗出液中的離子濃度測(cè)定出總陽離子交換能力的Na+和K+的比例是32%(Na+:23%，T:9%)。由此，可以計(jì)算出實(shí)現(xiàn)用單價(jià)離子的化學(xué)計(jì)量活化所需要的2%的蘇打的在表1中表征的粘土材料A最先破碎成直徑小于3cm的碎片。如果合適，可通過用水噴射碎的粘土材料以調(diào)節(jié)水含量而達(dá)到約45重量%至65重量％的水含量。將350g預(yù)先破碎的粘土材料A置于混合裝置(例如Werner&Pfleiderer混合器)中并捏合l分鐘。隨著混合裝置依然運(yùn)行，隨后加入2重量％的固體蘇打(基于無水的粘土材料A)并將該混合物再捏合10分鐘。如果該混合物不充分光滑，可加入蒸餾水以便獲得充分劇烈的剪切作用(intenseshearingaction)。將捏合了的物體分成小份，其在循環(huán)空氣千燥器中在約751C下2至4小時(shí)被干燥至10±2%的水含量。然后將干燥了的材料在旋轉(zhuǎn)破碎機(jī)(例如Retsch碾磨機(jī))研磨中0.12mm篩網(wǎng)上的。使用的模型蛋白質(zhì)將下列模型蛋白質(zhì)以研究蛋白質(zhì)的吸附a-糜蛋白酶(CHY):a-糜蛋白酶是來自牛胰腺的消化酶。該酶具有25.3kDa的質(zhì)量。等電點(diǎn)在pH8.1和8.6之,間。人血清白蛋白(HSA):HSA是用作脂肪酸和兩親物從血液進(jìn)入周圍組織的載體的球狀的運(yùn)輸?shù)鞍?。HSA含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域依次由585個(gè)氨基酸組成，總質(zhì)量為66.4kDa。分子的等電點(diǎn)在pH4.9。堿性磷酸酶(AP):堿性磷酸酶是在所有.物種、從大腸桿菌到人中作為同一亞基的二聚體存在的非特異性磷酸單酯酶。AP是包含兩個(gè)Zn2+離子和一個(gè)Mg2+離子的金屬蛋白。用于實(shí)施例中的AP分離自牛腸粘膜。等電點(diǎn)在pH6.0。二聚體的分子量是140kDa。實(shí)施例l:靜態(tài)體系中蛋白質(zhì)的吸附粘土材料的平衡在每一情況下，50ml反應(yīng)器(SarstedtAG&Co.，Ntimbrecht，DE)中稱量25.Omg上述表征的粘土材料A。在每一情況下，加入10ml在表4中標(biāo)明的樣品制備緩沖液，并將反應(yīng)器在超聲浴中處理30分鐘。然后將含有懸浮液的反應(yīng)器在振動(dòng)臺(tái)上在100rpm和室溫下攪動(dòng)1小時(shí)。在每一情況下，將樣品在4000g下離心IO分鐘并然后通過移液移出澄清的上清液。將沉淀物再懸浮于10ml二次蒸餾水中并在100rpm下攪動(dòng)5分鐘。然后將該懸浮液在4000g下離心10分鐘并通過移液移出澄清的上清液。然后將該平衡了的粘土材料在60匸下干燥16小時(shí)。表4:使用的100mM緩沖液緩沖液pH3.0lOOmM磷酸鈉緩沖液緩沖液pH4.0100mM檸檬酸鈉緩沖液緩沖液pH5.0100mM醋酸鈉緩沖液援沖液pH6.0,lOOmMMES緣沖液緩沖液pH7.0100mMTris緩沖液緩沖液pH8.0100mMTris緩一液緩沖液pH9.0IOO邁MTris緩沖液模型蛋白質(zhì)的制備對(duì)于每種模型蛋白質(zhì)，在二次蒸餾水中制備具有2mg/ml濃度的儲(chǔ)備溶液。將該蛋白質(zhì)溶液用表4中標(biāo)明的pH3至8的lOOmM緩沖液以1:1的比例稀釋而得到20ml的總體積。通過UV分光光度法產(chǎn)生用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的校準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)的分光光度定量是基于在280nm處測(cè)量芳族氨基酸酪氨酸(酚基，275nm)、色氨酸〖吲哚基，279mn)以及，在較低程度的苯丙氨酸(257nm)的UV吸光度。取決于氨基酸的組成，可以檢測(cè)20和300(mgml蛋白質(zhì)之間的濃度。為了測(cè)定未知的蛋白質(zhì)濃度，首先對(duì)于已知蛋白質(zhì)濃度的校準(zhǔn)系列溶液測(cè)定在28Onm處的吸光度。未知的蛋白質(zhì)濃度可以由吸光度和蛋白質(zhì)濃度之間的線性關(guān)系計(jì)算出。對(duì)于分光光度定量的評(píng)估，在表5中確定的相應(yīng)pH值的50mM緩沖液中制備模型蛋白質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品在振動(dòng)臺(tái)上于4C和100rpm下孵化3小時(shí)。在所述孵化后，將樣品在4000g下離心10分鐘，并測(cè)定澄清上清液的鄰光度。由測(cè)定的數(shù)據(jù)建立校準(zhǔn)曲線。表5:使用的50mM緩沖液緩沖液pH3.050mM磷酸鈉緩沖液緩沖液pH4.050mM檸檬酸鈉緩沖液緩沖液pH5.050mM醋酸鈉援沖液緩沖液pH6.050mMMES緩沖液緩沖液pH7.050mMTris緩沖液緩沖液pH8.050mMTris緩沖液緩沖液pH9.050邁MTris緩沖液a)蛋白質(zhì)吸附的pH依賴性的檢測(cè)在每一情況下，將如上所述制備的20ffll模型蛋白質(zhì)溶液在每一情況下加入至25mg平衡了的粘土材料中。將樣品在振動(dòng)臺(tái)上于4D和100rpm下孵化3小時(shí)。在所述孵化結(jié)束后，將樣品在4000g下離心10分鐘。相對(duì)于在相關(guān)緩沖,液中的所述蛋白質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)品，通過分光光度法在280nm處測(cè)定^品上清液中的模型蛋白質(zhì)的濃度。粘土材料的負(fù)載由孵化前和孵化后上清液中的蛋白質(zhì)濃度差異，以及粘土材料的質(zhì)量和蛋白質(zhì)溶液的體積計(jì)算。測(cè)量結(jié)果在圖1中作為相對(duì)pH值的多次測(cè)量的平均值繪出。對(duì)于所有模型蛋白質(zhì)，粘土材料A的負(fù)栽在pH4的檸檬酸鹽緩沖液中最高。b)蛋白質(zhì)吸附等溫線的記錄吸附等溫線的記錄通過與上清液中的模型蛋白質(zhì)濃度相關(guān)的粘土材料A的平衡負(fù)載來研究。對(duì)于具體的模型蛋白質(zhì)在pH4的50mM檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行試驗(yàn)。其對(duì)應(yīng)于在其下在檢測(cè)與pH相關(guān)的蛋白質(zhì)吸附時(shí)已經(jīng)測(cè)得最大值的條件。為了記錄吸附等溫線'，首先制備在50fflM檸檬酸鹽緩沖液中蛋白質(zhì)含量為3mg/ml的所考慮的模型蛋白質(zhì)的儲(chǔ)備溶液。然后根據(jù)表6中標(biāo)明的方案將該蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液用50mM檸檬酸鹽緩沖液稀釋。表6:用于記錄蛋白質(zhì)吸附等溫線的稀釋蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>然后在每一情況下將模型蛋白質(zhì)的稀釋溶液加入至如上所述的用50niM檸檬酸鹽緩沖液平衡了的25mg粘土材料A中。為了測(cè)定模型蛋白質(zhì)的濃度，在5OmM檸檬酸鹽緩沖液中制備每種模型蛋白質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)品。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液在振動(dòng)臺(tái)上于4x:和100rpm下孵化3小時(shí)，然后在4000g下離心10分鐘。校準(zhǔn)曲線通過測(cè)定蛋白質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)品的消光度產(chǎn)生。通過分光光度地定量在離心了的樣品的上清液中的蛋白質(zhì)測(cè)定粘土材料的負(fù)載。數(shù)據(jù)作為多次的平均值示于圖2。實(shí)施例2:動(dòng)態(tài)體系中蛋白質(zhì)的吸附粘土材料的平衡在每一情況下，將100mg粘土材料A在每一情況下用lml的表5中所標(biāo)明的50mM緩沖液懸浮于lml的Eppendorf管中，并用移液管將該懸浮液移液到在底部用塞封閉的色鐠柱(15x50mm,具有10nmPTFE塞)中。附接第二個(gè)柱尾端件，并將該柱與FPLC裝置以流動(dòng)相能從底部到頂部流通過該裝置的方式進(jìn)行連接。將FPLC泵調(diào)節(jié)至測(cè)定其吸附能力的流速。在用20ml的50mM緩沖液平衡過程中將柱的可活動(dòng)的塞用手緩慢上緊并然后通過轉(zhuǎn)動(dòng)螺紋的4分之一團(tuán)而放松。蛋白質(zhì)結(jié)合能力的測(cè)定將在50mM檸檬酸鹽緩沖液中的25ffll具體蛋白質(zhì)溶液以可變的流速泵抽吸通過用100mg粘土材料A填充的柱。相對(duì)在50mM檸檬酸鹽緩沖液中模型蛋白質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)，在280nm處通過分光光度測(cè)定流通液中的蛋白質(zhì)含量。測(cè)定的粘土材料A的流速依賴的模型蛋白質(zhì)負(fù)載作為多次的平均值示于圖3。實(shí)施例3人血清白蛋白的洗脫將結(jié)合至粘土材料A的HSA用2種不同的緩沖液洗脫。所有色鐠步驟均以lml/min的流速進(jìn)行。洗脫緩沖液l:在二次蒸餾水中的50mM檸檬酸鹽、1M的NaCl，pH4洗脫緩沖液2:在二次蒸餾水中的50mMNa2HP04，pH7.2將100mg粘土材料A與25mlHSA溶液一起以流動(dòng)模式負(fù)載，所述HSA溶液具有在50mM檸椽酸鹽緩沖液中的lmg/ml的濃度，pH為4。負(fù)載后，將柱用20ml的50mM、pH為4的種檬酸鹽緩沖液沖洗。通過將35ml洗脫緩沖液通過該柱而洗脫HSA。在280nm處通過分光光度法測(cè)定流通液、洗滌和洗脫級(jí)分的蛋白質(zhì)含量。兩種洗脫緩沖液的結(jié)果作為多次的平均值列于表7中。表7:用2種不同的洗脫緩沖液從粘土材料A洗脫HSA的流通液、洗涂和洗脫級(jí)分中的蛋白質(zhì)含量<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>與洗脫緩沖液l相比'，用洗脫緩沖液2洗脫出3倍多的蛋白質(zhì)。權(quán)利要求1.一種用于將蛋白質(zhì)與液體介質(zhì)分離的方法，包括-提供含有蛋白質(zhì)的液體介質(zhì)，-提供粘土材料，其具有-大于150m2/g的比表面，-大于0.35ml/g的孔體積，-大于40meq/100g的離子交換能力，以及-小于15ml/2g的水中沉降體積，-平衡所述粘土材料至3.5至9.0的pH，-用平衡的粘土材料處理所述液體介質(zhì)，以及-將純化的、蛋白質(zhì)貧化的液體介質(zhì)與粘土材料分離。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中以無水粘土材料(atro)計(jì)，粘土材料具有小于11%的Al203含量。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中以無水粘土材料(atro)計(jì)，粘土材料具有大于65重量y。的Si02含量。4.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中粘土材料的孔體積的至少40%由具有至少14nm孔直徑的孔提供。5.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中在所述粘土材料已在室溫下保持在水中3天后，粘土材料的沉降體積小于lSml〃g，優(yōu)選小于10ml/2g。6.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中粘土材料沒有經(jīng)受用酸進(jìn)行的表面活化。7.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中粘土材料用緩沖液平衡。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中緩沖液濃度在30至lOOmmol的范圍內(nèi)。9.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中粘土材料已經(jīng)通過用含堿土金屬的化合物、尤其是含鈉的化合物處理而活化。10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白質(zhì)通過使液體介質(zhì)經(jīng)過至少部分由粘土材料形成的過濾組合件而分離。11.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白質(zhì)通過使液體介質(zhì)經(jīng)過其填充物基本上是由粘土材料形成的色譜柱而分離。12.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中在純化的、蛋白質(zhì)-貧化的液體介質(zhì)分離后，用洗脫劑洗脫結(jié)合至粘土材料的蛋白質(zhì)。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中洗脫劑具有和液體介質(zhì)不同的pH。14.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中粘土材料具有>45jum的顆粒尺寸。15.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的方法，其中粘土材料混合物與另外的吸附材料一起使用。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中另外的吸附材料選自硅膠、纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。17，根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中以重量計(jì)，粘土材料和另外的吸附材料的比一在,l:10和10:1之間。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于從液體介質(zhì)分離蛋白質(zhì)的方法，包括提供含有蛋白質(zhì)的液體介質(zhì)，提供粘土材料，其具有大于150m²/g的比表面，大于0.35ml/g的孔體積，大于40meq/100g的離子交換能力，以及小于15ml/2g的水中沉降體積，平衡所述粘土材料至3.5至9.0的pH，用所述平衡的粘土材料處理所述液體介質(zhì)，以及將純化的、蛋白質(zhì)貧化的液體介質(zhì)與粘土材料分離。文檔編號(hào)B01J20/286GK101330951SQ200680047371公開日2008年12月24日申請(qǐng)日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者A·勃茲拉夫,C·卡斯帕,D·里歇爾斯,T·舍佩爾,U·索靈申請(qǐng)人:蘇德-化學(xué)股份公司