專利名稱：可自我尋址自我組裝的用于分子生物學(xué)分析和診斷的微電子系統(tǒng)及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明有關(guān)一種能有效地進(jìn)行和控制顯微形式的多步和多路反應(yīng)的可自我尋址，自我組裝微電子系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、制造和使用。特別地，這些反應(yīng)包括分子生物學(xué)反應(yīng)，例如核酸雜交、抗體/抗原反應(yīng)、臨床診斷，和生物高分子合成。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)包括核酸和蛋白質(zhì)分析的各種各樣技術(shù)，這些大部分技術(shù)形成了臨床診斷分析的基礎(chǔ)。這些技術(shù)包括核酸雜交分析，限制性酶分析，基因序列分析，以及核酸和蛋白質(zhì)的分離和純化(參見，如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室印刷，冷泉港，紐約Molecular CloningA Laboratory Manual 2Ed.，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cold Spring Harbor New York，1989)。
大多數(shù)分子生物學(xué)技術(shù)牽連到對(duì)大量樣品進(jìn)行無數(shù)的操作(例如，移液)。這些通常是復(fù)雜而耗時(shí)的，常需要高度的精確性。許多種技術(shù)因缺少靈敏度，特異性或重復(fù)性而限制其的應(yīng)用。例如，因靈敏度和特異性的問題已極大地限制了核酸雜交的應(yīng)用。
核酸雜交分析通常包括在大量非-目標(biāo)核酸分子中用探針識(shí)別極微量的特異性目標(biāo)核酸(DNA或RNA)。為了保證高特異性，雜交常在由溫度、鹽、洗滌劑、溶劑、離液劑和變性劑組合而獲得的嚴(yán)格條件下進(jìn)行。
復(fù)合的樣品核酸雜交分析已在各種濾膜和固體支持物上進(jìn)行(參見G.A.Beltz et al，酶學(xué)方法，Vol 100，Part B，R.Wu，L.Grossman，K.Moldave，Eds.，Academic Press，New York，19章，pp.266-308，1985)。一種形式，即所謂“斑點(diǎn)”雜交，包括非-共價(jià)連接目標(biāo)DNA到一濾膜上，隨后濾膜與放射性同位素標(biāo)記的探針雜交。“斑點(diǎn)”雜交獲得了廣泛的使用，并發(fā)展了多個(gè)改進(jìn)形式(參見M.L.M.Anderson和B.D.Young，核酸雜交-實(shí)用方法，B.D.Hames和S.J.Higgins，Eds.，IRL Press，WashingtonDC，第4章，pp.73-111，1985)。這種技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成能進(jìn)行基因組突變的復(fù)合分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，在EPA 0228075，July 8，1987)和檢測(cè)重疊克隆以及構(gòu)建基因組圖譜(G.A.Evans，在USP # 5.219.726.June 15，1993)。
另一種形式，即所謂“夾心”雜交，包括共價(jià)連接寡聚核苷酸探針到一固體支持物上并用它們捕獲和識(shí)別多核酸目標(biāo)(M.Ranki etal.，Gene，21，pp.77-85，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund，在UKP Application GB 2156074A，Oct.2，1985，T.M.Ranki和H.E.Soderlund在USP # 4,563,419，January 7，1986；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale，in PCTWO 86/03782，July 3，1986；Y.Stabinsky，in USP # 4,751,177，January 14，1988；T.H.Adams et al.，in PCT WO 90/01564，F(xiàn)eb.22，1990 R.B.Wallace et al.，6 NucleicAcid Res 11，p.3543，1979；和B.J.Connor et al.，80Proc Natl Acad Sci USA pp.278-282，1983)。
應(yīng)用通用的核酸雜交形式和嚴(yán)格性控制方法，對(duì)檢測(cè)低拷貝數(shù)(例如1-100,000)核酸目標(biāo)仍是困難的即使使用最靈敏的報(bào)告基團(tuán)(酶，熒光團(tuán)，放射性同位素)等和與其配套的檢測(cè)系統(tǒng)(熒光計(jì)，發(fā)光計(jì)，光子計(jì)數(shù)器，閃爍計(jì)數(shù)器，等等)。
這個(gè)困難是由各種與直接探針雜交相關(guān)聯(lián)的本身問題引起的。首先和最嚴(yán)重的困難涉及雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性控制。雜交反應(yīng)通常在最嚴(yán)格的條件下進(jìn)行以便獲得最高程度的特異性。嚴(yán)格性控制的方法包括初始的在雜交過程以及隨后的漂洗過程中應(yīng)用最適溫度、離子強(qiáng)度和變性劑。不幸的是應(yīng)用這些嚴(yán)格性條件引起用于檢測(cè)的雜交了的探針/目標(biāo)復(fù)合物的數(shù)量顯著下降。
第二種困難涉及在大多數(shù)樣品中DNA的高度復(fù)雜性，特別在人類基因組DNA樣品中。當(dāng)一個(gè)樣品由大量與特異目標(biāo)序列非常相似的序列所組成時(shí)，既使最特異性的探針序列與非-目標(biāo)序列也會(huì)有大量部分雜交。
第三種困難涉及在探針和它的特異目標(biāo)間的不適合的雜交動(dòng)力學(xué)因素。既使在最佳條件下，大部分雜交反應(yīng)是在相當(dāng)?shù)蜐舛鹊奶结樅湍繕?biāo)分子間進(jìn)行的。此外，探針常不得不與互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)目標(biāo)核酸。
對(duì)于大部分現(xiàn)今的雜交形式的第四種困難是高水平的非-特異性背景信號(hào)。這是由DNA探針與幾乎任何材料的親和性引起的。
這些問題，或單個(gè)或幾個(gè)組合，在上述雜交形式中導(dǎo)致喪失核酸雜交的靈敏度和/或特異性。這是不幸的因?yàn)閷?duì)大多數(shù)基于核酸的臨床診斷分析而言檢測(cè)低拷貝數(shù)核酸目標(biāo)是必須的。
由于識(shí)別低拷貝數(shù)核酸目標(biāo)的困難，研究者們極大地依賴于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列(參見M.A.Innis et al.，PCR程序方法和應(yīng)用的導(dǎo)論，Academic Press，1990)，由PCR反應(yīng)產(chǎn)生的大量目標(biāo)核酸序列改進(jìn)了隨后的直接核酸探針技術(shù)，雖然其代價(jià)是加長(zhǎng)了步驟和增加了繁瑣性。
在用直接探針識(shí)別低拷貝數(shù)目標(biāo)核酸方面與通常出現(xiàn)的困難相反的一個(gè)明顯例外是原位雜交技術(shù)。這個(gè)技術(shù)使得低拷貝數(shù)的獨(dú)特核酸序列在單個(gè)細(xì)胞中被識(shí)別。在原位雜交形式中，目標(biāo)核酸被自然地限制在一個(gè)細(xì)胞(～20-50μm2)或一個(gè)細(xì)胞核(～10μm2)區(qū)域內(nèi)具有相對(duì)高的局部濃度。而且，探針/目標(biāo)雜交信號(hào)被限制在形態(tài)上可區(qū)分的區(qū)域；這使得該形式雜交比在一個(gè)固體支持物上雜交更易區(qū)別陽性信號(hào)與虛假的或非-特異性的信號(hào)。
模仿原位雜交，為在顯微-形式的多路或矩陣裝置(如，DNA芯片)上進(jìn)行復(fù)合樣品核酸雜交分析一些新技術(shù)發(fā)展了起來(參見M.Barinage，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp，757-758，1992)。這些方法通常結(jié)合特異的DNA序列到固體支持物非常小的特殊區(qū)域上，例如DNA芯片的微井。這些雜交形式是傳統(tǒng)的“斑點(diǎn)”和“夾心”雜交體系在顯微范圍內(nèi)的改進(jìn)。
顯微-形式的雜交能用于進(jìn)行“雜交測(cè)序”(SBH)(參見M.Barinaga，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp，757-758，1992)。 SBH應(yīng)用所有可能的n-核苷酸寡聚體(n-mers)來鑒別在一未知DNA樣品中的n-mers，隨后通過規(guī)則系統(tǒng)分析線性排列產(chǎn)生DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，Yugoslav Patent Kpplication # 570/87，1987R.Drmanac et al.，4 Genomics，114，1989Strezoska etal.，88 Proc.Natl.Acad.Sci，UAS 10089 1991；和R.DrmanacR.B.Crkvenjakov，USP # 5，202，231，April 13，1993)。
有兩種形式可進(jìn)行SBH。第一種形式包括在一個(gè)支持物上形成一個(gè)所有可能n-mers的列陣，然后用其與目標(biāo)序列雜交。第二種形式包括結(jié)合目標(biāo)序列到一個(gè)支持物上，隨后用所有可能的n-mers來標(biāo)記。兩種形式都具有直接探針雜交的基本困難和涉及多路雜交的額外困難。
在UKP Application GB 8810400，1988；和B.Genomics1008，1992年中，Southern提出應(yīng)用第一種形式來分析或測(cè)定DNA序列。Southern應(yīng)用PCR擴(kuò)增的基因組DNA鑒定了一個(gè)已知單點(diǎn)突變。Southern也描述了一種為進(jìn)行SBH而在一個(gè)固體支持物上合成寡聚核苷酸列陣的方法。然而，Southern沒有講述如何獲得列陣中每一個(gè)寡聚核苷酸的最適的嚴(yán)格性條件。
在364 Nature，pp.555-556，1993中，F(xiàn)odor等人應(yīng)用1,0248-mer的寡聚核苷酸列陣在一個(gè)固體支持物上測(cè)定了DNA序列。在這例中，目標(biāo)DNA是僅含有核苷酸A和C并熒光標(biāo)記的單鏈12-mer寡聚核苷酸。1pmol(～6×1011分子)的12-mer目標(biāo)序列對(duì)與列陣上8-mer寡聚體雜交是必須的。該結(jié)果顯示了多個(gè)錯(cuò)配合。象Southern一樣，F(xiàn)odor et al.，沒有講述直接探針雜交的基本困難，例如多路雜交的嚴(yán)格性控制。這些困難，與需要大量簡(jiǎn)單12-mer目標(biāo)一起，表明這一SBH形式的嚴(yán)重局限性。
同時(shí)，在260 Science 1649-1652，1993中，Drmanac等人應(yīng)用第二種形式為數(shù)種短(116bp)的DNA序列測(cè)序。目標(biāo)DNA被結(jié)合到膜支持物上(“斑點(diǎn)”形式)。每一個(gè)濾膜順序地與272個(gè)標(biāo)記過的10-mer和11-mer寡聚核苷酸雜交。大范圍的嚴(yán)格性條件被用來獲得每一個(gè)n-mer探針的特異性雜交；漂洗時(shí)間從5分鐘到過夜不等，溫度從0℃到16℃不等。大多數(shù)探針需要在16℃漂洗3小時(shí)。濾膜必須曝光2到18小時(shí)以便識(shí)別雜交信號(hào)。盡管是簡(jiǎn)單目標(biāo)序列，降低了寡聚體探針量，和使用現(xiàn)有的最嚴(yán)格條件，總的假陽性雜交率是5％。
在251 Science 767-773，1991中，F(xiàn)odor等人應(yīng)用照相平版印刷技術(shù)在一個(gè)基質(zhì)上合成寡聚核苷酸。在USP # 5,143,854 Sept.1，1992中，Pirrung等人講述了在硅基質(zhì)上以列陣方式大范圍照相平版印刷固相合成多肽。
另一種矩陣雜交方法，Beattie et al.，在1992年圣地亞哥會(huì)議基因識(shí)別Nov.1992中，應(yīng)用一種微機(jī)器人體系在一種玻璃基質(zhì)上存放含有特異性DNA序列的微滴于單個(gè)微加工的樣品并中。每個(gè)樣品中雜交反應(yīng)是由詢問微型電極測(cè)定固定裝置來識(shí)別，而該固定裝置排在每個(gè)微井四周并帶有交流(AC)電場(chǎng)。
不管那種形式，現(xiàn)今顯微范圍DNA雜交和SBH方法都沒能克服與直接探針雜交反應(yīng)聯(lián)系著的本身物理困難。它們需要非常高水平的相對(duì)短的單鏈目標(biāo)序列或PCR擴(kuò)增的DNA，并產(chǎn)生高水平的虛假陽性雜交信號(hào)，既使是在最嚴(yán)格條件下。在應(yīng)用短寡聚核苷酸序列的多路形式例子中，不可能用任何傳統(tǒng)的方法獲得對(duì)于每個(gè)序列最適的嚴(yán)格條件，因?yàn)橛糜谶@些形式的列陣或裝置不能在單個(gè)場(chǎng)所相對(duì)于另一場(chǎng)所改變或調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度，或變性劑。因此，一個(gè)共同的嚴(yán)格條件必須用于所有裝置上的序列。這導(dǎo)致了大量非-特異性和部分雜交并嚴(yán)重地限制了該裝置的應(yīng)用。這一困難隨著列陣中不同序列數(shù)目的增多和序列長(zhǎng)度的下降而更加復(fù)雜。這對(duì)于SBH是特別的困難，它需要大量短寡聚核苷酸探針。
不同大小，電荷或構(gòu)象的核酸常規(guī)是通過電泳技術(shù)分離，電泳技術(shù)能通過電場(chǎng)中它們的不同遷移率來區(qū)別雜交核酸。脈沖場(chǎng)電泳使用在介質(zhì)(如，凝膠)四周安排復(fù)合電極來分離那些由傳統(tǒng)凝膠電泳系統(tǒng)不能解決的非常大的DNA片段(參見R.Anand和E.M.Southern核酸凝膠電泳-實(shí)用方法2nd.D.Rickwood和B.D.Hames Eds.IRL Press，New York，pp.101-122，1990)。
在USP # 4,908,112，March 13，1990中，Pace講述了使用微加工技術(shù)制造硅基質(zhì)上的毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)。復(fù)合電極被用于該系統(tǒng)中用來在裝置中移動(dòng)分子通過分離介質(zhì)。
在USP 5,126,022 June 30，1992中，Soane和Soane講述了大量電極能被用來控制混合物中帶電分子通過細(xì)管中凝膠分離介質(zhì)的線性移動(dòng)。電極必須被安裝在細(xì)管中以便控制分子在分離介質(zhì)中的移動(dòng)和定位。
在26 IEEE在工業(yè)應(yīng)用中的反作用6，pp，1165-1172，1990中，Washizu，M.和Kurosawa O.，應(yīng)用高頻交流(AC)電場(chǎng)來使DNA分子定向在微加工電極間產(chǎn)生的電場(chǎng)線上，然而，使用直流(DC)電場(chǎng)限制了他們的工作。在靜電雜志25卷109-123頁，1990中，Washizu描述了應(yīng)用介電電泳來操作細(xì)胞和生物分子。細(xì)胞能融合以及生物分子能沿著由微電極結(jié)構(gòu)聞AC電壓產(chǎn)生的電場(chǎng)線定向。然而，介電電泳過程需要非常高頻(1MHz)AC電壓和一種低電導(dǎo)率介質(zhì)。雖然這些技術(shù)能沿著AC電場(chǎng)線使不同大小的DNA分子定向，但它們不能區(qū)別相同大小的雜交復(fù)合物。
從上述討論中已很明顯，花費(fèi)了極大的努力來提供有效的技術(shù)以實(shí)施多步，多路分子生物學(xué)反應(yīng)。然而，正如上述的種種原因，這些技術(shù)已被證明是欠缺的。盡管對(duì)有效技術(shù)有長(zhǎng)期熟知的需求，但滿意的方案還沒有被提出來。
本發(fā)明的摘要本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)、制造，和使用一種可自我尋址自我組裝的微電子系統(tǒng)和裝置，它能有效地進(jìn)行顯微形式的被控制的多步和多路反應(yīng)。這些反應(yīng)包括，但不局限于，大多數(shù)分子生物學(xué)過程，例如核酸雜交，抗體/抗原反應(yīng)，和有關(guān)的臨床診斷學(xué)。此外，權(quán)利要求的裝置能進(jìn)行多步組合的生物高分子合成，包括，但不局限于，在特定微場(chǎng)所合成不同的寡聚核苷酸或多肽。
權(quán)利要求的裝置是應(yīng)用微平版印刷和微機(jī)械技術(shù)制造的。裝置在其表面具有一個(gè)可尋址的微場(chǎng)所的矩陣；每單個(gè)微場(chǎng)所能夠電子地控制和引導(dǎo)特異性結(jié)合實(shí)體(例如，核酸，抗體)的轉(zhuǎn)移和結(jié)合于其自身。所有微場(chǎng)所能被它們特異的結(jié)合實(shí)體尋址。應(yīng)用這一裝置，在最小外界干預(yù)下這系統(tǒng)能被自我組裝。
這裝置能控制和有效地進(jìn)行各種測(cè)定和反應(yīng)。分析物或反應(yīng)物通過自由場(chǎng)電泳被轉(zhuǎn)移到任何特定的微場(chǎng)所上，在這兒分析物或反應(yīng)物有效地濃縮并在所說的微場(chǎng)所與特異的結(jié)合實(shí)體反應(yīng)。檢測(cè)特異分析物或反應(yīng)物的靈敏度因濃縮效應(yīng)而提高了。任何未結(jié)合的分析物或反應(yīng)物能通過反向微場(chǎng)所的極性而被移走。這樣，裝置也提高了測(cè)定和反應(yīng)的特異性。
裝置為特定微場(chǎng)所上的雜交反應(yīng)提供獨(dú)立的嚴(yán)格性控制。這樣矩陣上所有的微場(chǎng)所在同一時(shí)間里能有不同的嚴(yán)格性條件，允許復(fù)合雜交在最適條件下進(jìn)行。
通過使用輔助的光學(xué)(熒光或紫外分光光度計(jì))成像識(shí)別系統(tǒng)或集成的傳感元件，裝置也促進(jìn)在每個(gè)微場(chǎng)所上檢測(cè)雜交復(fù)合物。
此外，裝置積極的特性允許復(fù)雜的多步反應(yīng)在最少外部物理操作下進(jìn)行。如需要的話，被特異結(jié)合實(shí)體尋址的主裝置能被電子地復(fù)制或拷貝成另一個(gè)基礎(chǔ)裝置。
這樣，權(quán)利要求的裝置能用完全的和精確的電子控制，最好使用微處理機(jī)，進(jìn)行多步和多路反應(yīng)。多步和多路反應(yīng)的速率，特異性和靈敏度在權(quán)利要求的裝置的特定微場(chǎng)所上極大地提高。
本發(fā)明克服了在本說明書背景中描述的多樣品雜交的列陣和裝置具有的限制性。以前的方法和裝置相對(duì)于實(shí)際的雜交過程功能上是被動(dòng)的。雖然復(fù)雜的照相平版印刷技術(shù)被用于制造列陣，或微電子傳感元件被組裝進(jìn)用于檢測(cè)，但以前的裝置不控制或影響實(shí)際雜交過程。它們不被設(shè)計(jì)成能主動(dòng)地克服任何與雜交反應(yīng)聯(lián)系著的固有物理困難。
本發(fā)明可應(yīng)用符合于本發(fā)明目標(biāo)的任何大小或形狀的微場(chǎng)所。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，亞-毫米級(jí)的微場(chǎng)所被選用。
“特異的結(jié)合實(shí)體”一詞通常表示一種能通過共價(jià)鍵或非-共價(jià)鍵與其它分子特異性親和結(jié)合的生物或合成的分子。優(yōu)選地，一種特異結(jié)合實(shí)體含有(或自然地或通過化學(xué)修飾)一種功能的化學(xué)基團(tuán)(伯胺、巰基、醛基，等等)，一種共同序列(核酸)，一種抗原表位(抗體)，半抗原或一種配體，這些成份允許結(jié)合實(shí)體共價(jià)反應(yīng)或非-共價(jià)結(jié)合到微場(chǎng)所表面的共同功能基團(tuán)上。特異結(jié)合實(shí)體包括，但不局限于脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，合成的寡聚核苷酸、抗體、蛋白質(zhì)、肽、凝集素、修飾的多糖，合成的復(fù)合大分子，具功能的納米結(jié)構(gòu)，合成高分子，修飾/封閉的核苷酸/核苷，修飾/封閉的氨基酸、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、配體、螯合物和半抗原。
“嚴(yán)格性控制”一詞表示區(qū)別特異和非-特異結(jié)合相互作用的能力。
因此，首先，本發(fā)明特征地描述一種帶有可電子地自我尋址微場(chǎng)所列陣的裝置。每個(gè)微場(chǎng)所包含由基質(zhì)支撐著的基礎(chǔ)直流(DC)微電極。每個(gè)微場(chǎng)所表面有一種用于小的相反離子自由經(jīng)過的滲透層，和一種用于共價(jià)結(jié)合特異結(jié)合實(shí)體的粘附層。
“列陣”或“矩陣”是表示裝置上場(chǎng)所的一種排列。場(chǎng)所能排列成二維列陣、三維列陣、或其它矩陣形式。場(chǎng)所的數(shù)量可從幾個(gè)到至少數(shù)十萬個(gè)。
在第二方面，本發(fā)明特征地描述一種用于轉(zhuǎn)移結(jié)合實(shí)體到裝置的任何微場(chǎng)所上的方法。當(dāng)被活化時(shí)，一個(gè)微場(chǎng)所能影響任何帶電具功能的特異結(jié)合實(shí)體自由場(chǎng)電泳轉(zhuǎn)移直接到它本身上。一旦結(jié)合到特定微場(chǎng)所上，這具功能的特異結(jié)合實(shí)體立即變成共價(jià)地結(jié)合到那個(gè)特定微場(chǎng)所表面的粘附層上。其它微場(chǎng)所能通過保持它們?cè)谂c帶電分子相反電勢(shì)上而同時(shí)被保護(hù)。這一過程能迅速地重復(fù)直至所有微場(chǎng)所被它們特異結(jié)合實(shí)體尋址。
“帶電具功能的特異結(jié)合實(shí)體”一詞表示一種被化學(xué)地活化(即，能夠共價(jià)地結(jié)合到場(chǎng)所上)和帶有一個(gè)凈電荷(或正電或負(fù)電)的特異結(jié)合實(shí)體。
在第三方面，本發(fā)明特征地描述一種在裝置的任何特定微場(chǎng)所上濃縮和反應(yīng)分析物或反應(yīng)物的方法。在特異結(jié)合實(shí)體結(jié)合到粘附層以后，每個(gè)微場(chǎng)所的基礎(chǔ)微電極繼續(xù)以直流(DC)方式起作用。這種獨(dú)特的特性允許那些自由存在溶液中的相對(duì)稀的帶電分析物或反應(yīng)分子以連續(xù)的或平行的方式在任何保持與分析或反應(yīng)分子相反電荷的特定微場(chǎng)所上被快速地轉(zhuǎn)移、濃縮、和反應(yīng)。特定的微場(chǎng)所能被保護(hù)或掩蓋起來，通過保持它們?cè)谂c分析或反應(yīng)分子相同電荷情況下。這種在選擇的微場(chǎng)所上濃縮稀的分析或反應(yīng)分子的能力在這些微場(chǎng)所上極大地加速反應(yīng)速率。
當(dāng)所需的反應(yīng)完成后，微電極的電勢(shì)能被反轉(zhuǎn)以便從這些微場(chǎng)所上移去非-特異性分析物或未反應(yīng)的分子。
特異的分析物或反應(yīng)產(chǎn)物可以從任何微場(chǎng)所上釋放出并轉(zhuǎn)移到其它場(chǎng)所上進(jìn)一步分析或貯存在其它可尋址的場(chǎng)所上；或從本系統(tǒng)中完全移走。
在這特異微場(chǎng)所上分析物隨后的分析也通過這種從這些場(chǎng)所上排斥非-特異性實(shí)體的能力極大地被改進(jìn)。
在第四方面，本發(fā)明特征地描述了一種增進(jìn)核酸雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性控制的方法，包括下列步驟—在進(jìn)行雜交的特定微場(chǎng)所上快速地濃縮稀的目標(biāo)DNA和/或探針DNA序列；—從已發(fā)生雜交的特定微場(chǎng)所上快速地移走非-特異地結(jié)合的目標(biāo)DNA序列；—從已發(fā)生雜交的特定微場(chǎng)所上快速地移走競(jìng)爭(zhēng)的互補(bǔ)目標(biāo)DNA序列；—提高電勢(shì)以便移走部分雜交的DNA序列(多于一個(gè)堿基錯(cuò)配)；—調(diào)節(jié)電勢(shì)以便增進(jìn)單個(gè)錯(cuò)配雜交的分辨能力(例如，識(shí)別點(diǎn)突變)；—應(yīng)用獨(dú)立的電勢(shì)控制到在同一批溶液中發(fā)生的單個(gè)雜交反應(yīng)上；和—使用電勢(shì)控制以便增進(jìn)未-擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列雜交到捕獲寡聚核苷酸探針的列陣上。
在第五方面，本發(fā)明特征地描述一種在微場(chǎng)所上合成生物高分子的方法。
在第六方面，本發(fā)明特征地描述一種復(fù)制主裝置的方法。
在第七方面，本發(fā)明特征地描述數(shù)種方法用于應(yīng)用自我尋址的帶配套的光學(xué)，光電子或電子檢測(cè)系統(tǒng)的微電子學(xué)裝置或自我尋址的帶一體化的光學(xué)、光電子或電子檢測(cè)系統(tǒng)的微電子學(xué)裝置檢測(cè)和分析已在已尋址的微場(chǎng)所上發(fā)生的反應(yīng)。
圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是應(yīng)用微平版印刷技術(shù)制造的三個(gè)可自我尋址的微場(chǎng)所的橫截面。
圖2是一個(gè)微平版印刷地制造的微場(chǎng)所的橫截面。
圖3是一個(gè)可自我尋址的64微場(chǎng)所芯片的圖解代表，該芯片是實(shí)際被制造，由寡聚核苷酸尋址的，和經(jīng)測(cè)試的。
圖4表明特定結(jié)合化學(xué)過程，該過程允許快速共價(jià)結(jié)合特異性寡聚核苷酸到一個(gè)微場(chǎng)所的粘附表層。
圖5是一幅微機(jī)械加工的96微場(chǎng)所裝置的放大圖解圖。
圖6是微機(jī)械加工的裝置的橫截面。
圖7是表明裝置用來在特定微場(chǎng)所電子地濃縮分析物或反應(yīng)分子的原理。
圖8表明用三個(gè)特異寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體(SSO-A，SSO-B，和SSO-C)來自我引導(dǎo)組裝一個(gè)裝置。
圖9表明一種用在含有特異DNA捕獲序列微場(chǎng)所上濃縮的樣品/目標(biāo)DNA進(jìn)行的電子控制的雜交過程。
圖10表明一種電子引導(dǎo)的系列雜交過程。
圖11表明為確定單點(diǎn)突變的電子嚴(yán)格性控制(ESC)的雜交過程。
圖12表明一種不使用標(biāo)記的DNA探針而檢測(cè)雜交的DNA的方案，即，電子控制的染料識(shí)別過程。
圖13表明一種電子控制復(fù)制裝置的方案。
圖14表明一種電子引導(dǎo)組合性合成寡聚核苷酸的方案。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的裝置和有關(guān)的方法允許一些重要的分子生物學(xué)和診斷反應(yīng)能在完全電子控制下進(jìn)行。本發(fā)明的基本思想是一種帶有特殊設(shè)計(jì)的可尋址的微場(chǎng)所的微電子裝置。每個(gè)微場(chǎng)所具有能共價(jià)結(jié)合特異結(jié)合實(shí)體的衍生表面層(即，粘附層)，一種滲透層，和一種基礎(chǔ)的直流(DC)微電極。在基本的微電子結(jié)構(gòu)初期制造后，裝置能夠自我引導(dǎo)用特異結(jié)合實(shí)體來尋址每個(gè)特定的微場(chǎng)所。自我尋址的裝置隨后能在它的任何微場(chǎng)所上主動(dòng)地進(jìn)行多步，組合的和多路反應(yīng)。裝置能夠電子地引導(dǎo)和控制快速移動(dòng)和濃縮分析物和反應(yīng)物到或離開任何它的微場(chǎng)所。裝置電子地控制各種反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面的能力提供了多個(gè)新的和重要的優(yōu)越性和改進(jìn)。
本發(fā)明的思想和實(shí)施方案分三部分描述。第一部分，“基本裝置的設(shè)計(jì)和制造”描述基本基礎(chǔ)的微電子學(xué)裝置的設(shè)計(jì)和應(yīng)用微平版印刷和微加工技術(shù)制造該裝置。第二部分，“該裝置自我引導(dǎo)的尋址”描述裝置的自我尋址和自我裝配，特別是快速轉(zhuǎn)移和結(jié)合特異結(jié)合實(shí)體到每個(gè)微場(chǎng)所上。第三部分“裝置的應(yīng)用”描述裝置如何提供各種多步，組合的，和多路反應(yīng)的電子控制。這部分也描述裝置的各種使用和應(yīng)用。
(1)基本裝置的設(shè)計(jì)和制造為了使裝置能進(jìn)行多步和多路反應(yīng)，它的主要電子元件在水溶液中必須能保持活性操作狀態(tài)。為滿足這一需求，每個(gè)微場(chǎng)所必須具有一個(gè)基礎(chǔ)的功能DC方式微電極。其它為設(shè)計(jì)和制造裝置的考慮包括，但不局限于，材料的相容性，特異結(jié)合實(shí)體的特性和隨后反應(yīng)物和分析物的特性，和微場(chǎng)所的數(shù)置。
“一種功能的D C方式微電極”是表示一種微電極偏壓或是正電或是負(fù)電，并以直流電方式(或是連續(xù)的或是脈沖的)運(yùn)行。它能影響或引起帶電的特異結(jié)合實(shí)體反應(yīng)物或分析物自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)到或離開裝置上任何場(chǎng)所，或在樣品溶液中。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，分子的自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)不取決于由絕緣材料為界或限制的所產(chǎn)生的電場(chǎng)。
一個(gè)裝置可被設(shè)計(jì)成僅含有二個(gè)可尋址微場(chǎng)所或含有數(shù)十萬個(gè)微場(chǎng)所。一般來說，一種帶有大量微場(chǎng)所的復(fù)雜裝置是應(yīng)用微平版印刷技術(shù)制造的。制造是在硅或其它合適基質(zhì)材料例如玻璃、二氧化硅、塑料或陶瓷材料上進(jìn)行的。這些微電子“芯片”的設(shè)計(jì)能被認(rèn)為是大范圍列陣或多路分析裝置。一種帶有少量微場(chǎng)所的裝置能應(yīng)用微加工技術(shù)而制造。
可尋址微場(chǎng)所可為任何形狀，優(yōu)選地園形、方形、或長(zhǎng)方形。一個(gè)可尋址微場(chǎng)所的大小可為任何大小，優(yōu)選地從亞-微米(～0.5μm)到幾厘米(cm)的范圍，5μm到100μm是使用微平版印刷技術(shù)制造的裝置的最優(yōu)選的大小范圍，而100μm到5毫米是使用微加工技術(shù)制造的裝置最優(yōu)選的大小范圍。制造小于微平版印刷方法分辨力的微場(chǎng)所將需要諸如電子束平版印刷、離子束平版印刷，或分子束外延技術(shù)。顯微場(chǎng)所是分析和診斷類型應(yīng)用所必須的，同時(shí)，較大的可尋址場(chǎng)所(例如，大于2mm)是制備范圍生物高分子合成所必須的。
在通過使用微平版印刷和/或微加工技術(shù)微場(chǎng)所制造后，化學(xué)技術(shù)被用來構(gòu)建特殊的粘附和滲透層，它們能允許在微場(chǎng)所下面的DC方式微電極(1)影響或引起特異(帶電)的結(jié)合實(shí)體從任何場(chǎng)所的自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)；(2)濃縮和共價(jià)結(jié)合特異結(jié)合實(shí)體到特定的微場(chǎng)所的經(jīng)特別修飾過的表面上；和(3)在結(jié)合特異結(jié)合實(shí)體以后繼續(xù)以DC方式主動(dòng)地發(fā)揮功能以便其它反應(yīng)物和分析物能被轉(zhuǎn)移到或離開微場(chǎng)所。
設(shè)計(jì)參數(shù)(微平版印刷)圖1表明使用微平版印刷技術(shù)制造的一種自我尋址的微場(chǎng)所的基本設(shè)計(jì)。三個(gè)微場(chǎng)所(10)(ML-1，ML-2，ML-3)在沉積在絕緣層/基礎(chǔ)材料的金屬位點(diǎn)形成(12)的表層上。該金屬位點(diǎn)(12)作為基礎(chǔ)微電極結(jié)構(gòu)(10)。一種絕緣材料把金屬位點(diǎn)(12)之間相互隔離開。絕緣材料包括，但不局限于，二氧化硅、玻璃、防染劑、橡膠、塑料、或陶瓷材料。
圖2表明形成在微平版印刷制造的金屬位點(diǎn)(12)之上一個(gè)獨(dú)立的微場(chǎng)所(10)的基本特征。該可尋址的微場(chǎng)所是在金屬位點(diǎn)(12)之上形成，并包含一個(gè)氧化層(20)，一個(gè)滲透層(22)，一個(gè)粘附層(24)，和一個(gè)結(jié)合實(shí)體層(26)。金屬氧化層提供共價(jià)結(jié)合滲透層的基礎(chǔ)。滲透層提供了位于金屬表面和粘附/結(jié)合實(shí)體層之間的空間并允許溶劑分子，小相反離子，和氣體自由地進(jìn)入或離開金屬表面。微平版印刷技術(shù)制造的裝置滲透層的厚度可從大約1納米(nm)到10微米(μm)范圍，從2nm到1μm是最優(yōu)選的。粘附層提供了共價(jià)結(jié)合結(jié)合實(shí)體的基礎(chǔ)。微平版印刷技術(shù)制造的裝置粘附層的厚度能從0.5nm到1μm的范圍，1nm到200nm是最優(yōu)選的。在一些情況下，滲透層和粘附層能從相同材料形成。特異結(jié)合實(shí)體共價(jià)結(jié)合到粘附層上，形成特異結(jié)合實(shí)體層。特異結(jié)合實(shí)體層通常是單層的特異結(jié)合分子。然而，在一些情況下結(jié)合實(shí)體層能有幾層或甚至多層結(jié)合分子。
滲透和粘附層的一定設(shè)計(jì)和功能方面是通過特異結(jié)合實(shí)體分子的物理(例如，大小和形狀)和化學(xué)特性支配的，它們也在一定程度上被隨后轉(zhuǎn)移和結(jié)合到微場(chǎng)所上的反應(yīng)和分析分子的物理和化學(xué)特性所支配。例如，寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體能被結(jié)合到一種類型的微場(chǎng)所表面上而不引起DC方式功能的喪失，即，基礎(chǔ)的微電極仍能引起其它分析分子的快速自由場(chǎng)電泳式轉(zhuǎn)移到或離開寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體結(jié)合著的表面。然而，如果大球形蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)體(如，抗體)結(jié)合到相同類型的表面，它們可有效地絕緣這表面而引起DC方式功能的降低或完全喪失。粘附層合適的修飾將不得不進(jìn)行以便或降低大結(jié)合實(shí)體(例如，大球形蛋白)的數(shù)目或在表面結(jié)合實(shí)體間提供空間。
微場(chǎng)所聞空間的決定是由制造的難易，微場(chǎng)所聞檢測(cè)分辨力的要求，和裝置上需要的微場(chǎng)所數(shù)量。然而，微場(chǎng)所聞特點(diǎn)空間，或微場(chǎng)所的特別安排或地形對(duì)于裝置的功能不是必須的，其中微場(chǎng)所(即，基礎(chǔ)微電極)的任何組合能在裝置所有區(qū)域內(nèi)操作。這既不必包裝裝置也不必用絕緣邊界限制微場(chǎng)所。這是因?yàn)閺?fù)雜的電場(chǎng)形式或絕緣邊界對(duì)在任何電極間的空間或介質(zhì)內(nèi)選擇地移動(dòng)、分離、停留或定向特異的分子是不需要的。裝置通過結(jié)合特異結(jié)合分子和隨后的分析物和反應(yīng)物到可尋址微場(chǎng)所的表面來完成這些。自由場(chǎng)電泳式推進(jìn)力提供了在裝置上任何和所有場(chǎng)所聞快速和直接轉(zhuǎn)移任何帶電分子。
隨著微場(chǎng)所的數(shù)目增加超過數(shù)百，微場(chǎng)所間的基礎(chǔ)電路的復(fù)雜性增加了。在這種情況下微場(chǎng)所的分組形式不得不改變并有比例地增加空間距離，或多層電路能被制造入基本裝置中。
除了已被特異結(jié)合實(shí)體尋址的微場(chǎng)所以外，一個(gè)裝置將包含一些未-被尋址的，或簡(jiǎn)易的微場(chǎng)所它們起其它的功能。這些微場(chǎng)所能被用于貯存試劑，暫時(shí)地保留反應(yīng)物或分析物和為多余反應(yīng)物、分析物或樣品中其它干擾成份，作為處理單元。其它未被尋址的微場(chǎng)所能用于與已尋址的微場(chǎng)所一起去影響或干擾在這些特定微場(chǎng)所上發(fā)生的反應(yīng)。這些微場(chǎng)所增加了裝置內(nèi)活性和控制。這也是可能的即微場(chǎng)所在兩個(gè)分離的裝置間相互作用和轉(zhuǎn)移分子。這提供一種機(jī)理即把從一個(gè)貯存裝置上的結(jié)合實(shí)體或反應(yīng)物加樣到一個(gè)工作裝置上，和拷貝或復(fù)制一個(gè)裝置。
圖3顯示一個(gè)含有64可尋址微場(chǎng)所(30)的矩陣型裝置。64微場(chǎng)所的裝置是一種方便的設(shè)計(jì)，它適合標(biāo)準(zhǔn)微電子芯片包裝元件。這種裝置是在約1.5cm×1.5cm的硅芯片基質(zhì)上制造，帶有大約750μm×750μm含有64個(gè)微場(chǎng)所的中心區(qū)域。每個(gè)微場(chǎng)所(32)大約50μm見方并與相鄰微場(chǎng)所向相距50μm。連接每個(gè)單獨(dú)基礎(chǔ)微電極的電路沿著金屬接觸墊(300μm見方)的外周(10mm×10mm)走線(34)。在帶有微場(chǎng)所的區(qū)域和接觸墊之間形成抬高的內(nèi)周，產(chǎn)生一個(gè)能裝下大約2到10微升(μl)樣品溶液的腔。該“芯片”能被放置在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)鉛塊包裝中，并且芯片的接觸墊(34)與鉛塊包裝的管腳用線相連。包裝了的芯片能隨后插入到一個(gè)微處理機(jī)上控制DC電源輸出和插入到能控制和操縱裝置的萬用表儀器上。
制造過程(微平版印刷)微平版印刷制造步驟通常微平版印刷或照相平版印刷技術(shù)可用于制造具有大量小微場(chǎng)所的復(fù)雜“芯片”類型的裝置。雖然裝置的制造不需要復(fù)雜的照相平版印刷，但材料的選擇和電子裝置能在水溶液中主動(dòng)地起作用的條件必須需要特別的考慮。
圖3所示的64微場(chǎng)所裝置能使用相對(duì)簡(jiǎn)單的蒙片設(shè)計(jì)和標(biāo)準(zhǔn)的微平版印刷技術(shù)來制造。一般地，基底的基質(zhì)材料可以是1到2厘米見方的硅晶片或大約0.5毫米厚的芯片。硅芯片第1步復(fù)蓋一層1到2微米厚二氧化硅(SiO2)絕緣層，它可用等離子體增強(qiáng)的化學(xué)蒸氣沉積(PECVD)而形成。
在下步，通過真空蒸發(fā)而沉積一層0.2到0.5微米金屬層(例如，鋁)。除鋁以外，用于電路的合適金屬包括金、銀、錫、銅、鉑、鈀、碳和各種合金。為了保證極好地粘附到絕緣材料(SiO2)上一些特殊的技術(shù)被用于各種不同的金屬。
下步該芯片復(fù)蓋一層正電的光致抗蝕劑(Shipley，MicropositA2 1350 J)，用線路模型蒙片(光場(chǎng))，曝光和沖洗。光溶的抗蝕劑被沖走，并且暴露的鋁被蝕刻?？刮g劑的小島現(xiàn)在被移走，留下鋁線路模型在芯片上。這包括一個(gè)外周的金屬接觸墊，相連的線路(電線)和作為可尋址微場(chǎng)所基礎(chǔ)的中心列陣的微電極。
使用PECVD，芯片被先復(fù)蓋1層0.2到0.4微米SiO層，然后是0.1到0.2微米氮化硅(Si3N4)層。芯片隨后復(fù)蓋正電的光致抗蝕劑，為接觸墊和微電極場(chǎng)所蒙片，曝光，并沖洗。光溶的抗蝕劑被移走，SiO2和Si3N4層被蝕刻以便暴露鋁接觸墊和微電極。周圍的島式抗蝕劑然后被移走，在接觸墊和微電極間的連接線由SiO2和Si3N4層保持相互絕緣。
SiO2和Si3N4層為裝置的功能提供了重要的特性。首先，第二個(gè)SiO2層具有更好地接觸并增進(jìn)了鋁線路的密封性。也可能應(yīng)用抗蝕劑材料絕緣和密封。這個(gè)防止當(dāng)微電極工作時(shí)由電解影響導(dǎo)致的線路逐漸損害。最終的Si3N4表層復(fù)蓋的應(yīng)用是因?yàn)樵搶优c隨后的用于修飾供粘附特異結(jié)合實(shí)體的微電極表面的試劑具有極低的反應(yīng)性。
滲透和粘附層形成步驟在這時(shí)裝置上的微電極場(chǎng)所已準(zhǔn)備好用特殊的滲透和粘附層來修飾。這代表了本發(fā)明的最重要部分，并且是本裝置主動(dòng)功能化的核心。目標(biāo)是在微電極上構(gòu)建一個(gè)帶有選擇擴(kuò)散特性的中間滲透層和一個(gè)帶有最佳結(jié)合特性的粘附表層。粘附層必須具有從每平方微米(μm2)105到107功能化的場(chǎng)所用于最佳結(jié)合特異結(jié)合實(shí)體。然而，結(jié)合特異的結(jié)合實(shí)體不應(yīng)復(fù)蓋表面或使表面絕緣而阻止下面的微電極起作用。一個(gè)具功能的裝置需要實(shí)際金屬微電極表面的部分區(qū)域(～5％到25％)保持與溶劑(H2O)分子接觸，并允許相反離子(例如，Na+和Cl-)和電解氣體(例如，O2和H2)的擴(kuò)散發(fā)生。
中間的滲透層也必須允許擴(kuò)散的發(fā)生。此外，滲透層必須具有一種孔限特性它限制或阻止較大結(jié)合實(shí)體，反應(yīng)物，和分析物與微電極表面的物理接觸。這滲透層保持活性的微電極表面物理地與微場(chǎng)所的結(jié)合實(shí)體層一定距離。
就原始裝置功能而言，本設(shè)計(jì)允許電泳式轉(zhuǎn)移所需的電解反應(yīng)在微電極表面發(fā)生，但避免了對(duì)結(jié)合實(shí)體，反應(yīng)物，和分析物的不利電化學(xué)影響。
衍生金屬微電極表面的一種優(yōu)選的步驟是應(yīng)用氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)。APS容易與金屬和硅表面的氧化物和/或羥基團(tuán)起反應(yīng)。APS提供一種組合的滲透層和粘附層，并帶有伯胺基團(tuán)用于隨后共價(jià)結(jié)合結(jié)合實(shí)體。就表面結(jié)合位點(diǎn)而言，APS在略氧化的鋁表面產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)高水平的功能化激活(即，大量伯胺基團(tuán))在SiO2表面產(chǎn)生一個(gè)中等水平的功能化激活，和產(chǎn)生非常有限的功能化激活的Si3N4表面。
APS反應(yīng)的進(jìn)行是通過用溶于甲苯的10％APS溶液在50℃處理整個(gè)裝置(即，芯片)表面30分鐘。芯片然后在甲苯，乙醇中沖洗，然后在50℃干燥1小時(shí)。微電極金屬表面即被大量伯胺基團(tuán)(105到106每平方微米)所功能活化?，F(xiàn)在結(jié)合實(shí)體能被共價(jià)地結(jié)合到衍生的微電極表面。
APS步驟對(duì)結(jié)合寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體工作很好。圖4表明結(jié)合3′-末端醛基衍生的寡聚核苷酸(40)到一個(gè)APS功能化激活的表面(42)的機(jī)制。雖然這代表了優(yōu)選的方法的一個(gè)方面，多個(gè)類型結(jié)合實(shí)體共價(jià)的和非-共價(jià)的結(jié)合各種各樣的其它結(jié)合反應(yīng)是可能的。
設(shè)計(jì)和制造(微加工)這部分描述如何使用微加工技術(shù)(例如，鉆孔，銑削，等)或非一平版印刷技術(shù)來制造裝置。通常，這些裝置比那些由微平版印刷技術(shù)生產(chǎn)的裝置具有相對(duì)較大的微場(chǎng)所(＞100微米)。這些裝置能用于分析應(yīng)用，以及制備類型的應(yīng)用，例如生物高分子合成。大的可尋址場(chǎng)所能以三維方式制造(例如，管狀或園筒狀)以便攜帶大量結(jié)合實(shí)體。這種裝置可應(yīng)用各種材料制造，包括，但不局限于，塑料、橡膠、硅、玻璃(例如，微槽的，毛細(xì)管，等等)，或陶瓷。在微加工裝置的情況下，連續(xù)的線路和較大的電極結(jié)構(gòu)能應(yīng)用對(duì)那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)線路板印刷技術(shù)被印刷在材料上。
可尋址的微場(chǎng)所裝置應(yīng)用微加工技術(shù)能相對(duì)簡(jiǎn)單地被制造。圖5一個(gè)代表性96微場(chǎng)所裝置的圖解。這種微場(chǎng)所裝置是從一個(gè)適合的材料坯(2cm×4cm×1cm)通過穿過材料鉆96個(gè)等比例相隔的于(直徑1mm)而制造的。一個(gè)電極線路板(52)是在塑料材料坯的薄片上形成的，它準(zhǔn)確地安置在微場(chǎng)所元件的上部(54)。在線路板的下部含有單根電線(印刷線路)到每個(gè)微場(chǎng)所上(55)。短的鉑電極結(jié)構(gòu)(～3-4mm)(62)被設(shè)計(jì)成延伸進(jìn)入單個(gè)微場(chǎng)所腔(57)。印刷的線路電線用合適的防水絕緣材料覆蓋。印刷線路電線會(huì)聚到一個(gè)孔中，它允許連接到多路開關(guān)控制器(56)和DC電源(58)上。裝置是部分浸沒并在一個(gè)共同的緩沖液貯槽(59)中工作。
雖然由微加工和微平版印刷技術(shù)制造的裝置的微場(chǎng)所的初始功能是相同的，但它們的設(shè)計(jì)是不同的。由微平版印刷制造的裝置，其滲透和粘附層是直接在基礎(chǔ)金屬微電極上形成的。由微加工技術(shù)制造的裝置，其滲透和粘附層由在單個(gè)腔或槽(57)中的緩沖液從它們單個(gè)金屬電極結(jié)構(gòu)(62)上物理地分離開(見圖6)。在微加工的裝置中滲透和粘附層能應(yīng)用功能化的親水凝膠，膜，或其它合適的多孔材料而形成。
一般地說，組合的滲透和粘附層的厚度從10μm到10mm。例如，一種26％到35％聚丙烯酰胺(帶有0.1％聚賴氨酸)的修飾的親水凝膠，能被用來部分填充裝置上每個(gè)獨(dú)立的微場(chǎng)所腔。這種濃度的凝膠形成一種理想的滲透層并帶有從2nm到3nm的孔徑限度。結(jié)合到凝膠中的聚賴氨酸為隨后粘附特異結(jié)合實(shí)體提供伯胺功能基團(tuán)。這種類型的凝膠滲透層允許電極以DC方式主動(dòng)地起功能。當(dāng)電極被激活時(shí)，這凝膠滲透層允許小的相反離子通過，但較大的特異結(jié)合實(shí)體分子在外部表面被濃縮。在這兒它們共價(jià)地結(jié)合到外層伯胺基團(tuán)上，有效地成為粘附層。
為形成滲透和粘附層的另一種技術(shù)是將一種多孔膜材料結(jié)合入每個(gè)微場(chǎng)所腔的基部。膜的外表面隨后用化學(xué)功能基團(tuán)衍生以形成粘附層。進(jìn)行這種方法的合適技術(shù)和材料對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。
上述關(guān)于裝置設(shè)計(jì)和制造的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)基本裝置其它變型或形式的限制。多個(gè)帶有較大量或較小量可尋址微場(chǎng)所裝置的變型是為了不同的分析和制備應(yīng)用被預(yù)想的。帶有較大量可尋址場(chǎng)所的裝置變型是為了制備生物高分子合成的應(yīng)用預(yù)想的。一些變型也被期望作為電子地可尋址的和可控制的試劑分配器為與其它裝置一起使用，包括那些由微平版印刷技術(shù)生產(chǎn)的裝置。
(2)裝置的自我引導(dǎo)的尋址權(quán)利要求的裝置能夠用一個(gè)特異結(jié)合實(shí)體電子地自我尋址每個(gè)微場(chǎng)所。裝置本身直接影響或引起轉(zhuǎn)移和粘附特異結(jié)合實(shí)體到特定微場(chǎng)所上。裝置自我裝配自己以無需外界過程，機(jī)械加工，或在一個(gè)特定微場(chǎng)所放置一個(gè)特異結(jié)合實(shí)體。這種自我尋址過程既快速又特異，并能以系列或平行的方式進(jìn)行。
裝置能通過保持選擇的微場(chǎng)所以DC方式并與特異結(jié)合實(shí)體相反的電荷(電勢(shì))被特異的結(jié)合實(shí)體系列地尋址。所有其它的微場(chǎng)所與特異結(jié)合實(shí)體保持相同的電荷。在結(jié)合實(shí)體不是多于某個(gè)微場(chǎng)所的粘附位點(diǎn)時(shí)，需要活化僅一個(gè)其它微場(chǎng)所以便影響電泳式轉(zhuǎn)移到這特定的微場(chǎng)所上。特異結(jié)合實(shí)體被迅速地轉(zhuǎn)移(幾秒鐘，或最好地短于1秒)通過溶液，并直接地濃縮在特定的微場(chǎng)所上在這兒并立即共價(jià)結(jié)合到特定的表面。在特定微場(chǎng)所上電子地濃縮反應(yīng)物或分析物(70)的能力被表示在圖7。所有其它微場(chǎng)所保持不受那個(gè)特異結(jié)合實(shí)體的影響。任何未反應(yīng)的結(jié)合實(shí)體通過反向那個(gè)特定微場(chǎng)所的極性被移走，并被電泳到一個(gè)處理場(chǎng)所上。這種循環(huán)重復(fù)直至所有希望的微場(chǎng)所被它們特異結(jié)合實(shí)體所尋址。圖8表示用特異性寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體(82、84、86)尋址特定微場(chǎng)所(81、83、85)的系列過程。
為尋址微場(chǎng)所的偶聯(lián)過程簡(jiǎn)單地包括同時(shí)活化大量(特別的基團(tuán)或線路)的微電極以便相同的特異結(jié)合實(shí)體被轉(zhuǎn)移，濃縮，并與多于一個(gè)特定微場(chǎng)所起反應(yīng)。
(3)裝置的應(yīng)用一旦裝置被特異結(jié)合實(shí)體自我尋址后，各種分子生物學(xué)類型的多步和多路反應(yīng)和分析就能在裝置上進(jìn)行。本發(fā)明的裝置能夠電子地提供對(duì)多個(gè)重要反應(yīng)參數(shù)的主動(dòng)的或動(dòng)態(tài)的控制。這種電子控制導(dǎo)致在反應(yīng)速率，特異性，和靈敏性方面顯著提高。在這些反應(yīng)參數(shù)上的提高是由于裝置電子地控制和影響下述事件的能力(1)快速轉(zhuǎn)移反應(yīng)物或分析物到含有結(jié)合著特異結(jié)合實(shí)體的特定微場(chǎng)所上；(2)由于濃縮了與那個(gè)特定微場(chǎng)所上特異結(jié)合實(shí)體起反應(yīng)的反應(yīng)物或分析物而促進(jìn)反應(yīng)速率；和(3)從那個(gè)微場(chǎng)所上快速和選擇地移走那些未反應(yīng)的和非特異性結(jié)合的成份。這些優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用在一個(gè)新的被稱為“電子嚴(yán)格性控制”的過程中。
本發(fā)明的自我可尋址裝置能夠快速地進(jìn)行各種顯微形式的多步和/或多路反應(yīng)和過程；它包括，但不局限于—DNA和RNA雜交過程和分析以傳統(tǒng)的方式，和新的改進(jìn)的矩陣形式；—分子生物學(xué)反應(yīng)過程，例如，限制性酶反應(yīng)和分析，連接反應(yīng)，激酶反應(yīng)，和擴(kuò)增過程；—抗體/抗原反應(yīng)過程包括大或小的抗原和半抗原；—診斷測(cè)定，例如，雜交分析，基因分析，指紋分析，和免疫診斷；—生物分子偶聯(lián)過程(即，共價(jià)和非共價(jià)標(biāo)記核酸、酶、蛋白、或抗體用報(bào)告基團(tuán))；—生物高分子合成過程，例如，寡聚核苷酸或肽的組合性合成；—水溶性合成高分子的合成，例如，碳水化合物或線狀聚丙烯酸酯；和—大分子和納米結(jié)構(gòu)(納米大小顆粒和結(jié)構(gòu))的合成和制造。
核酸雜交核酸雜交被用作本發(fā)明的實(shí)例是因?yàn)樗鼈儙в凶罾щy的多步和多路反應(yīng)的特征。
權(quán)利要求的裝置和方法允許核酸雜交以各種傳統(tǒng)的和新的方式進(jìn)行。裝置電子地控制反應(yīng)參數(shù)的能力極大地改進(jìn)了核酸雜交分析，特別是裝置提供電子嚴(yán)格性控制(ESC)的能力。
“核酸雜交”是表示發(fā)生在所有天然的合成形式的和衍生的核酸間的雜交，包括脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，聚核苷酸和寡聚核苷酸。
傳統(tǒng)的雜交形式，如“斑點(diǎn)”雜交和“夾心”雜交，能用權(quán)利要求的裝置以及大范圍列陣或矩陣形式進(jìn)行。
舉例來說，一種用于DNA雜交分析的裝置以如下的方式被設(shè)計(jì)、制造、和應(yīng)用。微場(chǎng)所的列陣首先用微平版印刷技術(shù)制造。列陣上可尋址微場(chǎng)所的數(shù)量取決于最終的用途。裝置以系列方式被一組特異的寡聚核苷酸快速地自我尋址。在這種情況下，特異的寡聚核苷酸是3′-末端醛基功能化的寡聚核苷酸在(6-mer到100-mer的范圍)。醛基功能基團(tuán)允許共價(jià)粘附到特定微場(chǎng)所粘附表面(見圖4)。這特異的寡聚核苷酸類群能在傳統(tǒng)的DNA合成儀上應(yīng)用傳統(tǒng)技術(shù)方便地合成。
合成每個(gè)特異寡聚核苷酸是從核糖核酸控制的多孔玻璃(CPG)載體上開始的。因此，3′-末端點(diǎn)合有一個(gè)核糖核苷酸，它在合成和純化后通過過碘酸氧化容易地轉(zhuǎn)變成一個(gè)末端二醛衍生物。含有醛基的寡聚核苷酸(40)將容易地與微場(chǎng)所表面的伯胺功能基團(tuán)通過西佛堿反應(yīng)過程反應(yīng)。
裝置用特異寡聚核苷酸的電子尋址在圖8顯示。第1個(gè)特定微場(chǎng)所(ML-1)(81)用它的特異序列寡聚核苷酸(SSO-1)(82)尋址是通過保持該特定微電極(ML-1)在一個(gè)正DC電勢(shì)，而所有其它微電極被保持在一個(gè)負(fù)電勢(shì)(圖8(A))而完成的。在水緩沖液中醛基功能化的特異序列(SSO-1)被自由場(chǎng)電泳到ML-1處，在這兒它濃縮(＞106倍)和立即共價(jià)地結(jié)合到ML-1的表面(81)。所有其它微電極保持負(fù)的，并保留被保護(hù)或隔離，不與SSO-1序列(82)起反應(yīng)。ML-1的電勢(shì)然后反轉(zhuǎn)成負(fù)(-)，以電泳任何未反應(yīng)SSO-1到一個(gè)處理系統(tǒng)。該循環(huán)重復(fù)，SSO-2(84)→ML-2(83)，SSO-3(86)→ML-3(85)，SSO-n→ML-n直到所有期望的微場(chǎng)所用它們特異DNA序列所尋址(圖8(D))。
另一種尋址裝置的方法是從一個(gè)電子試劑提供裝置上轉(zhuǎn)移特異性結(jié)合實(shí)體例如特異性寡聚核苷酸。這種提供裝置能裝載大量結(jié)合實(shí)體或試劑并能被用作加樣分析裝置。結(jié)合實(shí)體將在兩種裝置間被電子地轉(zhuǎn)移。這種步驟取消了在用結(jié)合實(shí)體尋址該裝置過程中對(duì)物理操作，例如移液，的需求在裝置與結(jié)合實(shí)體尋址過程中。
然而另一種尋址裝置的方法是在特定的微場(chǎng)所進(jìn)行組合的合成特異性寡聚核苷酸。組合的合成在下面部分中描述。
在裝置被特異性DNA序列尋址后，列陣裝置上的微場(chǎng)所保持作為獨(dú)立的工作直流(DC)電極。這是可能的因?yàn)檎掣降诫姌O表面是以基礎(chǔ)的微電極不被化學(xué)地或物理地絕緣的方式進(jìn)行的。每個(gè)微電極仍然產(chǎn)生為了自由場(chǎng)電泳式轉(zhuǎn)移其它帶電DNA分子到和離開微場(chǎng)所表面需要的強(qiáng)直流電。DNA列陣裝置對(duì)DNA雜交和任何其它隨后反應(yīng)的所有方面提供的完全電子控制。
電子地控制的雜交過程的一個(gè)實(shí)例表示在圖9。在這種情況，每個(gè)可尋址的微場(chǎng)所具有一個(gè)特異性捕獲序列(90)。含有目標(biāo)DNA(92)的樣品溶液被加到裝置上。所有的微場(chǎng)所被活化并且樣品DNA在微場(chǎng)所被濃縮(圖9(B))。從稀溶液中來的目標(biāo)DNA分子或在微場(chǎng)所高度濃縮，允許非常迅速地雜交到表面上特異性互補(bǔ)DNA序列上。反轉(zhuǎn)微電極電勢(shì)從微場(chǎng)所上排斥所有未雜交的DNA，而目標(biāo)DNA保持已雜交狀態(tài)(圖9(C))。以同樣的模式，報(bào)告探針在隨后步驟中被雜交以便檢測(cè)雜交復(fù)合物。
電子控制雜交過程通過提高整個(gè)雜交效率和通過從微場(chǎng)所區(qū)域移走非-特異DNA顯著提高了目標(biāo)DNA分子的隨后檢測(cè)。這是期望即10,000到100,000拷貝的目標(biāo)序列在未擴(kuò)增的基因組DNA中將是可識(shí)別的。這種類型的雜交反應(yīng)能在數(shù)分鐘內(nèi)，最少的外界操作下進(jìn)行。極度地漂洗不是必須的。
另一種DNA雜交測(cè)定的常見方式包括把目標(biāo)DNA固定在表面，然后雜交特定探針到這些目標(biāo)DNA上。這種方式能包括或相同的目標(biāo)DNA在多個(gè)場(chǎng)所上，或不同的目標(biāo)DNA在特定的場(chǎng)所上。圖10表示這系列雜交方式的一種改進(jìn)方式。在這種情況下微場(chǎng)所(101-107)被不同的捕獲DNA分子所尋址。它們以系列方式被不同序列的特異性寡聚核苷酸(108，109)雜交。這微場(chǎng)所隨后被偏壓成正以便轉(zhuǎn)移分子到它本身上而隨后偏壓成負(fù)以便轉(zhuǎn)移分子到下一個(gè)微場(chǎng)所上。特異地雜交的DNA將保持在微場(chǎng)所上而不管電極的電勢(shì)。序列特異性寡聚核苷酸能用一個(gè)合適的報(bào)告基團(tuán)例如熒光團(tuán)來標(biāo)記。
權(quán)利要求的裝置能夠提供電子嚴(yán)格性控制。嚴(yán)格性控制對(duì)于雜交特異性是必須的，并且對(duì)于分辨點(diǎn)突變中一個(gè)堿基錯(cuò)配是特別重要的。圖11顯示電子嚴(yán)格控制如果被用于為一個(gè)堿基錯(cuò)配分析提高雜交特異性。電子嚴(yán)格控制也能被應(yīng)用到多個(gè)堿基錯(cuò)配分析中。
準(zhǔn)確配合的DNA雜交子(110)比錯(cuò)配DNA(112)雜交子穩(wěn)定。通過偏壓微場(chǎng)所成負(fù)(圖11(B))和在一定時(shí)間內(nèi)釋放一固定量的電能，有可能變性或移走錯(cuò)配的DNA雜交子而保留準(zhǔn)確配合的DNA雜交子(圖11(C))。在進(jìn)一步的改進(jìn)中，權(quán)利要求的裝置對(duì)每個(gè)發(fā)生在裝置上的特定雜交反應(yīng)提供獨(dú)立的嚴(yán)格控制。用傳統(tǒng)的或被動(dòng)的列陣方式，不可能對(duì)發(fā)生在相同雜交溶液中的所有雜交過程獲得最適嚴(yán)格性。然而，本發(fā)明的主動(dòng)列陣裝置能夠?qū)υ诓煌?chǎng)所上的雜交反應(yīng)提供不同的電子嚴(yán)格性，甚至這些雜交反應(yīng)是發(fā)生在同批雜交溶液中。這一特性克服了傳統(tǒng)矩陣雜交形式，雜交測(cè)序(SBH)形式，和其它多路分析的主要限制。
這種對(duì)雜交提供電子嚴(yán)格性控制的能力也提供了檢測(cè)DNA雜交而不用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的DNA探針的機(jī)制。它提供了一種方法來進(jìn)行雜交過程本身更加直接的檢測(cè)。一種熒光染料檢測(cè)過程在圖12顯示并在實(shí)例4和6中描述。直接檢測(cè)DNA雜交子通過應(yīng)用DNA結(jié)合染料例如溴化乙錠能獲得。染料結(jié)合到雙鏈和單鏈DNA上但對(duì)前者有更大的親和力。在圖12(B)中，帶正電荷的染料(122)被轉(zhuǎn)移到負(fù)電地偏壓的微場(chǎng)所上。染料與雜交的(120)和未雜交的(121)DNA序列兩者結(jié)合(圖12C)。通過偏壓微場(chǎng)所成正和在固定時(shí)間內(nèi)釋放一定置的電能，結(jié)合到未雜交微場(chǎng)所上的染料分子被選擇性地移走。應(yīng)用的電能量對(duì)DNA雜交子無不利影響作用。
帶有結(jié)合的染料分子的雜交DNA隨后應(yīng)用配套的或一體化的光學(xué)系統(tǒng)被熒光地檢測(cè)。
下面重復(fù)由本發(fā)明的裝置為核酸雜交反應(yīng)和分析提供的重要的優(yōu)越性(1)快速轉(zhuǎn)移稀的目標(biāo)DNA和/或探針DNA序列到雜交要發(fā)生的特定微場(chǎng)所上。這步在不多于幾秒鐘時(shí)間內(nèi)發(fā)生。
(2)在雜交要發(fā)生的特定微場(chǎng)所上濃縮稀的目標(biāo)DNA和/或探針DNA序列。這濃縮效應(yīng)能超過一百萬倍(＞106)。
(3)從已發(fā)生雜交的特定微場(chǎng)所上快速移走非-特異地結(jié)合的目標(biāo)DNA序列。這步需時(shí)10到20秒。
(4)從已發(fā)生雜交的特定微場(chǎng)所上快速移走競(jìng)爭(zhēng)的互補(bǔ)目標(biāo)DNA序列。這步需時(shí)10到20秒。
(6)在數(shù)分鐘內(nèi)進(jìn)行一次完全雜交過程的能力。
(7)進(jìn)行一次帶有最少外界操作或漂洗步驟的雜交過程的能力。
(8)應(yīng)用電子嚴(yán)格性控制(ESC)移走部分雜交的DNA序列。
(9)進(jìn)行在1000到100,000拷貝數(shù)范圍內(nèi)的未-擴(kuò)增基因組目標(biāo)DNA序列的雜交分析的能力。
(10)應(yīng)用ESC提高單個(gè)堿基錯(cuò)配雜交(點(diǎn)突變)的分辨力。
(11)應(yīng)用ESC在矩陣雜交中提供單個(gè)嚴(yán)格性控制。
(12)通過移走非-特異性背景成份提高雜交反應(yīng)的檢測(cè)。
(13)發(fā)展一種排除了應(yīng)用共價(jià)標(biāo)記的報(bào)告探針或目標(biāo)DNA識(shí)別雜交反應(yīng)需要的新程序。
裝置的復(fù)制除了用特異性結(jié)合實(shí)體分別地尋址單個(gè)裝置以外，也可能生產(chǎn)一種主裝置，它能拷貝特異的結(jié)合實(shí)體到其它裝置上。這代表了生產(chǎn)裝置的另一種方法。復(fù)制裝置的過程顯示在圖13。一個(gè)帶有已用特異性結(jié)合序列尋址的微場(chǎng)所的主裝置與各個(gè)互補(bǔ)DNA序列(130)雜交。這些互補(bǔ)序列被活化并因此能夠共價(jià)結(jié)合到微場(chǎng)所粘附層上。
一個(gè)未尋址的含有粘附層的姐妹裝置(132)與已雜交的主裝置配合(圖13(B))。主裝置的微場(chǎng)所被偏壓成負(fù)而姐妹裝置的微場(chǎng)所被偏壓成正。DNA雜交子被變性并轉(zhuǎn)移到姐妹裝置上，在這兒活化了的DNA序列共價(jià)地結(jié)合到微場(chǎng)所上(圖13(C))。這過程能以并聯(lián)地或串聯(lián)地實(shí)施，取決于裝置的幾何形狀以便微場(chǎng)所間的交叉干擾達(dá)最低。這些雜交子能通過應(yīng)用足夠的負(fù)電勢(shì)或使用一種帶正電的離液劑或變性劑被變性。
識(shí)別系統(tǒng)在熒光結(jié)合反應(yīng)的情況下，能夠使用一種落射熒光類型的顯微鏡檢測(cè)系統(tǒng)來分析結(jié)合反應(yīng)。系統(tǒng)的靈敏度取決于配套的圖像識(shí)別元件(CCD，ICCD，微通道片)或光子計(jì)數(shù)PMT系統(tǒng)。另一種方法是直接地與裝置以夾心方式配套一種靈敏的CCD識(shí)別器或離子雪崩光電二極管(APD)識(shí)別器。再另一種方法是在裝置中組合進(jìn)光電子或微電子檢測(cè)系統(tǒng)。
組合的生物高分子合成本發(fā)明的裝置也能夠進(jìn)行生物高分子例如寡聚核苷酸和肽的組合的合成。這種過程允許自我引導(dǎo)的合成發(fā)生而無需任何外界引導(dǎo)或影響。這種組合的合成允許非常大量的序列在一個(gè)裝置上合成。組合的合成的基本概念包括應(yīng)用裝置在可尋址的微場(chǎng)所上運(yùn)輸，濃縮和反應(yīng)各種單體，結(jié)合試劑，或封閉試劑。這概念利用裝置保護(hù)一些場(chǎng)所不受附近試劑的影響的能力。對(duì)這概念也重要的是在這些化學(xué)合成過程中選擇性步驟的識(shí)別，其中一種或多種反應(yīng)物具有一個(gè)凈正電或負(fù)電，或?yàn)檫@些過程構(gòu)建合適的試劑。
組合的寡聚核苷酸合成的一種方法顯示在圖14。這種方法從一套選擇性的可尋址微場(chǎng)所(140)開始，該微場(chǎng)所表面已用封閉的伯胺(X-NH-)基團(tuán)(142)衍生過。這過程的起始步驟包括應(yīng)用一種帶電的去封閉試劑(144)使電極選擇性地去封閉。在這種情況下，這試劑能攜帶一個(gè)正(+)電荷。這過程是通過應(yīng)用對(duì)那些正被去封閉的電極加上一個(gè)負(fù)電勢(shì)，而對(duì)那些保持被保護(hù)狀態(tài)的電極加上一個(gè)正電勢(shì)(圖14(B))而進(jìn)行的。應(yīng)用正和負(fù)電勢(shì)到選擇的電極上引起帶電試劑在那些正被去封閉的微場(chǎng)所上濃縮，并從其它電極表面排除試劑。
在第二步，化學(xué)結(jié)合上第1個(gè)堿基，在這兒是胞嘧啶，到去封閉的微場(chǎng)所上是通過簡(jiǎn)單地暴露該系統(tǒng)于磷酰胺試劑(X-C)而進(jìn)行的。這(C)核苷酸結(jié)合到去封閉的微場(chǎng)所表面，而不結(jié)合到任何封閉的電極表面(圖14(C)和(D))。在這點(diǎn)上正常的磷酰胺化學(xué)進(jìn)行著直到下步去封閉步驟。
在第二個(gè)去封閉步驟(圖14(D))，那些將結(jié)合下個(gè)堿基的電極點(diǎn)被賦于負(fù)電，而那些仍保持被保護(hù)狀態(tài)的被賦于正電?，F(xiàn)在該系統(tǒng)暴露將結(jié)合的下個(gè)堿基中，在這兒是(X-A)(148)，并獲得選擇的結(jié)合到去封閉的微場(chǎng)所上(圖14(E)和(F))。這結(jié)合和去封閉過程反復(fù)進(jìn)行，直到所有不同的DNA序列在每個(gè)可尋址的微場(chǎng)所表面被合成。
上述的實(shí)例代表一種合成核酸的可能方法。另一種方法包括完全水溶DNA合成。在這種情況下，帶電的水溶結(jié)合試劑，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDCA)，被用于與水溶性核苷酸衍生物一起進(jìn)行寡聚核苷酸合成。這種方法將比現(xiàn)有的基于有機(jī)溶劑的方法具有重要的優(yōu)越性，現(xiàn)有的方法需要極度地封閉堿基的組成部分。水溶性合成將是花費(fèi)少的并消除了使用那些在現(xiàn)今基于有機(jī)溶劑過程中使用的多個(gè)有毒物質(zhì)。第三種方法包括應(yīng)用帶電的單體。
在DNA合成外，相似的過程能發(fā)展用于肽合成，和其它復(fù)雜高分子的合成。在本說明書中仔細(xì)考慮的實(shí)例代表這技術(shù)的起始點(diǎn)，并是基于DNA或肽合成的有機(jī)溶劑合成過程。
在如下實(shí)例中的緩沖液、溶液，和培養(yǎng)液的配方描述在J.Sambrook，E.F.Fritsch and F.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2nd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1989。
實(shí)施例1寡聚體試劑合成的DNA探針應(yīng)用傳統(tǒng)的磷酰胺化學(xué)在Applied Biosystems自動(dòng)DNA合成儀上合成。寡聚體被設(shè)計(jì)成含有5′氨基或3′核糖核苷末端。5′端功能活化的實(shí)現(xiàn)通過應(yīng)用ABI氨基連接臂2試劑而3′端功能活化則通過啟動(dòng)從一個(gè)RNA CPG載體上的合成開始。3′核糖核苷酸末端能通過能與伯胺基團(tuán)反應(yīng)生成席佛堿的過碘酸氧化方法轉(zhuǎn)化成一個(gè)二醛基末端。反應(yīng)條件如下水中溶解20-30 O.D.的寡聚體使終濃度達(dá)1 O.D./μl。加入1體積的0.1M醋酸鈉，pH 5.2和1體積0.45M過碘酸鈉(用新鮮水配制)。在周圍溫度下在黑暗中保持?jǐn)嚢璨⒎磻?yīng)至少2小時(shí)。加樣反應(yīng)混合物到0.1M磷酸鈉pH 7.4緩沖液平衡的Sephadex G-10柱上(巴氏德移液管，0.6×5.5cm)。收集200μl級(jí)分，點(diǎn)樣2μl水溶液在薄層層析(孔C)上并收集紫外(UV)吸收級(jí)分。
如下的寡聚體含有3′核糖核苷酸末端(U)ET12R 5′-GCT AGC CCC TGC TCA TGA GTC TCUCP-15′-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAUAT-A1 5′-CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGAGAC TGC CTG UAT-A2 5′-GAG TTC AGC AAA TTT GGA GUAT-A3 5′-CGT AGA ACT CCT CAT CTC CUAT-A4 5′-GTC TCC TTC CTC TCC AGUAT-A5 5′-GAT GAG CAG TTC TAC GTG GUAT-A6 5′-CTG GAG AAG AAG GAG ACUAT-A7 5′-TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC UAT-A8 5′-TTC CGC AGA TTT AGA AGA TUAT-A9 5′-TGT TTG CCT GTT CTC AGA CUAT-A10 5′-CAT CGC TGT GAC AAA ACA TU含有5′氨基的寡聚體通常地與熒光團(tuán)，例如德克薩斯紅(TR.ex，590nm，em.610nm)起反應(yīng)?；酋Ｂ葘?duì)伯胺基是非?；顫姷囊孕纬梢粋€(gè)穩(wěn)定的氨磺酰鍵。德克薩斯紅-DNA結(jié)合物的形成如下德克薩斯紅磺酰氯(分子探針)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中到終濃度為50mg/ml(80mM)。寡聚體溶解在0.4M碳酸氫鈉pH 9.0-9.1中，達(dá)終濃度1 O.D./μl(對(duì)21-mer是5.4mM)。在一個(gè)微試管中，10μl寡聚體和20μl德克薩斯紅混合。在黑暗中讓反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。用氨水或羥胺終止反應(yīng)，凍干樣品并用PAGE純化(Sambrooket al.，1989，Supra)。
如下的寡聚體含有5′氨基末端ET21A 5′-Aminolink2-TGC GAGCTG CAG TCA GAC ATET10AL 5′-Aminolink2-GAG AGA CTC ATG AGC AGGET11AL 5′-Aminolink2-CCT GCT CAT GAG TCT CTCT2 5′-Aminolink2-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTRC-A1 5′-Aminolink2-CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCCAGG TCC ACG TAGRC-A2 5′-Aminolink2-CTC CAA ATT TGC TGA ACT CRC-A3 5′-Aminolink2-GGA GAT GAG GAG TTC TAC GRC-A4 5′-Aminolink2-CTG GAG AGG AAG GAG ACRC-A5 5′-Aminolink2-CCA CGT AGA ACT GCT CAT CRC-A6 5′-Aminolink2-GTC TCC TTC TTC TCC AGRC-A7 5′-Aminolink2-GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAARC-A8 5′-Aminolink2-ATC TTC TAA ATC TGC GGA ARC-A9 5′-Aminolink2-GTC TGA GAA CAG GCA AAC ARC-A10 5′-Aminolink2-ATG TTT TGT CAC AGC GAT G實(shí)施例2在一種微加工的裝置上的電子地可尋址微場(chǎng)所——聚賴氨酸方法微電極從毛細(xì)管(0.2mm×5mm)制成。毛細(xì)管被充滿合有0.1～1.0％聚賴氨酸的18-26％聚丙烯酰胺并讓其聚合。多余的毛細(xì)管被做記號(hào)和移走以防止捕獲在管子中的氣泡并標(biāo)準(zhǔn)化管子長(zhǎng)度。毛細(xì)管以這樣一種方式安放以使它們共享一個(gè)共同的上緩沖液貯槽并有單獨(dú)的低緩沖液貯槽。每個(gè)低緩沖液貯槽包含有一個(gè)鉑線電極。
上槽中毛細(xì)管的頂表面被認(rèn)為是可尋址的微場(chǎng)所，上和下槽充滿0.1M磷酸鈉pH 7.4緩沖液并用BioRad 500/1000電源在0.05mA恒流預(yù)電泳10分鐘將2μl(0.1 O.D.)過碘酸氧化的ET12R移液入上貯槽同時(shí)電源接上在恒流下電泳2-5分鐘。反轉(zhuǎn)極性從而使測(cè)試毛細(xì)管被偏壓面成負(fù)并電泳另一個(gè)2-5分鐘。未結(jié)合的DNA被吸掉上槽緩沖液并用緩沖液沖洗。拆除裝置并安裝一個(gè)新鮮的參考毛細(xì)管。重新充滿貯槽并加入熒光標(biāo)記的補(bǔ)體DNA，即，ET10AL-TR。在正電地偏壓的測(cè)試微場(chǎng)所電泳地濃縮寡聚體，在0.05mA恒電流下達(dá)2-5分鐘。反轉(zhuǎn)極性并移走未結(jié)合的補(bǔ)體。移走測(cè)試毛細(xì)管并檢查熒光。對(duì)非-特異性結(jié)合的負(fù)控制是按上述實(shí)施的只要用一個(gè)非互補(bǔ)性DNA序列ET21A-TR代替ET10AL-TR。
毛細(xì)管微場(chǎng)所的橫截面用配有Hamamatsu ICCD照相圖像系統(tǒng)的落射熒光顯微鏡觀察。熒光結(jié)果表明補(bǔ)體ET10AL-TR雜交到結(jié)合實(shí)體/捕獲序列上，并且即使當(dāng)電勢(shì)被改變成負(fù)時(shí)仍保持雜交狀態(tài)。ET21A-TR非互補(bǔ)體當(dāng)電勢(shì)反轉(zhuǎn)時(shí)不保留在測(cè)試毛細(xì)管上。
實(shí)施例3在一個(gè)工制造的裝置上的電子地可尋址微場(chǎng)所——琥珀酰亞胺丙烯酸酯方法本實(shí)施例描述共價(jià)地結(jié)合寡聚體的5′末端的另一種粘附化學(xué)。毛細(xì)管的制造同上述除了1％琥珀酰亞胺丙烯酸酯(分子探針)用于代替聚賴氨酸。毛細(xì)管新鮮制備因?yàn)殓牾啺孵ヅc伯胺基起反應(yīng)并是不穩(wěn)定的，特別在高于pH 8.0時(shí)。毛細(xì)管按上述安放，并且貯槽充滿0.1M磷酸鈉pH 7.4緩沖液。在0.05mA預(yù)電泳毛細(xì)管10分鐘。移液2μl含有5′氨基末端的ET10AL(0.1 O.D.)，進(jìn)入上貯槽中然后電源接上電泳2-5分鐘。反轉(zhuǎn)極性以便測(cè)試毛細(xì)管被偏壓成負(fù)并再電泳2-5分鐘。未結(jié)合的DNA被排斥而共價(jià)結(jié)合的DNA保留下。
吸掉上槽緩沖液并用緩沖液沖洗。拆除參考毛細(xì)管并安裝一個(gè)新鮮的參考毛細(xì)管。重新充滿貯槽并加入熒光標(biāo)記的補(bǔ)體寡聚體，ET11AL-TR和同上述一樣電泳。對(duì)非特異結(jié)合的陰性對(duì)照同上述一樣實(shí)施只要用一個(gè)非補(bǔ)體DNA序列ET21A-TR代替ET11AL-TR。
熒光結(jié)果表明補(bǔ)體ET11Al-TR雜交到捕獲序列上并即使電勢(shì)被改變成負(fù)時(shí)仍保持雜交狀態(tài)。ET21A-TR非-補(bǔ)體當(dāng)電勢(shì)反轉(zhuǎn)時(shí)不保留在工作毛細(xì)管上。
實(shí)施例4電子控制的熒光染料檢測(cè)過程-PAGEDNA染料例如溴化乙錠(EB)當(dāng)結(jié)合入DNA時(shí)成為熒光的。當(dāng)DNA是雙鏈時(shí)比單鏈時(shí)熒光和結(jié)合親和力更大。如同實(shí)施例1一樣制備毛細(xì)管并同上述一樣雜交。EB被加到溶液中(～0.05mM EB終濃度)測(cè)試毛細(xì)管被偏壓成負(fù)因?yàn)镋B是帶正電的。毛細(xì)管在550nm激發(fā)和600nm發(fā)射時(shí)觀察落射熒光。雜交的和未雜交的微場(chǎng)所表示紅色熒光(從EB上)。
毛細(xì)管被重新安裝并偏壓成正以排斥EB。保持恒流在0.05mA達(dá)0.03伏特-小時(shí)。
捕獲 目標(biāo) 正常的信號(hào)ET10ALET11AL(正) ＞200ET10ALET21A(負(fù)) 1在未雜交的微場(chǎng)所上的熒光減小而雜交的毛細(xì)管保持熒光。熒光信號(hào)用一臺(tái)ICCD照相圖像系統(tǒng)和特征峰熒光密度來測(cè)量。如果整個(gè)熒光信號(hào)區(qū)域被積分的話信噪比是＞＞1000倍。這表明了一種提高信噪比并從而提高測(cè)定的動(dòng)力學(xué)范圍的方法。
實(shí)施例5金屬基質(zhì)上的電子地可尋址場(chǎng)所鋁(Al)和金(Au)電線(0.25mm Aldrich)與溶于甲苯中的10％ 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)起反應(yīng)。APS試劑容易地與金屬表面氧化物和/或羥基基團(tuán)起反應(yīng)形成在氧化物和/或羥基基團(tuán)與伯胺基團(tuán)間的共價(jià)鍵。任何鋁的預(yù)處理是不需要的。金線在5×SSC溶液中電解以便形成氧化層。另外地金屬線能用高氯酸浴氧化。
APS反應(yīng)的實(shí)施如下金屬線切成3英寸放入玻璃皿中。加入甲苯完全覆蓋金屬線并在加熱板上加溫到50～60℃。加入APS到終濃度10％?；旌先芤翰⒗^續(xù)反應(yīng)30分鐘。用數(shù)倍體積甲苯?jīng)_洗3次，然后用數(shù)倍體積乙醇沖洗3次在50℃烘箱中干燥。經(jīng)APS處理的金屬線能與醛基反應(yīng)形成席佛堿。結(jié)合實(shí)體ET12R同其它地方描述的一樣用高碘酸氧化。電極被放入裝有去空氣水的槽中。電源加上0.05mA恒流保持3D秒?；罨^的ET12R立即放入。接上電源，液體被吸出并加入新鮮水然后再次吸出。測(cè)試(偏壓成正)和參考電極放入含有熒光標(biāo)記的補(bǔ)體DNA，ET10-TR的雜交緩沖液(HB，5×SSC，0.1％SDS)中。2分鐘以后用漂洗緩沖液(1×SSC，0.1％SDS)沖洗電極3次，每次1分鐘并觀察熒光(ex.590nm em.610nm)。
結(jié)果表明ET12R被特異地結(jié)合到處理過的金屬表面上。測(cè)試電極是熒光的而參考電極無熒光。非-特異性DNA吸附到金屬上是由在雜交緩沖液中的SDS所防止。因電解而粘附到金基質(zhì)上和隨后的APS處理是有效的。獲得的信號(hào)是顯著強(qiáng)于由未-氧化的金獲得的信號(hào)。更加重要地，這實(shí)例表明金屬表面能用一個(gè)結(jié)合實(shí)體化學(xué)地功能化和衍生并不與溶液成為絕緣狀態(tài)。APS方法代表了形成DNA-金屬結(jié)合物的多個(gè)現(xiàn)存化學(xué)方法中的一種。
實(shí)施例6電子地控制的熒光染料識(shí)別過程——金屬線DNA-鋁電極基質(zhì)如同實(shí)例5中描述的一樣制備和雜交。雜交的和未雜交的DNA-Al電極用一個(gè)未衍生的Al線作為參考而制備。EB被加入到溶液中測(cè)試DNA電極被偏壓成負(fù)來吸引染料。溶液被吸走并加入新鮮緩沖液。金屬表面在顯微鏡下檢查。
重新安裝裝置并加上正電電勢(shì)達(dá)一定伏特小時(shí)。緩沖液被吸走，電極通過落射熒光被觀察。這被反復(fù)直到在雜交的和未雜交的金屬表面有一個(gè)顯著的熒光區(qū)別。
捕獲 目標(biāo) 正常的信號(hào)ET12R ET10AL(正) ＞140ET12R 無(負(fù)) 1未雜交金屬表面的熒光減小而雜交的金屬表面保持熒光。熒光信號(hào)用一臺(tái)ICCD照相圖像系統(tǒng)和特征峰熒光密度來測(cè)量。如果整個(gè)熒光信號(hào)區(qū)域被積分則信噪比將是＞＞1000倍。本實(shí)施例表明一種增加信噪比和因此提高測(cè)量動(dòng)力學(xué)范圍的方法。相似的結(jié)果應(yīng)用毛細(xì)管凝膠構(gòu)型獲得，指明電化學(xué)影響不極大地影響測(cè)量的實(shí)施。
實(shí)施例7主動(dòng)地編程的電子矩陣(APEX)——微機(jī)械加工制造一個(gè)6個(gè)可尋址250μm毛細(xì)管場(chǎng)所的放射狀列陣被微機(jī)械加工。該裝置有一個(gè)共同的上槽和分離的下槽以便每個(gè)微場(chǎng)所的電勢(shì)是單個(gè)可尋址的。一個(gè)唯一的寡聚體結(jié)合實(shí)體用在其它地方描述的方法定位于和結(jié)合到某個(gè)特異的毛細(xì)管微場(chǎng)所上。測(cè)試微場(chǎng)所有一個(gè)正電勢(shì)而其它微場(chǎng)所有負(fù)電勢(shì)以防止非-特異性相互作用。
列陣被漂洗然后與一個(gè)互補(bǔ)熒光標(biāo)記的DNA探針雜交。列陣被漂洗以移走多余的探針然后在落射熒光顯微鏡下觀察。只有特異地尋址的微場(chǎng)所將是熒光的。過程將用其它結(jié)合實(shí)體在其它場(chǎng)所重復(fù)并用一個(gè)標(biāo)記了其它熒光成分的探針雜交來證明。
DNA序列被特異地置于事先確定的位置與其它場(chǎng)所只有可忽略的交叉干擾。這使得用幾個(gè)到數(shù)百個(gè)唯一序列在事先確定的場(chǎng)所制造微矩陣成為可能。
實(shí)施例8主動(dòng)的編程的電子矩陣(APEX)——微平板印刷制造一個(gè)8×8矩陣的50μm見方的鋁電極墊在硅晶片(見圖3)上被設(shè)計(jì)，制造和包裝出來，帶有一個(gè)開關(guān)盒(見裝置制造部分詳述)。進(jìn)行數(shù)種材料和過程的改進(jìn)同下述，以便提高芯片的選擇性和有效性。
8a)選擇頂部復(fù)蓋層APS過程包含在整個(gè)芯片中。功能活化過程的選擇性取決于芯片表面的反應(yīng)性。為了減小功能活化和微場(chǎng)所周圍區(qū)域隨后DNA粘附，一種比SiO2或金屬氧化物對(duì)APS低反應(yīng)性的材料是需要的。光致抗蝕劑和氨化硅被試驗(yàn)。不同的頂部復(fù)蓋層被加到二氧化硅芯片上。芯片用落射熒光檢查并隨后用APS處理接著共價(jià)粘附高碘酸氧化的多聚ARNA序列(Sigma，MW 100,000)。芯片用200nM用德克薩斯紅標(biāo)記的20-mer(T2-TR)溶液在雜交緩沖液中雜交，在37℃5分鐘。芯片用WB漂洗3次并用1×SSC漂洗1次。芯片用熒光在590nm激發(fā)610nm處發(fā)射檢查。
氮化硅被選中因?yàn)橄鄬?duì)于二氧化硅它具有對(duì)APS更少的反應(yīng)性并不象所試的光致抗蝕劑那樣本身具有熒光。其它方法例如UV燃燒背景區(qū)域也是可能的。
8b)APEX物理的特性完成的矩陣芯片應(yīng)用一個(gè)配有B & L顯微鏡和CCD照相機(jī)的探針測(cè)試平臺(tái)(微操作型號(hào)6000)視覺檢查。芯片測(cè)試在測(cè)試墊和外圍接觸墊聞的連續(xù)性。這測(cè)試借助用連接在萬用表上的操作探針頭接觸這些墊進(jìn)行。連續(xù)性保證了墊已被蝕刻低到金屬表面。這些墊隨后檢查在電解環(huán)境中的穩(wěn)定性。金屬線被調(diào)整以在正常干燥條件下操縱達(dá)1mA電流。然而，對(duì)潮濕環(huán)境的反應(yīng)不知道。一滴(1～5μl)緩沖溶液(1×SSC)被移液到8×8矩陣上。表面張力保持液體在一處使得外圍接觸墊區(qū)域干燥。一個(gè)探針頭接觸接觸墊而另一個(gè)探針頭接觸液體。電流增加到50nA以最高電壓50V，使用HP6625A電源和HP3458A數(shù)字萬用表。
開始的制造包括硅基質(zhì)，一個(gè)二氧化硅絕緣層，鋁沉積和模型，和一個(gè)氨化硅頂端層。這些芯片在潮濕環(huán)境中不非常穩(wěn)定因?yàn)榻饘?氮接觸面是天然物理的電解將破壞氮化層。這將導(dǎo)致墊電子地變短。進(jìn)一步地，氮化硅和鋁具有不同的膨脹系數(shù)以致于當(dāng)電流加上時(shí)氮化層將斷裂。這將導(dǎo)致溶液直接地接觸金屬，再次導(dǎo)致電解而進(jìn)一步破壞氮化層。
第二制造步驟包括在鋁金屬和氮化硅層間的二氧化硅絕緣層。二氧化硅和鋁具有更加兼容的物理特性并可形成一個(gè)較好的化學(xué)界面以提供更穩(wěn)定和結(jié)實(shí)的芯片。
8c)DNA粘附矩陣芯片用APS試劑按實(shí)例5中描述的方法功能化活化。芯片然后用高碘酸氧化的多聚A RNA處理(Sigma，平均分子量100,000)。芯片在WB中漂洗去除多余和未結(jié)合的RNA。這一過程用捕獲序列復(fù)蓋整個(gè)芯片并在暴露的金屬表面比氮化物覆蓋的區(qū)域有更高的密度。芯片與200nM T2-TR溶液在HB中雜交5分鐘37℃。然后在周圍溫度下WB中洗3次和1×SSC中洗1次每次1分鐘。芯片檢查在590nm激發(fā)610nm發(fā)射的熒光。
開放的金屬區(qū)域略有熒光并有墊的形狀。低熒光密度和/或不規(guī)則邊界表明這些墊沒有完全地開放。額外的等離子體蝕刻時(shí)間是需要的。
8d)電子控制的雜交主動(dòng)地雜交的實(shí)施借助應(yīng)用實(shí)例8c中的芯片并偏壓一個(gè)微場(chǎng)所成正。這是通過使用也能自動(dòng)地偏壓剩余的微場(chǎng)所成負(fù)的開關(guān)箱或通過使用一個(gè)外部溶液電極實(shí)現(xiàn)的。僅3微升水被放置在矩陣墊上。電流，～1-5nA，加上達(dá)數(shù)秒鐘并加上0.1pmole T2-TR到溶液中。液體被移走芯片干燥并在德克薩斯紅波長(zhǎng)處檢查熒光(ex.590nm，em.610nm)。
僅僅正電地偏壓的微場(chǎng)所是熒光的。這能重復(fù)數(shù)次以便選擇性地雜交其它微場(chǎng)所。此外，在某微場(chǎng)所熒光的DNA借助偏壓原始場(chǎng)所成負(fù)而目的場(chǎng)所成正能被轉(zhuǎn)移置于另一個(gè)微場(chǎng)所上。
8e)電子控制的尋址和裝置制造矩陣被功能化活化用APS如同上述。結(jié)合實(shí)體CP-1用高碘酸氧化方法活化。矩陣中4個(gè)微場(chǎng)所偏壓成正而剩余的微場(chǎng)所被偏壓成負(fù)。2μl水被置于矩陣上并加上電流。加上結(jié)合實(shí)體，CP-1，并允許在指定的場(chǎng)所濃縮。移走液體，芯片用水簡(jiǎn)單沖洗并將2μl水置于芯片上。再次，加上電流達(dá)數(shù)秒鐘并加入0.1皮摩爾T2-TR。在短時(shí)間后液體被移走整個(gè)芯片在WB中漂洗3次。干燥芯片檢查熒光。
結(jié)果指明正電地偏壓的微場(chǎng)所是熒光的。本實(shí)施例示范了用特異結(jié)合實(shí)體選擇性尋址微場(chǎng)所，定位和共價(jià)結(jié)合序列到微場(chǎng)所上，以及互補(bǔ)目標(biāo)序列特異性雜交到衍生的微場(chǎng)所上。
8f)基因的模式APEX芯片帶有3′核糖核苷末端的DNA結(jié)合實(shí)體被合成它對(duì)HLA基因dQa的多態(tài)性是特異的。這結(jié)合實(shí)體用上述的高碘酸氧化法來活化。反向補(bǔ)體也合成帶有5′氨基末端并與熒光團(tuán)結(jié)合，例如德克薩斯紅，若丹明或Bodipy染料，如同在其它處描述的。微場(chǎng)所用伯胺基通過APS處理被功能性活化，如同其它處描述的。數(shù)μl溶液置于矩陣上而留下接觸墊干燥。通過偏壓該微場(chǎng)所成正某特異微場(chǎng)所被尋址，加入高碘酸氧化過的DNA寡聚體，約0.1皮摩爾，并轉(zhuǎn)移定位共價(jià)地結(jié)合到那個(gè)場(chǎng)所上。極性被反轉(zhuǎn)未結(jié)合的結(jié)合實(shí)體分子被移走。對(duì)另一個(gè)結(jié)合實(shí)體在另一個(gè)尋址的微場(chǎng)所重復(fù)該過程直到所有特殊的結(jié)合實(shí)體被結(jié)合到芯片上。芯片然后雜交到單個(gè)熒光標(biāo)記的補(bǔ)體序列上以便確定結(jié)合反應(yīng)的特異性以及立刻整個(gè)地顯現(xiàn)所有被尋址的微場(chǎng)所。在相同的已被變性移走互補(bǔ)寡聚體(10分鐘90℃在0.05％SDS中)的芯片上，尋址的微場(chǎng)所與未標(biāo)記的反向補(bǔ)體或基因組DNA雜交。通過別處描述的熒光染料檢測(cè)測(cè)定法而識(shí)別。
結(jié)果將表明微場(chǎng)所是特異地被獨(dú)特的結(jié)合實(shí)體尋址。對(duì)負(fù)電偏壓的微場(chǎng)所的非特異的結(jié)合可忽略不計(jì)。裝置和配合的結(jié)合實(shí)體化學(xué)在變性條件下是穩(wěn)定的，因此使得尋址的和制造的裝置能重復(fù)使用。變性雜交子的其它方法是增加電流和/或增加加上電流的時(shí)間。
實(shí)施例9電子的嚴(yán)格性控制裝置影響電子嚴(yán)格性控制的能力是用Ras癌基因模式系統(tǒng)來示范的。一個(gè)單堿基對(duì)錯(cuò)配反向地影響解鏈溫度(Tm)，雙螺旋穩(wěn)定性的一種指標(biāo)。傳統(tǒng)的區(qū)別錯(cuò)配和完全配合的方法(即嚴(yán)格性控制)取決于溫度和鹽的條件。嚴(yán)格性也受到電泳的電勢(shì)的影響。下面列出的寡聚體能被配對(duì)而形成具0～2個(gè)錯(cuò)配的雜交子。寡聚體結(jié)合實(shí)體被結(jié)合到微場(chǎng)所上并雜交，如同其它處描述的一樣。微場(chǎng)所的極性然后反轉(zhuǎn)，雜交子接受恒電流達(dá)一定時(shí)間，或確定的功率水平以便變性錯(cuò)配對(duì)而不影響完全配合。
Ras-G5′-GGT GGT GGG CGC CGGCGG TGT GGG CAA GAU-3′Ras-13′-CC GCG GCCGCC ACA C-Aminolink2-5′Ras-23′-CC GCG GCAGCC ACA C-Aminolink2-5′Ras-33′-CC GTG GCAGCC ACA C-Aminolink2-5′Ras-T5′-GGT GGT GGG CGC CGTCGG TGT GGG CAA GAU-3′微電極是從毛細(xì)管制造的如同其它處描述。結(jié)合實(shí)體Ras-G經(jīng)高碘酸氧化并共價(jià)地結(jié)合到已尋址的微場(chǎng)所上。Ras-G微場(chǎng)所隨后與完全配合的Ras-1-TR雜交，與一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(G-A)的Ras-2-TR或二個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(G-A或G-T)的Ras-3-TR雜交。微場(chǎng)所熒光檢查以便證實(shí)互補(bǔ)序列是雜交的和雜交到何種程度。毛細(xì)管被重新安裝并加上恒電流達(dá)到控制的時(shí)間直到錯(cuò)配雜交子被移走而不顯著影響完全地配合的雜交子。
結(jié)果將指明嚴(yán)格性能受到電泳的電勢(shì)的影響。該實(shí)施例示范了每個(gè)微場(chǎng)所能具有單個(gè)的嚴(yán)格性控制，因此克服了對(duì)于被限制于單個(gè)共同的嚴(yán)格性水平的大范圍的并聯(lián)過程技術(shù)的一個(gè)主要障礙。
權(quán)利要求
1.一種用于電子控制含有對(duì)某個(gè)結(jié)合場(chǎng)所特異結(jié)合實(shí)體和非特異結(jié)合實(shí)體的溶液中帶電結(jié)合實(shí)體的相互作用的方法，它包括下列步驟放置該溶液接觸含有第1基礎(chǔ)電極的和一個(gè)覆蓋的滲透層的第1結(jié)合場(chǎng)所，和含有第2基礎(chǔ)電極的和一個(gè)覆蓋的滲透層的第2結(jié)合場(chǎng)所；放置所述第1結(jié)合場(chǎng)所在相對(duì)于所述第2結(jié)合場(chǎng)所的一個(gè)吸引勢(shì)，在所述第1場(chǎng)所濃縮結(jié)合實(shí)體。
2.一種用于電子控制含有對(duì)第1和第2結(jié)合場(chǎng)所特異結(jié)合和非特異結(jié)合DNA序列的溶液中DNA雜交的方法，它包括下列步驟放置該溶液接觸第1、第2和第3場(chǎng)所；放置所述第1和第2結(jié)合場(chǎng)所在一個(gè)正電勢(shì)而所述第3場(chǎng)所在一個(gè)負(fù)電勢(shì)，在所述第1和第2場(chǎng)所濃縮DNA；放置所述第1和第2特異性結(jié)合場(chǎng)所在一個(gè)負(fù)電勢(shì)而所述第3場(chǎng)所在一個(gè)正電勢(shì)；和放置所述第1和第2結(jié)合場(chǎng)所在相對(duì)于所述第3場(chǎng)所的負(fù)電勢(shì)，其中所述負(fù)電勢(shì)或電流足以從所述第1和第2場(chǎng)所上移走非特異地結(jié)合的DNA，而不足以移走特異地結(jié)合的DNA序列。
3.一種用于電子控制含有對(duì)第1結(jié)合場(chǎng)所和隨后第2特異結(jié)合場(chǎng)所特異和非特異DNA序列的溶液中DNA雜交的方法，它包括下列步驟放置該溶液接觸所述第1、第2和第3場(chǎng)所；放置所述第1結(jié)合場(chǎng)所在一個(gè)正電勢(shì)而所述第2結(jié)合場(chǎng)所在一個(gè)負(fù)電勢(shì)，在所述第1場(chǎng)所上濃縮DNA；放置所述第1結(jié)合場(chǎng)所在一個(gè)負(fù)電勢(shì)而所述第2結(jié)合場(chǎng)所在一個(gè)正電勢(shì)，在所述第2場(chǎng)所濃縮DNA；和放置所述第1和第2結(jié)合場(chǎng)所在相對(duì)于所述第3結(jié)合場(chǎng)所的負(fù)電勢(shì)，其中所述負(fù)電勢(shì)或電流足以從所述第1和第2場(chǎng)所上移走非特異地結(jié)合的DNA而不足以移走特異地結(jié)合的DNA。
4.權(quán)利要求3的雜交方法，其中所述負(fù)電勢(shì)或電流是逐漸地增加或減少的。
5.權(quán)利要求2或3的方法，其中復(fù)合的特異和非特異DNA序列被應(yīng)用于一個(gè)結(jié)合場(chǎng)所的列陣上。
6.權(quán)利要求1的用于電子控制相互作用的方法，它包括下列步驟放置所述第1結(jié)合場(chǎng)所于一個(gè)相對(duì)于第2結(jié)合場(chǎng)所的排斥勢(shì)，其中所述排斥勢(shì)足以從所述第1結(jié)合場(chǎng)所上移走非特異地結(jié)合的結(jié)合實(shí)體，而不足以移走特異地結(jié)合的結(jié)合實(shí)體。
7.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將特異性結(jié)合實(shí)體附著在第一結(jié)合場(chǎng)所的滲透層上。
8.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將在第一結(jié)合場(chǎng)所上濃縮的結(jié)合實(shí)體與結(jié)合到滲透層的互補(bǔ)的特異性結(jié)合實(shí)體相互作用。
9.權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括反轉(zhuǎn)第一結(jié)合場(chǎng)所的電勢(shì)，其數(shù)量足以從所述第1結(jié)合場(chǎng)所上移走非特異地結(jié)合的結(jié)合實(shí)體，而不足以移走特異地結(jié)合的結(jié)合實(shí)體。
10.權(quán)利要求1的方法，其中的特異性結(jié)合實(shí)體包括一種能通過共價(jià)鍵與其它分子特異性親和結(jié)合的生物分子。
11.權(quán)利要求1的方法，其中的特異性結(jié)合實(shí)體包括一種能通過非共價(jià)鍵與其它分子特異性親和結(jié)合的生物分子。
12.權(quán)利要求1的方法，其中的特異性結(jié)合實(shí)體包括一種能通過共價(jià)鍵與其它分子特異性親和結(jié)合的合成分子。
13.權(quán)利要求1的方法，其中的特異性結(jié)合實(shí)體包括一種能通過非共價(jià)鍵與其它分子特異性親和結(jié)合的合成分子。
14.權(quán)利要求1的方法，其中的特異的結(jié)合實(shí)體選自脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，合成的寡聚核苷酸、抗體、蛋白質(zhì)、肽、凝集素、修飾的多糖，合成的復(fù)合大分子，具功能的納米結(jié)構(gòu)，合成高分子，修飾/封閉的核苷酸/核苷，修飾/封閉的氨基酸、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、配體、螯合物和半抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于電子控制含有對(duì)某個(gè)結(jié)合場(chǎng)所特異結(jié)合實(shí)體和非特異結(jié)合實(shí)體的溶液中帶電結(jié)合實(shí)體的相互作用的方法。本發(fā)明還涉及一種用于電子控制含有對(duì)第1和第2結(jié)合場(chǎng)所特異結(jié)合和非特異結(jié)合DNA序列的溶液中DNA雜交的方法。本發(fā)明涉及一種用于電子控制含有對(duì)第1結(jié)合場(chǎng)所和隨后第2特異結(jié)合場(chǎng)所特異和非特異DNA序列的溶液中DNA雜交的方法。其中，借助于對(duì)于上述場(chǎng)所的電勢(shì)的調(diào)控，濃縮結(jié)合實(shí)體，例如DNA序列，并且保證在上述場(chǎng)所的結(jié)合實(shí)體，例如DNA序列，的特異性結(jié)合。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1558207SQ20041000406
公開日2004年12月29日 申請(qǐng)日期1994年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月1日
發(fā)明者M·J·赫勒, M J 赫勒, E·杜 申請(qǐng)人:內(nèi)諾金有限公司