專利名稱：自動分子生物學診斷系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于在多重方式(multiplex format)中進行多步驟的分子生物學類型的診斷分析的裝置和系統(tǒng)。更具體地說，該分子生物學類型的分析包括各種核酸雜交反應及相關(guān)的生物聚合物的合成。此外，也可以進行抗體/抗原反應以及其它的臨床診斷。
相關(guān)申請資料本申請是1994年7月7日提交的序列號08/271,882申請的部分繼續(xù)，而后者又是1993年11月1日提交的序列號07/146,504申請的部分繼續(xù)，標題均為“用于分子生物學分析和診斷的能自編址和自裝配的微電子系統(tǒng)和裝置”。
背景技術(shù)：
分子生物學包括了各種各樣的用于分析核酸和蛋白質(zhì)的技術(shù)，許多這樣的技術(shù)和方法構(gòu)成了臨床診斷試驗和檢測的基礎。這些技術(shù)包抬核酸雜交分析，限制性酶分析，基因序列分析，核酸和蛋白質(zhì)的分離純化(見，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
大多數(shù)這類技術(shù)涉及到對大量的樣品進行大量的操作(例如移液、離心、電泳)。這些操作通常是復雜而耗時的，并通常需要高度的準確性。由于缺乏敏感性、專一性及重現(xiàn)性，許多這類技術(shù)在應用時受到局限。例如，上述問題限制了核酸雜交分析在診斷方面的許多應用。
進行一種遺傳病或傳染病的DNA雜交分析的全過程是很復雜的。概括地講，全過程可分為許多步驟和分步驟(見

圖1)。在診斷遺傳病的情況下，第一步是得到樣品(血液或組織)。依據(jù)樣品的類型，進行不同的預處理。第二步是裂解或溶解細胞，釋放出粗DNA物質(zhì)及其它細胞組分。通常還需要幾個分步驟來去掉細胞碎片及進一步純化粗DNA。在這一點上，有幾種方案供進一步的處理與分析。第一種方案包括使純化的DNA樣品變性，并在多種方式(點印跡、微珠、微量滴定板等)的一種上進行直接雜交。第二種方案是Southen印跡雜交，包括用限制性酶切割DNA，在電泳膠上分離DNA片段，印在一濾膜上，然后用特異性DNA探針雜交印記。此方法有效地降低了基因組DNA樣品的復雜性，因而有利于提高了雜交的專一性與靈敏度。不幸的是，此方法既耗時又費力。第三種方案是進行聚合酶鏈式反應(PCR)或其它的擴增方法。PCR方法擴增(增加)大量的靶DNA序列。靶DNA的擴增有利于克服基因組DNA分析中存在的有關(guān)復雜性和靈敏度問題。所有這些方法都是耗時的，相對復雜的，大大增加了診斷試驗的費用。在這些樣品制備及DNA加工步驟完成以后，進行真正的雜交反應。最后，通過檢測和數(shù)據(jù)處理將雜交結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鼋Y(jié)果。
樣品制備和加工步驟典型地獨立完成，與其它的雜交主要步驟以及檢測和分析區(qū)分開來。實際上，包括樣品制備和DNA加工的各個分步驟常與其它分步驟分離開來，單獨進行操作。就這些分步驟具體而言，樣品可通過許多手段獲得，例如以全血，組織或其它生物流體樣品中得到。在以血液為樣品時，首先需加工樣品除去紅細胞，保留需要的有核細胞(白細胞)。這個方法通常采用密度梯度離心來完成。然后，將細胞裂解或溶解，優(yōu)選地用超聲波、凍融技術(shù)或加入細胞裂解劑。通過離心，將粗DNA與細胞碎片分離開來。在雜交反應之前，雙鏈DNA被變性為單鏈形式。雙鏈DNA的變性通常采用下列技術(shù)，包括加熱(＞Tm)，改變鹽濃度，加堿(NaOH)或加入變性劑(尿素、甲酰胺等)。工作人員建議在電化槽中將DNA變性為單鏈。該理論呈述如下在電極的界面處有電子轉(zhuǎn)移到DNA，這有效地削弱了雙鏈結(jié)構(gòu)，使得雙鏈分離。綜述見Stanley，“通過電壓使DNA變性”，英國專利申請2,247,889,公開于1992年3月18日。
核酸雜交分析通常包括用過量的DNA探針在相對大量的復雜的非靶核酸中檢測微量的特異性的靶核酸(DNA或RNA)。在樣品制備中，使DNA復雜性降低的分步驟被用來幫助檢測低拷貝數(shù)(即10,000到100,000)的靶核酸。利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增靶核酸序列能在一定程度上克服DNA的復雜性(見M.A.Innis等，PCR方案方法和應用指南，學術(shù)出版社，1990)。擴增產(chǎn)生了大量的靶核酸序列，促進了隨后的直接探針雜交步驟，但擴增方法費時，繁瑣，通常必須在一個相對于其它分步驟獨立的基礎上進行。進行擴增所用的裝置比較大并且很復雜。
實際的雜交反應代表著整個方法中最重要也是最核心的步驟。雜交步驟包括，在一組最適條件下，將制備的DNA樣品與專一性報道探針(reporter probe)接觸，使探針與靶DNA序列發(fā)生雜交。雜交可以以眾多方式的任意一種進行。例如，多重樣品核酸雜交分析已經(jīng)在多種濾膜和固體支持物上進行(見G.A.Beltz等，酶學方法，Vol.100，Part B，R.Wu，L.Grossman，K.Moldave編，學術(shù)出版社，紐約，第19章，pp.266-308，1985)。一種方式，即所謂“點印跡”雜交，包括靶DNA與濾器非共價連接，然后，再與放射性同位素標記的探針進行雜交?！包c印跡”雜交被普遍采用，已有許多版本(見M.L.M.Anderson和B.D.Young，核酸雜交-一種實用方法，B.D.Hames和S.J.Higgins編，IRL出版社，華盛頓特區(qū)，第4章，pp.73-111，1985)。它已經(jīng)被改進，可用于基因組突變的多重分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，EPA 0228075，1987年7月8日)，以及重疊克隆的檢測和基因組圖譜的構(gòu)建(G.A.Evans，美國專利5,219,726號，1993年6月15日)。
能在微型方式的多路或矩陣裝置上進行多重樣品核酸雜交分析的新技術(shù)正在發(fā)展起來(例如，DNA芯片)(見M.Barinaga，253 Science，PP.1487，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，PP.757-758，1992)。這些方法通常將專一性DNA序列連接到固體支持物上的一個微小的特殊區(qū)域里，例如一個DNA芯片的微孔里。這些雜交方式是傳統(tǒng)的“點印跡”和“三明治”雜交系統(tǒng)的微型版本。
這種微型雜交方式可用于完成“通過雜交進行測序”(SBH)(見M.Barinaga，253 Science，PP.1489，1991；W.Bains，10Bio/Technology，PP.757-758，1992)。SBH利用所有可能的n-核苷酸寡聚物(n聚物)來確定一個未知DNA樣品中的n聚物，再通過算法分析對其進行排列，得出DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，南斯拉夫?qū)＠暾?570/87，1987；R.Drmanac等，4 Genomics，114，1989；Strezoska等，88美國國家科學院院刊10089，1992；R.Dramanac和R.B.Crkvenjakov，美國專利#5,202,231，1993年4月13日)。
有兩種方式可用于SBH。第一種方式包括將所有可能的n聚物在一種支持物上進行排列，然后再與靶序列進行雜交。第二種方式包括將靶序列連到支持物上，后者再依次與所有可能的n聚物進行探針反應。兩種方式都有直接探針雜交的基本問題，以及多重雜交帶來的額外困難。
Southern在英國專利申請GB 8810400，1988；E.M.Southern等，13 Genomics 1008，1992中提出用第一種方式分析或測序DNA。Southern用PCR擴增基因組DNA，確定了一個已知的單位點突變。Southern還描述了一種在SBH固體支持物上合成一組寡核苷酸的方法。但Southern沒有說明對于在一組中的每一種寡核苷酸怎樣達到最適的嚴格條件。
同時，Drmanac等，260 Science 1649-1652，1993，用第二種方式測定了幾種短鏈DNA(116 bp)的序列。將靶DNA連到膜支持物上(“點印跡”方式)。每一種濾膜連續(xù)地與272個被標記的10聚物和11聚物的寡核苷酸雜交。要完成對每一種n聚物探針的專一性雜交，需采用范圍很寬的一整套嚴格的條件；洗滌時間從5分鐘到過夜不等，溫度從0℃到16℃不等。大多數(shù)探針需要在16℃洗3小時。為了檢測雜交信號，濾膜必須曝光2-18小時。盡管靶序列簡單，寡聚物探針組數(shù)減少，采用了最嚴格的條件，但總體假陽性雜交率仍為5％。
有各種方法可用于雜交事件的檢測和分析。根據(jù)所采用的標記DNA探針的報道基團(熒光團、酶、放射性同位素等)的不同，可用熒光測定，比色法或放射自顯影來進行檢測和分析。通過觀察或測定發(fā)出的輻射，如熒光輻射或粒子發(fā)射，能得到有關(guān)雜交結(jié)果的一些情況。即使檢測方法具有很高的內(nèi)在的靈敏度，雜交結(jié)果的檢測也是困難的，因為存在一些非特異性結(jié)合物的背景。許多其它的因素也可降低DNA雜交檢測的靈敏度與選擇性。
人們已試圖將某些操作步驟或分步驟結(jié)合起來。例如，已提出將各種不同的微自動系統(tǒng)用于在一支持物上制備成組的DNA探針。例如，Beattie等，1992 San Diego會議基因識別，1992年11月，用微自動系統(tǒng)將含有特異性DNA序列的微滴放入位于玻璃基質(zhì)上的各個獨立的微型樣品池中。
通常，現(xiàn)有技術(shù)的方法既費時又費力。例如，PCR擴增過程很費時間，增加了診斷檢測的費用。在各過程中或之間需要人類介入的多個步驟不是處于最佳條件，可能存在著污染或操作失誤。再者，用于完成每一個獨立步驟的眾多的機器或復雜的自動化系統(tǒng)，除了最大的實驗室外，不論物力財力，對于普通實驗室都是無法承受的。
如前所述，為了提供有效地進行多步驟的多樣化的分子生物學反應的技術(shù)，人們已做了大量的努力。然而，由于前述的眾多原因，這些技術(shù)是“零碎”的并且有限的。要將這些不同的方法結(jié)合在一起形成一個能進行完整的DNA診斷檢測的系統(tǒng)是不容易的。盡管人們一直認為需要有這樣一個系統(tǒng)，但到目前為止，仍未提出任何滿意的解決方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及到一種能自我編址，自我組裝的微電子裝置和系統(tǒng)的設計，制作和應用，該裝置和系統(tǒng)能以微觀方式有效地進行受控的多步驟方法和多重反應。這些反應包括，但不限于，大多數(shù)的分子生物學方法，如核酸雜交，抗體/抗原反應，及相關(guān)的臨床診斷。此外，這個要求保護的裝置和系統(tǒng)能夠進行多步驟的聯(lián)合的生物聚合物的合成，包括，但不限于，在一給定裝置的特異性微位點上合成不同的寡核苷酸或多肽。
這個要求保護的裝置和系統(tǒng)的制造利用了微印刷技術(shù)與微加工技術(shù)。在基本裝置的表面有一個可編址的微位點矩陣；對每一個獨立的微位點能夠電子控制，并指導特異性結(jié)合物(如核酸、酶、抗體)轉(zhuǎn)運及連接到它的上面。所有的微位點能夠通過其特異性結(jié)合物被編址。這個自編址過程依流控或機械部件而需要最少的外部干涉。
這個裝置能夠控制和有效地進行各種的檢測和反應。分析物或反應物可通過自由電場電泳被運送到任何一個特異性微位點上，在那里，這些分析物和反應物被有效地濃縮，并與結(jié)合在微位點上的特異性物質(zhì)發(fā)生反應。在雜交分析時，由于雜交反應物在特異性微位點上被濃縮，因而提高了檢測特異性分析物或反應物的靈敏度。通過轉(zhuǎn)變微位點的極性，可將任何未結(jié)合的分析物或反應物移去。因此，這個裝置還能增進反應的專一性。這個用于核酸雜交或其它分析的基本裝置還可叫做APEX裝置，意思是可編址可編程的電子矩陣(addressable programmableelectronic matrix)。
在本發(fā)明的一個方面中，其它的處理步驟或分步驟可以用一個“系統(tǒng)”依次進行。該系統(tǒng)是若干部件的集成排列。每一個部件被適當?shù)卦O計，按比例縮小，以行使特別的功能。在其最完備的實施方案中，系統(tǒng)能行使各方面的功能，包括樣品制備、雜交、檢測和分析。在這種最完整的方式中，首先是進行樣品的制備，如通過一個電子細胞分選器部件。通常，電子裝置特別地具有通過電泳轉(zhuǎn)移帶電物體離開或進入部件的能力。隨后的DNA加工和復雜性降低可選地由一個粗DNA選擇器部件和限制性片段選擇器部件來完成。將最后處理的靶DNA轉(zhuǎn)移到分析部件上，在其上以微觀多重方式進行電子雜交分析。這個分析部件還可叫做APEX或分析芯片。與之相連的檢測和圖象分析部件給出結(jié)果。
在此系統(tǒng)中，各種材料可通過自由電場電泳、溝流、流控或其它技術(shù)在各部件(裝置)間轉(zhuǎn)移?？蛇x地裝有一個電子試劑分配器，該部件能通過電泳將各試劑提供給該系統(tǒng)的其它加工部件?？蛇x地裝有一個廢棄物電子處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)由一個電極和帶電的矩陣材料(matrix material)構(gòu)成，能吸附帶電廢棄物?？蛇x地裝有一個DNA片段電子貯存系統(tǒng)，該系統(tǒng)能暫時容納用于以后雜交分析的其它DNA片段。
在本發(fā)明的一個方面，基因組DNA復雜性的降低是通過下述步驟實現(xiàn)的，將含有所需目的序列的特異性DNA片段從大量的不含目的序列的DNA物質(zhì)中分離出來。粗DNA被轉(zhuǎn)移并連接到一支持物上。然后用適當?shù)南拗菩悦盖懈罱Y(jié)合物。切下的DNA片段被轉(zhuǎn)移到一個能選擇性雜交特異性DNA片段的部件上。經(jīng)過進一步的限制性酶切作用，那些含有待分析靶序列的片段被選擇性釋放，并被轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)的分析部件(APEX芯片)上。這個方法可以重復，用于測定含有其它目的序列的其它片段。
這個裝置(或系統(tǒng))有一個控制器，能分別控制該裝置的各個方面。當運用包含有可編址微位點的APEX裝置或芯片時，控制器使獨立的微位點受電子控制，使其能指示特異性結(jié)合物轉(zhuǎn)移并連接到該位點上。該裝置能在完全的，精確的電子控制下，優(yōu)選地是在一個具微處理機的部件控制下進行多步驟的多重反應。在該裝置的特異性微位點上，多步驟多重反應的速率、專一性、靈敏度被大大提高。這個控制器通過輸入/輸出裝置如顯示器和鍵盤與用戶聯(lián)系。優(yōu)選地是有一個圖形用戶接口，更能方便用戶。輸入/輸出裝置連接到一控制器上，后者再依次控制系統(tǒng)的可編址電子位點的電子狀態(tài)。這個控制器能特異性地指示電源/波形發(fā)生器產(chǎn)生不同微位點的電子狀態(tài)?？蛇x地，在電源/波形發(fā)生器與APEX裝置或系統(tǒng)之間安裝一個接口。這個接口優(yōu)選地包括一組繼電器，這些繼電器通過一個多功能輸入/輸出連接器與控制器相連。這些繼電器優(yōu)選地通過控制連接器的極性，連接存在與否，提供給獨立位點的電壓或電流量而將電源/波形發(fā)生器與APEX裝置連接起來。該控制器優(yōu)選地能控制指示雜交系統(tǒng)的照明源。將一個檢測器、圖像處理和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)與APEX裝置進行光學連接。在一優(yōu)選的實施方案中，一個熒光顯微鏡被用來接收和放大發(fā)生在該裝置中各微位點上的雜交事件的圖像。其發(fā)射由一個電荷耦合器件(CCD)陣列或微通道平板檢測器進行光學過濾和檢測。然后將圖像貯存和分析。結(jié)果優(yōu)選地在顯示屏上呈現(xiàn)給用戶。
本發(fā)明的另一方面，形成了具有眾多微位點的雜交系統(tǒng)，這些微位點位于包含有電子控制器件的基底的上面。特別地，提供開關(guān)電路來為微位點獨立地編址。通過相對于樣品接觸之處的后部建立電子連接。另外，將一個光路例如波導管置于微位點下，使得能從后部接近微位點。如有必要，可通過波導管將光刺激導向微位點。通過后部的波導管可檢測發(fā)出的輻射。在本發(fā)明的另一方面，一個樣品容納系統(tǒng)被置于該系統(tǒng)之上，特別是在雜交矩陣區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，矩陣雜交區(qū)域(包括樣品容納部件)可被改造以便從提供電子控制和檢測元件的裝置的剩余部分中除去。
在本發(fā)明的另一方面，描述了形成矩陣雜交系統(tǒng)的一些改進方法。在一種方法中，一種基質(zhì)，例如硅，與一絕緣層如厚氧化物一起形成。導電的微位點可通過將金屬(如鋁或金)沉積在上面而形成，然后通過常規(guī)的光刻技術(shù)形成圖形。可通過如由PECVD形成TEOS來形成一絕緣層?？蛇x地，在TEOS層上形成一個氮化物鈍化層。通過氮化物和玻璃可以形成到微電極的開口。可選地利用增粘物如鈦鎢合金與金屬層相連，以增加對氧化物和/或玻璃的粘附。在進一步的改進方法中，通過從下部切去由基底支持的氧化層上的氮化物層，可在電極的上部形成凹孔。
可對獨立的微位點進行電子控制，以便控制電壓或電流。當其中一個被設定，另一個可被監(jiān)控。例如，當電壓被設定后，可監(jiān)控電流。電壓和/或電流可以為直流方式，或可以隨時間變化。例如，可利用脈沖電流或直流偏置。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一個生物材料的樣品制備、加工、雜交、檢測和分析的系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一個能將多個步驟或分步驟結(jié)合到一起的集成系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一個自動DNA診斷系統(tǒng)。
附圖簡述圖1顯示樣品制備、雜交、檢測及數(shù)據(jù)分析等各步驟及分步驟的順序。
圖2A和2B為有源可編程矩陣系統(tǒng)的截面圖(圖2A)和透視圖(圖2B)。
圖3顯示位于金屬掩膜層上的有源可編程矩陣系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。
圖4為有源可編程矩陣系統(tǒng)的詳細平面圖。
圖5為單一微位點和電子連接的透視圖。
圖6為包括電子細胞分選器矩陣、DNA選擇器、限制性片段選擇器和雜交矩陣的系統(tǒng)的平面圖。
圖7為控制系統(tǒng)的框圖說明。
圖8為帶有相關(guān)電子裝置的有源可編程矩陣系統(tǒng)的截面圖。
圖9為另一種層狀的有源可編程矩陣系統(tǒng)的截面圖，該系統(tǒng)具有到達微位點后部的光電通路和生物容納覆蓋物。
圖10為安裝在配套載體中的APEX系統(tǒng)的透視圖。
圖11A-G顯示制備裝置的各加工步驟。
圖12為利用多晶硅結(jié)構(gòu)制備的裝置的截面圖。
圖13為利用增粘層制備的裝置的截面圖。
圖14顯示在電極上部有一加大的貯存空間的裝置。
圖15顯示適于各種電壓電流狀況的用戶顯示器。
圖16為DNA純化系統(tǒng)的截面圖。
圖17為一種毛細管陣列制造系統(tǒng)和裝置的截面圖。
圖18為一同心結(jié)構(gòu)的微位點的透視圖。
發(fā)明詳述圖2A和2B表明應用本發(fā)明設計的一個有源可編程電子矩陣雜交系統(tǒng)的簡化形式。通常情況下，由基底10支持著整個矩陣或排列整齊的電子控制的可編址的一系列微位點12。為易于解釋，圖2A中的各個微位點被標明12A、12B、12C和12D。滲透層14位于獨立的電極12之上。滲透層允許相對小的帶電物質(zhì)穿過，但阻止了大的帶電物質(zhì)如DNA與電極12直接接觸。這個滲透層14避免了當DNA直接與電極12接觸時可能發(fā)生的電化學降解。它還能避免DNA牢固地非特異性地吸附到電極上面。附著部位16位于滲透層14之上，為靶物質(zhì)提供專一性的結(jié)合位點，與對應的電極12A-D一致，附著部位16被分別叫做16A、16B、16C和16D。
在操作過程中，樣品池18包括了附著部位16上部的空間，樣品池中裝有待檢測、待分析或使用的目的物或非目的物。帶電物20，如帶電荷的DNA位于樣品池18中。在本發(fā)明的一個方面，這個有源可編程矩陣系統(tǒng)包含了一個方法，能將帶電荷物質(zhì)20轉(zhuǎn)移到任何一個特異性微位點12上。當一個微位點12被激活后，便產(chǎn)生自由電場，任意一個帶電荷的功能化的特異性結(jié)合物20能通過電泳轉(zhuǎn)移到電極12上。例如，如果電極12A為正極，電極12D為負極，電泳力線(electrophoretic line offorce)22將在電極12A與12D之間。電泳力線22使得帶凈負電荷的結(jié)合物20向正極12A移動，帶凈正電荷的帶電物質(zhì)20向負極12D移動。在電泳力的作用下，帶凈負電荷的已功能化的特異性結(jié)合物20向正極移動，與附著層16A接觸，并共價連接到附著層16A上。
若要保護不參加反應的附著層如16B和16C，只需對應的電極12B和12C帶負電荷即可。這使得電泳力線從附著部位16B發(fā)散出來(為簡單起見，只討論16B，對16C而言，結(jié)果類似)。電泳力線24將帶負電荷的結(jié)合物20從附著層16B驅(qū)趕向附著層16A。以這種方式，在附著層16周圍形成了一個“力場”保護，而此時此刻，該附著層應不與帶電荷分子20發(fā)生反應。
該系統(tǒng)的一個非常有利的結(jié)果是，在與信號附著層16相鄰的部位，帶電結(jié)合物20能被高度濃縮。由透視圖2B可見，如果一個微位點26A帶正電荷，其它的微位點均帶負電荷，則電泳力將使帶凈負電荷的結(jié)合物20向微位點26A移動。在圖2A中，用微位點26A來描述一個由附著層16、滲透層14及連于其下的電極12構(gòu)成的組合。以此種方式，待分析物或反應物能在此裝置中的任一個特異性微位點上進行濃縮和反應。當特異性結(jié)合物20結(jié)合到附著層16以后，位于其下的微電極12將以直流(DC)的方式繼續(xù)行使其功能。這個獨特的性質(zhì)，使得游離在溶液中的濃度相對稀的帶電分析物或反應物分子能在任意一個與其持相反電荷的特異性微位點上以順序地或平行的方式被迅速轉(zhuǎn)移、濃縮和反應。這種在挑選出的微位點26上濃縮稀分析物或反應物分子的能力大大加速了在這些微位點26上進行的反應的速度。
當目的反應完成以后，電極12可以將其電壓逆轉(zhuǎn)，因而在與原先的吸引力相反的方向上產(chǎn)生一個電泳力，這樣，可將非特異性的分析物或未反應分子從微位點26上除去。特異性的分析物或反應產(chǎn)物可從任意一微位點26釋放出來并轉(zhuǎn)移到其它微位點上進行下一步分析；或在其它可編址的微位點上貯存起來，或?qū)⑵鋸南到y(tǒng)中完全除去。通過將電場逆轉(zhuǎn)來除去或稀釋物質(zhì)加強了該系統(tǒng)的鑒別能力，使其可將非特異性連接的物質(zhì)除去。通過控制對非特異性連接在附著層16上的物質(zhì)的排斥電泳力的數(shù)量，可以完成電子實時控制。提高電極12處的電壓，使之能產(chǎn)生一個足以除去部分雜交的DNA序列的電場，這樣一來，單一錯配對的雜交及點突變均可被識別。
在各個不同的附著層16，每步操作可平行進行也可依次進行。例如，參考圖2A，一個反應可首先如所示利用電壓在附著層16A上發(fā)生。電極12A處的電壓可被逆轉(zhuǎn)，即變?yōu)樨摌O，在相鄰電極12B處的電壓可被變?yōu)檎龢O。以這種方式，可進行一系列的反應。沒有特異性地連接到附著層16A上的物質(zhì)將被電泳力轉(zhuǎn)移到附著層16B。以這種方式，利用濃縮方式使得特異性附著層處具有高濃度，這樣會受到正電泳力的作用。被濃縮了的物質(zhì)再被轉(zhuǎn)移到相鄰的或其它的附著層16。也可采用另一種方式，在有一個凈電泳力場從電極12發(fā)散出來，穿過附著層16，進入樣品池18時，可使多重附著層16去除保護。一旦去除了多重附著層16的保護，便可進行多重反應。每一個單獨的位點26實際上就是一個獨立的生物“試管”，在“試管”中，由一已知附著層16編址的特定的環(huán)境不同于其它附著層16周圍的環(huán)境。
圖3為一個有源可編程電子矩陣系統(tǒng)的金屬掩膜層的平面圖。眾多的單個電極30優(yōu)選地 按一定形式排列。例如，排成一個8×8的電極30矩陣?？梢赃x擇裝上一個額外的控制或轉(zhuǎn)儲緩沖器以幫助產(chǎn)生目的電泳場。電極30和緩沖器32同接觸緩沖器34相連。對應于64個電極30和4個緩沖器32，有68個接觸緩沖器34。導線36將電極30和緩沖器32分別同接觸緩沖器34連接起來。如圖所示，采用一個成扇形散開的圖形使得電極30和緩沖器32所處的相對密集的部分與金屬掩膜的邊沿部分36連接起來。
圖4為圖3金屬掩膜的部件分解平面圖。形成的金屬化系統(tǒng)大體上與金屬掩膜圖形類似。如圖所示，電極30基本上為方形結(jié)構(gòu)。導線36將電極30與接觸緩沖器34連接起來(圖3)。導線36的寬度優(yōu)選地為1到20微米。
圖5為一個電極50的透視圖，電極50直接與導線52相連。滲透層54位于導線50之上，而附著層56位于滲透層之上。
在微型平版印刷產(chǎn)生的裝置中的滲透層的厚度可從1個納米到500個微米不等。優(yōu)選地是在500納米到50微米之間。滲透層應該覆蓋整個電極表面。滲透層可由任何適宜的材料如多聚物、陶瓷、溶膠-凝膠、多層復合材料、粘土、控孔玻璃等構(gòu)成。
圖6為自動樣品制備與制備物雜交的完整系統(tǒng)60。將樣品62，如血液或其它生物材料，加入到系統(tǒng)60中。通常需有一個進樣口64。當有一個位于上面的生物容納結(jié)構(gòu)存在時，通常需利用進樣口64，因為若不通過進樣口64，樣品62不能夠直接加入系統(tǒng)。
在系統(tǒng)60中，經(jīng)過電子細胞分選器矩陣部件66，DNA選擇器部件64和限制性片段選擇器部件70的聯(lián)合作用，樣品得以制備。電子細胞分選器矩陣部件66由位于下面的電極以及滲透層和附著層構(gòu)成。它們有效地形成了一個附著細胞的位點矩陣。通常獨立位點的面積與整個矩陣的面積大于一個分析裝置部件上的面積。因此，電子細胞分選器矩陣的大小應加以調(diào)整使其適應于來自不同樣品和不同大小樣品的細胞數(shù)量的變化。通常，附著層能為細胞所選擇，或為不同類型的細胞單獨選擇。可任意使一組或一排位點被一種類型的細胞所選擇。通過連接特異性抗體或細胞粘合因子到附著層上，可給予細胞選擇性。矩陣66由自由電場電泳來操作。
粗DNA選擇器68和限制性片段選擇器70能夠結(jié)合從電子細胞分選器矩陣66來的粗DNA產(chǎn)品，并允許對來自結(jié)合物的目的DNA片段進行選擇性切割。術(shù)語“粗”僅僅用來表示DNA分離或復雜性降低的一個非最終階段。DNA連接在選擇器上，其連接部位不包括目的DNA片段。然后用限制性酶類將目的DNA從結(jié)合物上切割下來。這個切下的沒有連接的物質(zhì)被機械地從粗DNA選擇器68轉(zhuǎn)移到限制性片段選擇器70上。優(yōu)選地用電泳轉(zhuǎn)移切下的物質(zhì)。此過程可以重復，方法是將切下的物質(zhì)連到一個選擇器上，用一限制性酶切下處于未連接部位的目的DNA片段。
例如，人DNA含有約100,000個基因。在總DNA中，一個很大的部分由不含目的DNA信息的重復序列組成。借助這些不含信息的重復序列，DNA結(jié)合到選擇器上。這個結(jié)合上的DNA可在含有待分析的目的DNA的未結(jié)合部分被切割。然后，將更具特異性的序列再結(jié)合到選擇器上，可重復此過程。
接著，將限制性片段選擇器70的產(chǎn)物提供給APEX芯片72。矩陣72的運作按圖2A與2B所述進行。
用于降低DNA復雜性的另一種技術(shù)是采用基于DNA的親和層析。一條單鏈DNA片段與另一條單鏈DNA片段的親和性依賴于它們之間堿基對互補的程度。當層析系統(tǒng)的固定相含有一段特定序列或許多特定序列，流動相中的任一單鏈DNA將附著在固定相上，其附著量的大小主要依賴于其序列與固定相中的俘獲序列配對的程度。這使得層析分離依賴于DNA與固定相中俘獲序列的親和性。
一種利用微位點矩陣的基于互補DNA的親和層析方法為用一特定序列或一組序列做俘獲探針去修飾一系列的位點。這構(gòu)成了固定相。DNA樣品被編址到一個微位點上，然后再依次從一個微位點移到下一個微位點。用電子實時控制來限制在每一個微位點上與俘獲探針緊密配對的DNA的量。以這種方式，與俘獲探針配對的DNA將被迅速從樣品中移去。
在一系列微位點上通過依賴于DNA的親和層析來連續(xù)純化一種DNA樣品的發(fā)明可統(tǒng)一為一種連續(xù)的模式。圖16為該系統(tǒng)的截面圖。在此，電極210為一長條形式，被一適當?shù)墓潭ㄏ嘈揎棥Ａ鲃酉啾幌拗圃谖挥诠潭ㄏ嗌系? 通道212里。借助于物質(zhì)對流，流動相通過固定相。另一種方法是，流動相中的離子可通過電場214的作用在固定相中移動。將獨立的單個電極216放在長條電極的兩端可建成電場214。將一轉(zhuǎn)換或脈沖電流加在長條電極上可進行電子實時控制。這促使DNA進入或離開固定相。
用于降低DNA復雜性的另一種方法是用一個微孔篩來選擇樣品的大小。用樹枝晶填充任意幾何模槽可形成微孔篩。將一些化學物如金屬鹽、陶瓷材料、單體與多聚物以及其它物質(zhì)進行電化學降解，可得到樹枝晶。通過調(diào)節(jié)加到電極上的電信號可控制微孔篩的孔徑。例如，樹枝晶可形成柵欄形結(jié)構(gòu)或分形結(jié)構(gòu)。
在一個APEX裝置上形成微孔篩的方法包括形成一個具有相反金屬電極的長通道。當這個通道充滿了適當?shù)幕瘜W物，并將適當?shù)碾娦盘柤釉陔姌O上，在兩電極之間的填隙空間里，將形成樹枝晶，由此構(gòu)成微孔篩。
再回到圖6，電子試劑分配系統(tǒng)74用來給系統(tǒng)60提供試劑。如果這些試劑帶電荷，優(yōu)選地通過電泳力來運送?？蛇x地在系統(tǒng)60中裝入一電子廢棄物處理系統(tǒng)76。該廢棄物處理系統(tǒng)76能吸引帶電荷的廢棄物顆粒，并將其牢牢吸住，從而處理之。還可選地在系統(tǒng)60中裝入一DNA片段貯存系統(tǒng)78。該片段貯存系統(tǒng)78能夠暫時容納DNA片段，等待進一步的分析。
系統(tǒng)60可包括上述的部分或全部功能。例如，由DNA選擇器68和限制性片段選擇器70完成的復雜性降低形式的樣品制備，該組合可以與分析矩陣72相連。無論如何，任何或全部上述功能可以根據(jù)需要進行組合。
圖7為包括控制器在內(nèi)的整個系統(tǒng)的方框圖。通過對電極進行電壓控制，或讓控制電流通過電極，可使APEX裝置中位于下面的電極有源。當APEX裝置上每一個電極的電壓或電流被獨立控制時，可實現(xiàn)全部功能化。這一切由APEX控制系統(tǒng)來完成。
控制器計算機80與用戶輸入/輸出裝置相連，如顯示器82和輸入裝置84。顯示器82可以是任何形式的常規(guī)顯示器，如監(jiān)視器或計算機屏幕。輸入84可以是任何常規(guī)的用戶輸入裝置如鍵盤，鼠標或觸屏裝置?？刂破饔嬎銠C80與電源和波形發(fā)生器86相連?？刂破?0促使電源和波形發(fā)生器86向接口88提供電流或電壓輸出。在優(yōu)選的實施方案中，電源或波形發(fā)生器86能提供準確調(diào)控的電壓和電流?？刂破饔嬎銠C80通過多功能輸入/輸出板90給接口88提供控制信號。接口88給APEX系統(tǒng)92的接觸器提供簡化了的連接。
接口優(yōu)選地包括有繼電器，這些繼電器使得在電源和波形發(fā)生器86與APEX系統(tǒng)92的專一性電極之間存在選擇性連接。在一個實施方案中，接口88由眾多的將電源和波形發(fā)生器86與APEX系統(tǒng)92的電極連接起來的繼電器構(gòu)成。電源和波形發(fā)生器86與APEX系統(tǒng)92電極間的連接可以是選擇性的也可是非選擇性的。另外，還有一種繼電器允許對提供給APEX系統(tǒng)92電極的電壓極性進行選擇。如果能達到多源水平，例如來自一個多輸出電源86，那么連接到APEX系統(tǒng)92電極上的特異性電壓水平將被單獨設置，使其不同于那些與別的電極相連的電壓水平。
因此，如圖2A所述，使一些電極(如12B和12C)為負極，但電壓低于電極12D，附著層16B和16C將受到局部力場的保護。
接口88能為APEX系統(tǒng)92的各獨立電極選擇所需的電壓。另外，如此不同的電壓安排也可以通過一個電壓分配器來完成。
在一個優(yōu)選實施方案中，控制器計算機80為Macintosh Quadra 950。國家儀器公司(National Instruments Corporation)LabVIEW軟件被用于為用戶提供軟件接口，使之能為與APEX相連的裝置編程，并能收集和處理測定數(shù)據(jù)。國家儀器公司NuBus主板被用于提供從Quadra 950計算機到電源裝置86的硬件接口，使能提供電壓和電流，測定實際電流和電壓及檢測結(jié)果。
用戶通過一個由LabVIEW軟件創(chuàng)造的Virtual Instrument控制測定。這個Virtual Instrument給用戶提供一個友好的用戶能夠控制的圖形表示，及將這些控制應用到APEX裝置上進行測定的一些結(jié)果的圖形表示。用戶通過Quadra 950計算機的鍵盤和鼠標(統(tǒng)稱，輸入84)與VirtualInstrument相連。Virtual Instrument為國家儀器公司NB-MIO-16XL多功能輸入/輸出90和與Quadra 950的NuBus數(shù)據(jù)總線相連的國家儀器公司DMA2800主板提供軟件接口。
多功能I/O主板能提供數(shù)字和/或模擬信號給外部裝置以完成由用戶通過Virtual Instrument指定的編程序列。在Quadra 950中，在VirtualInstrument控制下，MIO主板也能數(shù)字化和貯存由連接到APEX上的裝置產(chǎn)生的信號。DMA2800提供迅速貯存由MIO主板繞過Quadra 950CPU，通過直接存儲存取獲得的數(shù)據(jù)的能力。DMA2800也能提供一個GPIB(IEEE 488)接口用于控制符合于IEEE 488通迅和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移標準的外部裝置，其中包括許多最現(xiàn)代化的儀器。
在這種控制器的優(yōu)選實施方案中，兩個外部裝置被用于提供電壓或電流給APEX。Keithley 236 Source/Measure Unit電源86作為可精確調(diào)控的電壓或電流源提供適當?shù)姆€(wěn)定性和可變性。SMU 236提供電壓及測定所得電流或提供電流及測定所得電壓。這個裝置在GPIB控制下由Virtual Instrument編程，通過DMA2800主板控制電流或電壓水平和時間依賴性，測定和貯存提供給APEX的實際電壓和電流。
發(fā)出的電流或電壓通過接口88中的一排繼電器提供給APEX。這個接口88給在無連接，與正極相連和與負極相連之間的每個電極提供單獨的開關(guān)。這個優(yōu)選的實施方案也能提供一個以上的Source/Measure源，可利用來給不同的電極提供不同水平的正和負電壓或電流。由一個具有9個16-通道，連接在機殼上的Class 3 Relay Modules，提供總共144個繼電器的National Instruments SCXI Chassis提供排列整齊的一組繼電器。每個電極需用兩個繼電器，將它們提供給不與正極或負極相連的電極，或與正極或負極相連的電極。在優(yōu)選的實施方案中，一大束電纜通過一個Cerprobe探針卡將這些繼電器與APEX裝置連接起來，這個探針卡使得探針與APEX裝置的連接柄機械接觸。
控制器計算機80選擇性地控制用于DNA雜交檢測的熒光發(fā)射的光源94。在優(yōu)選的實施方案中，光源94是一束激光，它在一定波長發(fā)生輻射以激發(fā)APEX系統(tǒng)92中的熒光標記物。
APEX系統(tǒng)92的輸出通過觀察途徑96到檢測器98。這個觀察途徑96可以是一個物理結(jié)合物例如通過一個光導纖維，或可以構(gòu)成一個光路例如通過一個顯微鏡。在觀察途徑中可以利用濾光器來減少檢測器里與APEX系統(tǒng)92中熒光標記物的發(fā)射光譜不一致的波長下的光照。另外，在激光光源94的發(fā)射波長下，需用凹面濾器來減少檢測器98的光照。檢測器98可任意形成一個APEX系統(tǒng)92的圖像，如通過一個冷卻的CCD照像機。除此之外，或換一種方式，形成一個光學圖像，從APEX系統(tǒng)92發(fā)射的熒光輻射可通過常規(guī)方法來檢測，例如光電二極管或光電倍增管。檢測器98的輸出被提供給數(shù)據(jù)處理/分析系統(tǒng)100。該系統(tǒng)監(jiān)測APEX系統(tǒng)92中被檢測的探針的量?？蛇x地將一個專家系統(tǒng)用于分析系統(tǒng)100中。
在優(yōu)選的實施方案中，一個Data Translation Frame Grabber主板與Quadra 950 NuBus相連，使能俘獲圖像的記錄，這些圖像由諸如用于裝置中的Optronics冷卻的彩色CCD照像機記錄。這個CCD照像機通過一個具有合適濾器的顯微鏡觀察APEX裝置，提供APEX上的熒光圖像。
另一種系統(tǒng)能賦予控制器上述所有的功能，但得運用加入印刷電路板的常規(guī)裝置和運用常規(guī)軟件，通過一個類似的用戶所需的接口去控制電路板。這種改變了的系統(tǒng)也能將整齊排列的繼電器的開關(guān)元件加入一位于有源可編程矩陣系統(tǒng)中的半導體裝置上。圖8為有源可編程矩陣系統(tǒng)的另一種實施方案的截面圖?？瑟毩⒕幹返碾姌O102在一支持層104上形成。這個支持層104優(yōu)選地是一絕緣體。在電極102上優(yōu)選地放置滲透層106和與獨立電極102對應的獨立附著層108。一個電子連接物110從電極102的后邊穿過支持物104。另外，一個半導體支持物112包括與導體110相連的電路元件114。這個電路元件能在半導體112上面或里面形成。這個電路元件能獨立控制從導體110到電極102的電壓和/或電流。具體地說，電路元件114能結(jié)合在優(yōu)選的實施方案中整齊排列的繼電器的開關(guān)元件上。對應于每個電路元件114的多重電流/電壓源線116能夠為不同的電極102提供不同大小的電流/電壓。記憶型地址線118為獨立的電路元件114提供方便的激活通路。
波導管用于將發(fā)射光導向微位點及將熒光導向檢測器。波導管可自由安裝，如可在一光導纖維里，或被整合進一單片半導體裝置中。波導管可由氧化鋅，氧化銦錫這類也能導電的物質(zhì)組成。波導管既能作為電極，也能作為傳送光輻射的工具。波導管可被定位在俘獲探針的平面上或其附近，以減少非特異性背景熒光。波導管能結(jié)合全息照像光學元件。全息照像光學元件的功能包括(不排除有其它功能)凹面濾光鏡，二色性鏡，光譜通帶濾光鏡，光束分離器，中密度濾光鏡，半波片，四分之一波片，起偏鏡和透鏡。
圖9為有源可編程矩陣系統(tǒng)的另一種層狀結(jié)構(gòu)的截面圖。在第一層，獨立電極120在一支持物122上形成，支持物122優(yōu)選地是絕緣的。在電極120之上優(yōu)選地形成一滲透層124和對應于獨立電極120的獨立附著層126。光路128通過支持物122接近電極120。光路128優(yōu)選地由光導纖維或光導管或結(jié)構(gòu)組成?？蛇x地有一電子結(jié)合物130穿過支持物122從后邊接近電極120。術(shù)語“后邊”在此是指與支持物122接觸的電極120的一邊。在第二層，一個半導體支持物132包括與導體131相連的電路元件133。導體130設計為其上表面與位于第一層后邊的導體130的底部緊密配合并形成良好的電接觸。電路元件133可在半導體132上面或里面形成。電路元件133可獨立控制從聯(lián)合導體131和130到電極120的電壓和/或電流。具體地說，這個電路元件133能結(jié)合在優(yōu)選的實施方案中整齊排列的繼電器的開關(guān)元件上。這些電路元件可由多重電流/電壓源線供應，能被記憶型地址線激活。可選地將一檢測器元件134，例如光電二極管，加入到半導體層132上，通過光路135與第一層的光路128連接，使得該檢測器元件可監(jiān)控在第一層附著點126上進行的DNA雜交反應。這些光路可以 為光導纖維或波導管，能加入上述的各種光學元件?？蛇x地將一生物密封容器136置于該結(jié)構(gòu)周圍用于裝正在分析或測定的生物材料?？蛇x地有一個液體輸入口137或光學觀察口138。生物密封容器136和任意的端口137和138可與在此描述的任何一種有源可編程矩陣系統(tǒng)相連使用。
圖10為有源可編程矩陣系統(tǒng)的裝配系統(tǒng)的透視圖。將如圖3和圖4所示結(jié)構(gòu)安裝在一片狀結(jié)構(gòu)上可形成系統(tǒng)140。片狀結(jié)構(gòu)140通過接觸緩沖器(圖3)之間的導線146相連，片狀結(jié)構(gòu)載體144連接緩沖器142。片狀結(jié)構(gòu)載體144優(yōu)選地包括獨立的插頭147，這些插頭通過緩沖器142提供電流到導線146，再到片狀結(jié)構(gòu)140上。插頭147與插座148相連，后者再依次與控制系統(tǒng)相連。
有源可編程微位點矩陣也可由毛細管構(gòu)成。圖17為該系統(tǒng)及其產(chǎn)物。毛細管矩陣可通過將毛細管堆積成任意幾何排列220而形成，或通過加熱器222加熱熔化，和由拉絲模224拉絲，將這些排列220變成一粘附的整體單元226而形成。另一種方式，由兩種不同材料構(gòu)成，相互以同心圓形式排列的固體棒可用來代管毛細管。圖8為這種結(jié)構(gòu)的透視圖。在此，構(gòu)成內(nèi)核230的物質(zhì)選擇性地從外層物質(zhì)234蝕刻出來，形成一個貫穿全部或部分裝置的洞232。換一種方式，將內(nèi)核以一定方式蝕刻，使形成一個可控制孔徑的玻璃。
獨立的毛細管通過插入其中的電線被編址，或通過將毛細管矩陣附加到平版印刷形成的電極的互補矩陣上被編址。另外，固體棒的內(nèi)核可由一導體物質(zhì)形成。通過將固體棒矩陣附加到電極的互補矩陣上，或通過在固體棒上平版印刷形成的電極，能形成同內(nèi)核物質(zhì)的電連接。
毛細管和蝕刻固體棒內(nèi)充滿一種合適的物質(zhì)，以形成滲透層。滲透層的表面可通過特定附著化學物而被功能化。
電泳轉(zhuǎn)移的另一種方法是通過物質(zhì)對流將物質(zhì)轉(zhuǎn)移到微位點上。能完成該過程的裝置為轉(zhuǎn)盤。在此，物質(zhì)對流通過存在于轉(zhuǎn)盤和溶液之間邊界處的流體切力而完成。液體直接從本體溶液流到表面上。一個電極緩中器矩陣被連到一個轉(zhuǎn)盤上，或矩陣中的每個電極可被連到一獨立的轉(zhuǎn)盤上。在后一種情況，每一個電極可通過物質(zhì)對流運輸被選擇性偏址。在通過物質(zhì)對流運輸將緩沖器編址后，電極可被用于通過電泳除去不需要的物質(zhì)。
用于形成有源可編程矩陣系統(tǒng)的一優(yōu)選方法如圖11A-G所述。一種半導體150，優(yōu)選地是p-型，實驗級硅，其上形成厚(10,000)的氧化物層152。圖11B為在氧化物層152的上面形成一金屬層154。所用金屬優(yōu)選地選自下列金屬鋁、金、鉑、鈀、鈦、鈦/鎢。半導體多晶硅也可用來代替這類金屬。圖11C為在氧化層152上形成圖形化的鋁156。這種金屬可通過任何常規(guī)的平版印刷術(shù)例如照相平版印刷術(shù)形成圖形。
圖11D為具有一玻璃外殼(例如TEOS)的圖11C的結(jié)構(gòu)。TEOS優(yōu)選地由PECVD技術(shù)形成。玻璃優(yōu)選地在相對高的溫度下，如475℃下形成，以提高對金屬層156的粘附。然后，在TEOS層158外面包上一氮化物層160。氮化物層160和TEOS層158優(yōu)選地在圖形化電極區(qū)域156上面的地方被蝕刻。由此形成一個窗口162，使得可與圖形化電極156直接聯(lián)系。
圖11G為將整個結(jié)構(gòu)暴露給氨基丙酸硅賓(APS)的結(jié)果。APS 164附著到圖形化金屬層156上，與氮化物層160無聯(lián)系。APS層充當DNA俘獲探針的附著層。
圖12為另一種結(jié)構(gòu)，其中用多晶硅代替通常的金屬聯(lián)系物。結(jié)構(gòu)與圖11F的結(jié)構(gòu)類似，但包括一代替鋁層156的多晶硅層166。優(yōu)選步驟的順序如下。首先，半導體，優(yōu)選地是p-型的實驗級的硅，用厚(10,000)的氧化物進行氧化。形成一個導體多晶硅層，優(yōu)選地是形成厚達5,000的多晶硅層。然后將多晶硅做出圖形，優(yōu)選地是通過照相平版印刷術(shù)用濕蝕刻來做圖形。接下來，形成一個玻璃層，例如通過PECVD沉積的TEOS。在475℃形成的大約厚3,000的玻璃層用于提高其粘附性。然后又將玻璃層做出圖形，優(yōu)選地是通過照相平版印刷術(shù)用濕蝕刻來做圖形。然后在表面形成一金屬層，優(yōu)選地是通過噴鍍鋁使其達到3,000的厚度。然后將金屬層做出圖形，優(yōu)選地是通過照相平版印刷術(shù)用濕蝕刻來做圖形。接下來，形成氮化物層，優(yōu)選地通過PECVD在70℃使其厚度為3,000。然后，通過照相平版印刷術(shù)用濕蝕刻形成一個通道，使其能與電極接觸。
圖13為通過應用中間粘附金屬如鈦鎢合金，使得金屬導體與位于其下的絕緣層間的粘附性提高的結(jié)構(gòu)。一種半導體170，優(yōu)選地是硅，其上有氧化層172。由導電金屬如金或鋁形成的中間電極層176被夾在鈦174和鎢178之間形成三明治結(jié)構(gòu)。粘附金屬層178與外部電極184相連，該電極優(yōu)選地由鉑構(gòu)成。玻璃層180，例如由TEOS構(gòu)成，位于外部的氮化物外層182之下。
圖14為一改進了的電極陣列的截面圖。電極190與一絕緣層192相鄰，該絕緣層優(yōu)選地為氧化物。氮化物層194位于絕緣層192之上。優(yōu)選地除去氮化物層194的下部，使得絕緣層192從氮化物層的這一側(cè)198受到阻礙。因此，貯存池196被限定，其體積比不具切除區(qū)域的類似結(jié)構(gòu)大。
圖14所示結(jié)構(gòu)被用于機械握持形成滲透層的材料的接點。這個倒置層俘獲滲透層。該設計能統(tǒng)一為具有任意數(shù)目的倒置層，使得能形成一種排列，例如蜂巢式的漸減的同心圓，或具有不同半徑的同心盤孔。
滲透層(如，圖2中的層14)可由下列物質(zhì)構(gòu)成，但不局限于此碳鏈多聚物，碳硅鏈多聚物，碳磷鏈多聚物，碳氮鏈多聚物，硅鏈多聚物，聚合物合金，層狀多聚物復合物，互穿聚合物材料，陶瓷，控孔玻璃，形成溶膠-凝膠的材料，形成氣凝膠的材料，形成水凝膠的材料，多孔石墨，粘土或沸石。
滲透層將結(jié)合物與電極表面分開。微位點由微平版印刷術(shù)和微機械加工術(shù)產(chǎn)生。對微位點表面和位于微位點上的聚合物層表面進行化學修飾，為表面功能基團產(chǎn)生特定的附著位點。
網(wǎng)眼型滲透層包括隨機排列的多聚物分子，這些多聚物分子形成網(wǎng)眼狀結(jié)構(gòu)，其平均孔徑由交聯(lián)度決定。我們以丙烯酰胺為單體，采用了幾種可聚合制劑，已證明了網(wǎng)眼型滲透層的形成。我們用三甘醇二丙烯酸酯，四甘醇二丙烯酸酯和N，N′-甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑。將分子量為330千道爾頓和25千道爾頓的多聚-1-賴氨酸混入丙烯酰胺/共聚物制劑，由此提供了一個將特異性功能基團連到滲透層表面的方法。將混合物澆到微位點表面。然后由紫外光照射進行光聚合。在有些情況下，需加入AuCl4作為光引發(fā)劑。聚合物制劑由水和非水溶劑，甲醇，四氫呋喃，乙腈，丙酮，及這些試劑的混合物來調(diào)制。
通過連到DNA俘獲探針上的氧化核糖核苷與多聚-1-賴氨酸的伯胺之間發(fā)生的Schiff堿反應，DNA俘獲探針被連到滲透層的表面。這提供了特異性功能基團共價連接到滲透層表面的證據(jù)。
通過電泳將氧化了的DNA俘獲探針帶到表面微位點上。俘獲探針由熒光標記物進行標記。由此證明了通過電泳為微位點編址的能力。
連有熒光標記物的氧化俘獲探針通過電泳被送到滲透層表面的微位點上。用機械手段將滲透層從微位點下移去。沒有觀察到有熒光標記的俘獲探針存在。這證明了滲透層具有保護DNA不與電極表面接觸的能力。
在發(fā)生水解出現(xiàn)氣泡之前，在一個不被滲透層修飾的金微位點上達到的最大直流電流密度為8毫安/cm2。在發(fā)生水解出現(xiàn)氣泡之前，在一個被基于丙烯酰胺的滲透層修飾的金微位點上達到的最大直流電流密度為40毫安/cm2。這證明了滲透層具有在水解發(fā)生出現(xiàn)氣泡前提高最大可及電流密度的能力。
離子交換聚合物三明治滲透層可由一層或幾層聚電解質(zhì)形成。這些聚電解質(zhì)層可以有相同的電荷，不同的電荷，或可以是帶電荷的鑲嵌結(jié)構(gòu)。
一個兩層的離子交換聚合物三明治層由全氟化磺酸聚電解質(zhì)(Nafion)下層和多聚-1-賴氨酸上層構(gòu)成。將Nafion下層澆在微位點上面，讓其干燥。然后將下層暴露到1％(重量百分數(shù))的多聚-1-賴氨酸水溶液中?；谫嚢彼岬年栯x子聚合物緊緊地吸附到陰離子Nafion下層上。多聚-1-賴氨酸層通過Schiff堿反應使得氧化的DNA俘獲探針連到滲透層的表面。Nafion下層為陰離子型的，對于帶負電荷的離子如DNA具有選擇透性。
圖15為圖形用戶接口的實例。窗口200表示顯示器的全貌。識別資料202被提供。有源可編程矩陣系統(tǒng)的各種緩沖器可在一長方形的坐標系中被識別。顯示物204中的每一個顯示出電參數(shù)，例如特定緩沖器上的電流或電壓。方框204A為一個緩沖器(3，4)上的作為時間函數(shù)的電流，其中，電流隨時間而變化，在施加電流的過程中改變方向。方框204B表示一個緩沖器(3，5)，在所示的時間段中無電流施加到其上。方框204C表示加到緩沖器(4，4)上隨時間變化的電流，其中，不考慮與方框204A中報道的緩沖器相關(guān)的時間，電流滯后。方框204D表示一緩沖器(4，5)，沒有作為時間函數(shù)的電流施加上去。方框204E表示一緩沖器(1，1)，其上的電壓具有恒定的負DC值。方框204F表示緩沖器(3，4)上的作為時間函數(shù)的電壓，該電壓具有更大的負DC值。在所有的情況下，方框中虛線表示被編程的電流或電壓，實線表示測定的電流或電壓。
除了上述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案及其替換方案外，另外幾種方案也是可能的。例如，產(chǎn)生離子遷移的電場可被調(diào)節(jié)，使時間與同時施加的直流偏置或電流一樣長。將AC信號加在一直流偏置或電流上可完成三件事1)減少由于非特異性連接的DNA而產(chǎn)生的背景，2)提供一個電子實時控制的方法，其中，控制變量是交流電流或電壓，3)提供空間上的排列DNA分子的方法。
也存在許多其它的熒光檢測雜交DNA的方法。大多數(shù)轉(zhuǎn)換的技術(shù)也包括用能產(chǎn)生可檢測信號的報道基團去修飾俘獲或目的或報道DNA探針。極少數(shù)運用純物理方法進行測定的技術(shù)不需要報道基團。這些可選技術(shù)如下所述(1)線性光學方法，包括熒光、時間調(diào)制熒光、熒光猝滅調(diào)制、極化選擇熒光、吸收、鏡反射、折射率的變化、橢圓光度法、表面等離子共振測定、化學發(fā)光、斑點干涉儀和磁光Kerr效應；(2)非線性光學方法，包括二次諧波的產(chǎn)生，三次諧波產(chǎn)生、參量混合、光學外差檢測、相共振、孤離子減振和光Kerr效應；(3)基于熱效應的方法，包括差示掃描量熱測定法，多頻差示掃描量熱測定法，和差示量熱分析；(4)基于質(zhì)量變化的方法，包括晶體微平衡、懸臂微平衡、表面聲波和表面Love波；(5)電化學方法，包括電流分析法、電量測定法、伏安法、電化學發(fā)光、供體-受體復合物中的電荷轉(zhuǎn)移和表面阻抗光譜學；(6)用標記基團的放射性檢測法。
雖然為了清楚和易于理解，已通過說明和實施例對前述發(fā)明進行了一定程度的詳細闡述，但顯然，本領域普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，在不背離其精神或范圍的前提下，可對其進行某些改動和修飾。
權(quán)利要求
1.一種適用于進行分子生物學過程的電子裝置，其包括具有通常為平面的第一表面的支持物，許多位于支持物第一表面上的可自編址的電極，這些電極具有與支持物第一表面相鄰的接觸部分，和與這些電極相連的分立的電連接裝置。
2.權(quán)利要求1中的電子裝置，其中與電極相連的分立的電連接裝置包括位于支持物第一表面上的導線。
3.權(quán)利要求1中的電子裝置，其中與電極相連的分立的電連接裝置是從電極的接觸部分延伸到支持物的電子通道。
4.權(quán)利要求1中的電子裝置，其中的支持物包括絕緣體。
5.權(quán)利要求4中的電子裝置，其中的絕緣體是氧化物。
6.權(quán)利要求1中的電子裝置，其中的支持物包括半導體材料。
7.權(quán)利要求6中的電子裝置，其中包括了半導體的支持物還包括位于其上的氧化物層。
8.權(quán)利要求6中的電子裝置，其中的控制電子線路包括在半導體材料中，并通過分立的電連接裝置與電極相連。
9.權(quán)利要求1中的電子裝置，其還包括一個與電極相連的光學通路。
10.權(quán)利要求9中的電子裝置，其中的光學通路是通過支持物形成的，使其能接近電極的接觸部分。
11.權(quán)利要求9或10中的電子裝置，其中的光學通路包括光導纖維。
12.權(quán)利要求9或10中的電子裝置，其中的光學通路包括光導管。
13.權(quán)利要求9中的電子裝置，其中的光學通路包括一個開口。
14.權(quán)利要求1中的電子裝置，其還包括位于電極上面的滲透層。
15.權(quán)利要求1中的電子裝置，其還包括位于電極上面的附著層。
16.權(quán)利要求14中的電子裝置，其還包括位于滲透層上面的附著層。
17.權(quán)利要求1中的電子裝置，其還包括位于支持物上的容器。
18.一個與具有眾多電極的有源可編程電子微生物系統(tǒng)共同運作的控制系統(tǒng)，其包括適于接收用戶輸入及提供輸出的控制器，所述輸出包括控制信號，該控制信號可以在電極處產(chǎn)生獨立的電子環(huán)境，與控制器輸入相連的用于接受用戶指令的輸入系統(tǒng)，能在電極周圍提供所需電子環(huán)境的發(fā)生器，該發(fā)生器在控制器輸出的控制下進行操作，和適于將控制系統(tǒng)與有源可編程電子系統(tǒng)相連的接口。
19.權(quán)利要求18中的控制系統(tǒng)，其中的發(fā)生器包括電源。
20.權(quán)利要求19中的控制系統(tǒng)，其中的電源是可調(diào)控的電源。
21.權(quán)利要求18中的控制系統(tǒng)，其中的發(fā)生器包括波形發(fā)生器。
22.權(quán)利要求18中的控制系統(tǒng)，其中的接口包括繼電器系統(tǒng)。
23.權(quán)利要求22中的控制系統(tǒng)，其中的接口包括一些能提供從發(fā)生器到電極的選擇性連接的繼電器。
24.權(quán)利要求22中的控制系統(tǒng)，其中的接口包括適于改變發(fā)生器輸出的極性的繼電器。
25.權(quán)利要求22中的控制系統(tǒng)，其中的接口包括能提供與信號的第一水平或第二水平選擇性連接的繼電器。
26.權(quán)利要求25中的控制系統(tǒng)，其中的信號是預定的電壓水平。
27.權(quán)利要求25中的控制系統(tǒng)，其中的信號包括預定水平的電流。
28.權(quán)利要求18中的控制系統(tǒng)，其中的控制器包括計算機。
29.權(quán)利要求18中的控制系統(tǒng)，其中的控制器是基于微信息處理機的。
30.權(quán)利要求18中的控制系統(tǒng)，其還包括給用戶提供信息的輸出系統(tǒng)。
31.權(quán)利要求30中的控制系統(tǒng)，其中的輸出系統(tǒng)包括顯示器。
32.一種在含有DNA的溶液中降低復雜性的方法，其包括下述步驟將DNA結(jié)合到支持物上，至少使含目的片段的那部分DNA處于未結(jié)合狀態(tài)，從未結(jié)合的DNA切下結(jié)合的DNA，和從剩余的結(jié)合的DNA中移去切下的DNA。
33.權(quán)利要求32中的在含有DNA的溶液中降低復雜性的方法，其中的結(jié)合是通過將DNA與互補DNA雜交來完成的。
34.權(quán)利要求32中的降低復雜性的方法，其中的切割是用限制性酶來完成的。
35.權(quán)利要求32中的在含有DNA的溶液中降低復雜性的方法，其中切下的DNA是通過電泳力移走的。
36.一個能進行分子生物學反應的系統(tǒng)，其包括能接受包含待分析物的樣品的輸入裝置，樣品制備單元，和有源可編程電子裝置，包括眾多的可獨立編址的電極。
37.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其中的有源可編程矩陣包括電極陣列。
38.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其中的有源可編程電極還包括一個位于電極上面的附著層。
39.權(quán)利要求38中的系統(tǒng)，其中的附著層包括俘獲序列。
40.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其還包括被有效定位的檢測器，用于監(jiān)控有源的可編程的裝置。
41.權(quán)利要求40中的系統(tǒng)，其中的檢測器包括成像系統(tǒng)。
42.權(quán)利要求41中的系統(tǒng)，其中的成像系統(tǒng)包括CCD照相機。
43.權(quán)利要求40中的系統(tǒng)，其還包括適于接收檢測系統(tǒng)輸出的分析系統(tǒng)。
44.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其中的樣品制備單元包括細胞分選器。
45.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其中的樣品制備單元包括DNA選擇器。
46.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其中的樣品制備單元包括限制性片段選擇器。
47.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其中的樣品制備單元包括擴增系統(tǒng)。
48.權(quán)利要求47中的系統(tǒng)，其中的擴增單元利用了聚合酶鏈式反應。
49.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其還包括試劑傳送系統(tǒng)。
50.權(quán)利要求49中的系統(tǒng)，其中的試劑傳送系統(tǒng)是電子試劑傳送系統(tǒng)。
51.權(quán)利要求49中的系統(tǒng)，其中的試劑傳送系統(tǒng)是流體試劑傳送系統(tǒng)。
52.權(quán)利要求36中的系統(tǒng)，其還包括廢棄物處理系統(tǒng)。
53.權(quán)利要求52中的系統(tǒng)，其中的廢棄物處理系統(tǒng)是電子廢棄物處理系統(tǒng)。
54.權(quán)利要求52中的系統(tǒng)，其中的廢棄物處理系統(tǒng)是流體廢棄物處理系統(tǒng)。
全文摘要
能在微觀方式上進行分子診斷、分析、多步驟和多重反應的可自編址、自裝配的微電子系統(tǒng)?？芍鲃涌刂频姆磻ê怂犭s交、免疫檢測、臨床診斷和多步驟組合的生物聚合物合成。通過輸入/輸出裝置與用戶相連的控制器接口優(yōu)選地包括一個圖像顯示器。控制器可與電源和接口相連，接口提供到各獨立微位點的選擇性連接，提供極性逆轉(zhuǎn)和提供到各獨立電極的選擇性電壓或電流水平。一個用于進行DNA樣品制備、雜交、檢測和數(shù)據(jù)分析的組合系統(tǒng)將多個步驟整合到一起。帶電物質(zhì)優(yōu)選地通過自由電場電泳進行轉(zhuǎn)運。DNA復雜性降低優(yōu)選地通過將DNA結(jié)合到支持物上，由諸如限制性酶等切下未結(jié)合部分，再轉(zhuǎn)移切下的片段來完成。有源可編程矩陣裝置包括方形矩陣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有扇狀分布的電連接和可選的在特異性微位點下的電連接，由此產(chǎn)生了高度自動化的DNA診斷系統(tǒng)。
文檔編號B01L3/00GK1164894SQ95196089
公開日1997年11月12日 申請日期1995年9月6日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月9日
發(fā)明者M·J·赫徹, E·圖, D·D·蒙哥馬利, W·F·巴特勒 申請人:內(nèi)諾金公司