專利名稱：一種硅膠色譜填料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硅膠色譜填料，特別涉及一種具有兩性離子的親水性硅膠色譜填 料及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著生命科學、中藥現(xiàn)代化、環(huán)境科學等研究領(lǐng)域的迅速發(fā)展，強極性、親 水性小分子以及堿性藥物分子成為分析化學和藥物化學領(lǐng)域研究的熱點。然而，上述目標 物在液相色譜中往往難于獲得有效的分離。一方面，傳統(tǒng)的反相色譜(RPLC)對上述目標 物的保留和分離能力較弱，歸因于上述目標物中極性官能團易于與流動相形成“偶極矩作 用”，而與非極性固定相的該作用力卻很弱，導致樣品難于在色譜柱被保留，因而無法獲得 有效的分離；而另一方面，很多堿性藥物分子在用以硅膠基質(zhì)的反相鍵合色譜填料的液相 色譜柱來評價其藥效和純度時，由于硅膠基質(zhì)表面鍵合不完全，堿性目標物常與填料殘余 硅羥基產(chǎn)生“次級保留”作用，導致峰形拖尾嚴重；并且，堿性藥物分子的親水性很強，在酸 性PH條件下所帶的凈電荷使其用RPLC也很難保留。并且，更為重要的是，在用正相色譜 (NPLC)分離分析上述目標化合物時，其使用的流動相無法提供充分的溶解度；雖然采用離 子交換色譜或離子對色譜代替RPLC能夠?qū)ι鲜瞿繕宋镞M行分離分析，但這兩種分離模式 由于與質(zhì)譜檢測器的兼容性較差，因此具有很大的應用局限性。
Jane在1975年首次采用高濃度、高極性有機溶劑-水相緩沖液成功地分離了堿 性藥物分子(Jane1. J. Chromatogr.，1975，111:227-233.) ；Alpert 在 1990 年將這種色譜 模式命名為親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography, HILIC),此后這種 采用正相硅膠色譜柱/反相洗脫液的色譜系統(tǒng)引起了人們的廣泛的關(guān)注。HILIC是一種以 極性固定相(如硅膠或衍生硅膠)及含高濃度極性有機溶劑和低濃度水溶液為流動相的色 譜模式。它與傳統(tǒng)正相色譜(NPLC)相似，流動相的有機部分是弱溶劑，水溶液則是強溶劑。 目標物根據(jù)親水性增加的次序依次出峰，但所用的洗脫溶劑卻與RPLC相似，采用與水互溶 的極性有機溶劑如乙腈或甲醇；而不用NPLC中所用如正己烷及氯仿等溶劑。與RPLC分離 堿性藥物相比，該分離模式具有峰形對稱、保留時間短以及重現(xiàn)性好等優(yōu)點。最近幾年該技 術(shù)又與質(zhì)譜聯(lián)用，應用于生物樣品中堿性化合物及其代謝產(chǎn)物的分離與鑒定。
默克公司專利(US20100300971)制備的兩性離子親水作用硅膠色譜填料(Z丨C'HILJC)對強極性或親水性離子型化合物具有較好的分離效果。該填料是在硅膠或 聚合物表面鍵合了一個類似磺基甜菜堿結(jié)構(gòu)的兩性離子鍵合相。在該分離模式下，填料表 面形成一個富集水的液體層，分析物在流動相和該水層之間進行分配，進而得以保留并分 離。然而，該填料存在化合物與固定相的靜電作用太強，化合物不易洗脫，需要采用高濃度 的緩沖鹽來調(diào)節(jié)，并且會抑制質(zhì)譜信號、降低靈敏度等問題。因此，如何提供一種靜電作用 小、對離子型或極性目標物具有較好吸附作用的硅膠色譜填料已成為本領(lǐng)域急需解決的技 術(shù)問題。發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有兩性離子的親水性 硅膠色譜填料及其制備方法。該具有兩性離子的親水性填料每個電荷的靜電作用都會被鄰 近的反向電荷部分地平衡或抵消，因此總的靜電作用較弱。較弱的靜電作用允許流動相使 用較低的緩沖鹽濃度，能用作為HILIC模式用于液相色譜的分離分析；并且，由于使用溫和 的流動相也有利于提高質(zhì)譜檢測器的靈敏度。因而特別適用于極性、親水性的小分子目標 物以及堿性藥物分子的分離分析。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的制備方 法，包括如下步驟
(I)將硅膠活化預處理，制得活化硅膠；
(2)將所述活化硅膠環(huán)氧基化改性，制得環(huán)氧基改性硅膠；
(3)在環(huán)氧基改性硅膠上引入叔胺基，制得叔胺基改性硅膠；
(4)在所述叔胺基改性硅膠上引入磺酸基，制得所述具有兩性離子的親水性硅膠 色譜填料。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述步驟(I)包括將硅膠用蒸餾水清洗兩次，然后用氫氟酸 水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至PH值中性，最后用丙酮洗滌并干燥。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述步驟(2)包括以甲苯為溶劑，將所述活化硅膠溶解均勻 后，加入環(huán)氧基硅烷化試劑，在攪拌和回流下進行反應。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述步驟(3)包括將所述環(huán)氧基改性硅膠與33wt% (質(zhì)量百 分比)的二甲胺水溶液在攪拌和回流下進行反應，待反應結(jié)束后，分別用蒸餾水和丙酮進行 洗滌并真空干燥。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述步驟⑷包括以乙腈為溶劑，將所述叔胺基改性硅膠與 磺化試劑在攪拌和回流下進行反應，反應結(jié)束后，依次用水、甲醇和丙酮進行洗滌并真空干 燥。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，在所述步驟⑴中，所述氫氟酸水溶液質(zhì)量濃度為 O. 04-0. 08%，所述硅膠的質(zhì)量與氫氟酸水溶液的體積之比為1:8-1:10，所述氫氟酸水溶液 浸泡的時間為22-24小時，優(yōu)選24小時。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，在所述步驟(2)中，所述環(huán)氧基硅烷化試劑為Y-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基二甲氧基娃燒。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，在所述步驟(2)中，所述活化硅膠與環(huán)氧基硅烷化試劑的質(zhì) 量比為1:0. 5-1:2，反應溫度為90-110° C，反應時間為20-24小時。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，在所述步驟(2)中，所述活化硅膠與甲苯溶劑的質(zhì)量體積比 為 1:4-1:6。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，在所述步驟(3)中，所述環(huán)氧基改性硅膠的質(zhì)量與二甲胺水 溶液的體積之比為1:3-1:8，反應溫度為50-90° C，反應時間為16-20小時。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述磺化試劑為1，3-丙磺酸內(nèi)酯，且所述叔胺基改性硅膠 的質(zhì)量與1，3-丙磺酸內(nèi)酯的體積之比為1:0. 5-1:2 ;反應溫度為70-100° C，反應時間為 46-50小時。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，在所述步驟(2)中，所述環(huán)氧基改性硅膠依次用蒸餾水、THF/水、THF以及乙腈清洗，其中THF/水的體積比為8:2，優(yōu)選地，所使用的蒸餾水、THF/水、THF 以及乙腈為熱的；
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明同時還提供一種具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料， 通過上述任一制備方法制備。
在本發(fā)明中，各反應步驟中所述的料液比為質(zhì)量與體積之比。
本發(fā)明通過如下的措施來實現(xiàn)鑒于環(huán)氧基團容易發(fā)生胺化放反應，本發(fā)明首先 將全多孔的硅膠活化，然后利用活性硅羥基與Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的硅 烷化反應制備環(huán)氧基官能團改性的硅膠，隨后利用具有高反應活性的環(huán)氧基團與二甲胺水 溶液之間的胺化反應制備得到叔胺基改性硅膠，最后利用叔胺基改性硅膠與1，3-丙磺酸 內(nèi)酯之間和季銨化和磺化反應獲得具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料，該填料具有極強 的親水性，能夠有效地保留反相色譜中保留弱或不保留的強極離子型目標物以及堿性藥物 分子。
本發(fā)明所制備的兩性離子的親水性硅膠色譜填料以具有共價鍵結(jié)合且強極性的 兩性官能團為基礎(chǔ)，與傳統(tǒng)的硅膠和氨基等HILIC填料相比能夠提供更好的穩(wěn)定性和更為 優(yōu)異的HILIC分離能力。
本發(fā)明是在反相色譜條件的分離模式下，以乙腈-/K、甲醇-水等作為分離的流動 相，流動相的流速為1. OmL/min，檢測溫度為25° C，紫外檢測波長為214nm或260nm，分離 的對象為尿囊素及其相關(guān)雜質(zhì)，一磷酸腺苷(AMP)、尿甘酸(UMP)、鳥嘌呤(GMP)以及一磷酸 胞苷(CMP)四種核苷酸等。
與常規(guī)的反相色譜填料相比，本發(fā)明所制備的具有兩性離子的親水性硅膠色譜填 料具有以下優(yōu)點
1.流動相和固定相表面富集水層間的分配；
2.弱靜電作用-同時和陰、陽離子作用的特殊選擇性；
3.氫鍵和分子雙極性作用；
4.與NPLC具有類似的保留行為，能為強極性的待測樣品提供合適的保留；采用水 水溶性有機相作為流動相，又能顯著改善樣品在流動相中的溶解度。
5.該填料在體現(xiàn)和RPLC正交的選擇性的同時，具有與RPLC相媲美的柱效和對稱 的峰形；又與多種檢測器-尤其是質(zhì)譜-有良好的兼容性，因此是一種非常適合于強極性和 強親水性樣品分離分析的新型填料。


圖1為本發(fā)明制備具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的方法的合成示意圖。
圖2為實施例1制備的硅膠色譜填料分離分析尿囊素及其相關(guān)雜質(zhì)的效果示意 圖。
圖3為實施例2制備的硅膠色譜填料分離分析四種核苷酸的效果示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。但本發(fā)明并不限于以下的實施 例。
本發(fā)明提供一種具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟
(I)將硅膠活化預處理，制得活化硅膠；
(2)將所述活化硅膠環(huán)氧基化改性，制得環(huán)氧基改性硅膠；
(3)在環(huán)氧基改性硅膠上引入叔胺基,制得叔胺基改性硅膠；
(4)在所述叔胺基改性硅膠上引入磺酸基，制得所述具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料。
其中所述步驟(I)包括將硅膠用蒸餾水清洗兩次，然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至PH值中性，最后用丙酮洗滌并干燥。
其中所述步驟(2)包括以甲苯為溶劑，將所述活化硅膠溶解均勻后，加入環(huán)氧基硅烷化試劑，在攪拌和回流下進行反應。
其中所述步驟(3)包括將所述環(huán)氧基改性硅膠與33wt%的二甲胺水溶液在攪拌和回流下進行反應，待反應結(jié)束后，分別用蒸餾水和丙酮進行洗滌并真空干燥。
其中所述步驟(4)包括以乙腈為溶劑，將所述叔胺基改性硅膠與磺化試劑在攪拌和回流下進行反應，反應結(jié)束后，依次用水、甲醇和丙酮進行洗滌并真空干燥。
具體合成步驟過程，如圖1所示。圖1為本發(fā)明制備具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的方法的合成示意圖。
以下為本發(fā)明制備具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的實施例，但本發(fā)明的構(gòu)思及其應用原料/儀器并不限于。
實施例1 :具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的制備
(I)往250mL反應容器中加入20g硅膠(5μπι，購于日本大曹公司)，并加入200mL 蒸懼水攪拌30分鐘、過濾,重復該步驟兩次。然后加入160mL質(zhì)量比為O. 08%氫氟酸水溶液，攪拌24小時后用蒸餾水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過濾，110° C干燥12 小時，得到經(jīng)活化硅膠；
(2)稱取活化硅膠20g(5ym，120 A:)，置于500mL反應容器中；加入120mL甲苯 向反應容器中加入20mL Y - (2, 3-環(huán)氧丙氧基)丙基二甲氧基娃燒(美國Gelest公司)，于 97° C下回流攪拌反應20-22小時依次用400mL熱的超純水、400mL熱的THF/水(體積比80:20)、400mL熱的THF以及400mL熱的乙腈清洗制備好的填料、過濾，得到環(huán)氧基改性硅膠；
(3)向反應容器中加入“步驟⑵”中制備好的環(huán)氧基改性硅膠，并加入80mL33wt% 二甲胺水溶液，水浴加熱至60° C，攪拌回流反應18小時，冷卻，用蒸餾水及丙酮洗滌數(shù)次， 40° C真空干燥，即得叔胺基改性硅膠
(4)將“步驟(3) ”叔胺 基改性硅膠置于500mL反應容器中，然后加入10gl，3_丙磺酸內(nèi)酯和80mL乙腈，于80° C回流攪拌反應48小時產(chǎn)物依次用水、甲醇和丙酮洗滌數(shù)次，真空干燥，即得兩性離子親水作用硅膠色譜填料。
實施例2 :具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的制備
(I)往2L反應容器中加入IOOg硅膠，并加入200mL蒸餾水攪拌30分鐘、過濾，重復該步驟兩次。然后加入800mL質(zhì)量比為O. 08%氫氟酸水溶液,攪拌24小時后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過濾，110° C干燥12小時，得到經(jīng)活化的硅膠；
(2)稱取活化的硅膠IOOg(5 μ m，120 A)，置于3L反應容器中；加入600mL甲苯 向反應容器中加入200mL Y-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷，于97° C下回流攪拌反應20-22小時依次用2000mL熱的超純水、2000mL熱的THF/水(80:20)、2000mL熱的THF 以及2000mL熱的乙腈清洗制備好的填料、過濾，得到環(huán)氧基團改性硅膠；
(3)向反應容器中加入(2)步驟中制備好的環(huán)氧基改性硅膠，并加入600mL質(zhì)量百分比濃度為33%的二甲胺水溶液，水浴加熱至60° C，攪拌回流反應18小時，冷卻，用蒸餾水及丙酮洗滌數(shù)次，40° C真空干燥，即得胺化硅膠微球
(4)將胺化娃膠微球置于3L反應容器中，然后加入IOOgl, 3_丙磺酸內(nèi)酯和80mL 乙腈，于80° C回流攪拌反應48小時產(chǎn)物依次用水、甲醇和丙酮洗滌數(shù)次,60° C真空干燥24小時，即得兩性離子親水作用硅膠色譜填料。
以下為本發(fā)明制備具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的效果實施例，但本發(fā)明的構(gòu)思及其應用原料/儀器并不限于。
實施例3 :具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料色譜柱親水作用分離
將實施例1中的具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料進行裝柱，柱長250mm，柱內(nèi)徑4. 6mm。裝柱條件如下裝柱壓力3000-7000psi，勻漿劑三氯甲烷和環(huán)己醇，料液比為 1:10，最后用甲醇頂替3011^11。以乙腈和水(80:20)為流動相，流速為每分鐘O. 8mL，檢測波長為214nm,檢測尿囊素及其相關(guān)雜質(zhì)；效果如圖2所示。圖2是實施例1具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料分離分析尿囊素及其相關(guān)雜質(zhì)的效果示意圖。橫坐標是保留時間，單位為min，縱坐標是檢測信號的響應值，單位為10_3mV (毫伏)。實驗表明尿囊素樣品用常規(guī)的C18柱難于獲得滿意的主峰與雜質(zhì)峰分離度，并且C18柱的使用壽命也很短，而使用該兩性離子的親水性硅膠色譜填料填充的色譜柱進行分離時，其使用壽命也高于C18色譜柱。
實施例4 :具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料色譜柱親水作用分離
將實施例2中的具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料譜填料進行裝柱，柱長 250mm，柱內(nèi)徑4. 6mm。裝柱條件如下裝柱壓力3000-7000psi，勻漿劑三氯甲烷和環(huán)己醇，料液比為1:10，最后用甲醇頂替30min。以乙腈和水(80:20)為流動相，流速為每分鐘 O. 8mL，檢測波長為260nm，對AMP、UMP、GMP以及CMP這四種核苷酸進行測定。效果如圖3 所示。圖3是實施例2具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料分離分析四種核苷酸的效果示意圖。橫坐標是保留時間，單位為min，縱坐標是檢測信號的響應值，單位為10_3mV (毫伏)。 由圖可知四種核苷酸能夠在該色譜柱上或者較好的分離效果，并且能夠在較短的時間內(nèi)分離；而在普通的C18色譜柱卻難于獲得滿意的分離度。
對比實施例具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料色譜柱與其他類型填料色譜柱的對比效果
將實施例2中的具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料譜填料進行裝柱，柱長 250mm，柱內(nèi)徑4. 6mm。裝柱條件如下裝柱壓力3000-7000psi，勻漿劑三氯甲烷和環(huán)己醇，料液比為1:10，最后用甲醇頂替30min。以乙腈和水(80:20)為流動相，流速為每分鐘 O. 8mL,檢測波長為254nm，對ATP和TTP這二種核苷酸進行測定。通過與常規(guī)的C18柱、默克公司的ZICu兩性離子色譜柱對 比發(fā)現(xiàn)，該色譜柱分離目標物的柱效、分離度明顯優(yōu)于常規(guī)的C18柱，其中對ATP和TTP的柱效分別為5919和6134，保留時間分別為5. 75min和7. 54min ;而在常規(guī)的C18柱上保留時間很短，僅僅為1. 5min左右，幾乎和溶劑峰一起出來， 而使用默克公司的ZIC 兩性離子色譜柱分離ATP和TTP時，其柱效明顯低于本方法制備的 色譜填料色譜柱的柱效，僅僅為3024和3531，并且其保留時間也較本方法制備的色譜填料 色譜柱分離這兩種目標物的保留時間要長，這樣也容易導致峰型展寬、峰靈敏度下降。
以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，即凡是依據(jù) 本發(fā)明申請的權(quán)利要求書及說明書內(nèi)容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利 的權(quán)利要求保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟(1)將硅膠活化預處理，制得活化硅膠；(2)將所述活化硅膠環(huán)氧基化改性，制得環(huán)氧基改性硅膠；(3)在環(huán)氧基改性硅膠上引入叔胺基,制得叔胺基改性硅膠；(4)在所述叔胺基改性硅膠上引入磺酸基，制得所述具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)包括將硅膠用蒸餾水清洗兩次，然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至PH值中性，最后用丙酮洗滌并干燥；所述步驟(2)包括以甲苯為溶劑，將所述活化硅膠溶解均勻后，加入環(huán)氧基硅烷化試劑，在攪拌和回流下進行反應；所述步驟(3)包括將所述環(huán)氧基改性硅膠與33wt%的二甲胺水溶液在攪拌和回流下進行反應，待反應結(jié)束后，分別用蒸餾水和丙酮進行洗滌并真空干燥；所述步驟(4)包括以乙腈為溶劑，將所述叔胺基改性硅膠與磺化試劑在攪拌和回流下進行反應，反應結(jié)束后，依次用水、甲醇和丙酮進行洗滌并真空干燥。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(I)中，所述氫氟酸水溶液質(zhì)量濃度為O. 04-0. 08%，所述硅膠的質(zhì)量與氫氟酸水溶液的體積之比為1:8-1:10，所述氫氟酸水溶液浸泡的時間為22-24小時。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，所述環(huán)氧基硅烷化試劑為Y _(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，所述活化硅膠與環(huán)氧基硅烷化試劑的質(zhì)量比為1:0. 5-1:2，反應溫度為90-110° C，反應時間為20-24小時。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，所述活化硅膠與甲苯溶劑的質(zhì)量體積比為1:4-1:6。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述環(huán)氧基改性硅膠的質(zhì)量與二甲胺水溶液的體積之比為1:3-1:8 ;反應溫度為50-90° C，反應時間為16-20 小時。
8.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(4)中，且所述叔胺基改性硅膠的質(zhì)量與1，3-丙磺酸內(nèi)酯的體積之比為1:0. 5-1:2 ;反應溫度為70-100° C，反應時間為46-50小時。
9.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，所述環(huán)氧基改性硅膠依次用蒸餾水、THF/水、THF以及乙腈清洗。
10.一種具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料，通過如權(quán)利要求1-9中任一項所述的制備方法制備。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟(1)將硅膠活化預處理，制得活化硅膠；(2)將所述活化硅膠環(huán)氧基化改性，制得環(huán)氧基改性硅膠；(3)在環(huán)氧基改性硅膠上引入叔胺基，制得叔胺基改性硅膠；(4)在所述叔胺基改性硅膠上引入磺酸基，制得所述具有兩性離子的親水性硅膠色譜填料。本發(fā)明所制備的硅膠色譜填料靜電作用小、對離子型或極性目標物具有較好吸附作用。
文檔編號B01J20/281GK103028383SQ20121059496
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者薛昆鵬, 趙岳星, 姚立新 申請人:浙江月旭材料科技有限公司