專利名稱：診斷精神分裂癥的藥物試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷精神分裂癥的藥物試劑盒。具體地涉及以應(yīng)用抗表皮生長因子抗體(Epidermal Growth FactorEGF)為特征的診斷精神分裂癥的藥物試劑盒。
在精神分裂癥中如何去證實由遺傳決定的生物化學(xué)方面的變化呢？如先天性氨基酸代謝和糖代謝異常那樣，在體內(nèi)當(dāng)酶發(fā)生異常時，通過血液和尿液即可很容易地得到證實。根據(jù)血液中的氨基酸及其代謝產(chǎn)物的水平便可得知哪種酶發(fā)生異常，而且大多通過紅細(xì)胞、皮膚的組織培養(yǎng)或者通過尸體解剖來驗證酶的異常。極大多數(shù)都是研究有關(guān)精神分裂癥患者的體液，但是體液中究竟發(fā)生了什么異常直到現(xiàn)在還不清楚。盡管偶爾有報告說在精神分裂癥患者的血或尿中發(fā)現(xiàn)了特異性物質(zhì)，但是經(jīng)過重復(fù)實驗之后，其結(jié)果均被否定。
另一方面，過去一直將表皮生長因子作為與癌或良性腫瘤生長有關(guān)的惡性因子來研究。但是，在精神分裂癥中與精神疾患有關(guān)的表皮生長因子的比例不清楚。本發(fā)明首次弄清了血清中表皮生長因子的濃度和精神分裂癥之間的關(guān)系。
本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了刻苦鉆研，從而完成了本發(fā)明。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在慢性和急性精神分裂癥患者的血中其表皮生長因子的水平與健康人相比表現(xiàn)為有意義的降低，并且慢性精神分裂癥患者死亡后，在解剖大腦時發(fā)現(xiàn)表皮生長因子的含量也表現(xiàn)為有意義的減少。
以下，是針對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明，這些最佳方式的詳細(xì)說明以及實施例并不表示是限定或限制本發(fā)明的有效范圍。
圖2是以大鼠為例，在對照組和氟哌啶醇給藥組之間，進(jìn)行了血清表皮生長因子水平的比較。
圖3是以人為例，在志愿者對照組和慢性精神分裂癥組之間，進(jìn)行了血清表皮生長因子水平分布的對數(shù)比較。
圖4是以人為例，在志愿者對照組和未給藥的慢性精神分裂癥組之間，進(jìn)行了血清表皮生長因子水平的比較。
詳細(xì)地說，本發(fā)明用于診斷精神分裂癥藥物試劑盒的特征是，包括固相、固相中的抗表皮生長因子(Epidermal Growth Factor)抗體和標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體。關(guān)于本發(fā)明中的抗表皮生長因子抗體采用酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記等。這里的酶標(biāo)記包括過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和6-磷酸葡糖脫氫酶等。本發(fā)明的診斷藥物試劑盒，根據(jù)需要也可包含用于檢測上述標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體的試劑。
本發(fā)明診斷精神分裂癥的藥物試劑盒的又一特征是，包括固相、位于固相中的抗表皮生長因子(Epidermal Growth Factor)抗體、生物素修飾的抗表皮生長因子抗體以及與生物素反應(yīng)的標(biāo)記的抗生物素蛋白。本發(fā)明的診斷精神分裂癥的藥物試劑盒的再一個特征是，包括固相、位于固相中的抗表皮生長因子(Epidermal Growth Factor)抗體、2，4-二硝基苯酚修飾的抗表皮生長因子抗體以及與2，4-二硝基苯酚抗體反應(yīng)的標(biāo)記的抗2，4-二硝基苯酚抗體。本發(fā)明的診斷藥物試劑盒，根據(jù)需要也可包含用于檢測上述標(biāo)記的抗生物素蛋白或標(biāo)記的2，4-二硝基苯酚抗體的試劑。如上所述，本發(fā)明的精神分裂癥的測定試劑盒，其特征是，通過抗表皮生長因子抗體，測定患者血清中的表皮生長因子的濃度。本發(fā)明的精神分裂癥的測定試劑盒對急性或慢性精神分裂癥的診斷是有效的。
本說明書中的術(shù)語含義及定義如下。
所說“抗表皮生長因子抗體”是指，將表皮生長因子(英文名稱EpidermalGrowth Factor，以下簡稱EGF)作為抗原制備得到的抗體。該抗體與表皮生長因子具有結(jié)合能力，而抗體包含多克隆抗體、單克隆抗體。優(yōu)選與表皮生長因子特異性結(jié)合的多克隆抗體、單克隆抗體等。
采用過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、6-磷酸葡糖脫氫酶等酶標(biāo)記、飛燕草屬等的熒光標(biāo)記或用放射性同位素標(biāo)記，可以使抗表皮生長因子抗體定量化，將這樣的抗體稱其為「標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體」。采用酶標(biāo)記時，該酶在合適的底物存在下進(jìn)行反應(yīng)時，將酶反應(yīng)生成物作為標(biāo)記物，可檢測出與已經(jīng)參與結(jié)合的抗表皮生長因子抗體。另外，應(yīng)用熒光標(biāo)記和放射性同位素標(biāo)記時，將熒光和放射活性作為標(biāo)記物時，也可檢測出與已經(jīng)參與結(jié)合的抗表皮生長因子抗體。
在「標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體」中進(jìn)一步包含通過生物素、2，4-二硝基苯酚等標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體。生物素與抗生物素蛋白特異地結(jié)合，而2，4-二硝基苯酚與抗2，4-二硝基苯酚抗體特異地結(jié)合。進(jìn)而，把上述標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體可通過過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、6-磷酸葡糖脫氫酶等酶標(biāo)記的抗生物素蛋白和2，4-二硝基苯酚抗體進(jìn)行定量測定。
所說「精神分裂癥」是指，「主要發(fā)生在青年期的一種內(nèi)因性精神疾病，其典型的癥狀表現(xiàn)在知覺、思維、自我意識、情感、欲望行為等多方面的障礙，多數(shù)是慢性經(jīng)過導(dǎo)致人格喪失，其中一部分精神萎靡導(dǎo)致重癥疾患」。
作為具體的測定血清中EGF量的方法，由以下幾個步驟構(gòu)成，例如，(1)在聚苯乙烯、尼龍、玻璃、硅橡膠、Sepharose等固相中固定抗EGF抗體；(2)在固相中加入被診斷患者的血清或者使之接觸；(3)固相洗滌；(4)加入標(biāo)記的抗EGF抗體或使之接觸；(5)通過該標(biāo)記測定EGF的量。
作為更進(jìn)一步具體的測定血清中EGF量的方法，由以下幾個步驟構(gòu)成，例如，(1)在聚苯乙烯、尼龍、玻璃、硅橡膠、Sepharose等固相中固定抗EGF抗體；(2)在固相中加入被診斷患者的血清或者使之接觸；(3)固相洗滌；(4)加入生物素修飾的抗表皮生長因子抗體或使之接觸；(5)加入標(biāo)記的抗生物素蛋白或使之接觸；(6)通過該標(biāo)記測定EGF的量。
作為更進(jìn)一步具體的測定血清中EGF量的方法，由以下幾個步驟構(gòu)成，例如，(1)在聚苯乙烯、尼龍、玻璃、硅橡膠、Sepharose等固相中固定抗EGF抗體；(2)在固相中加入被診斷患者的血清或者使之接觸；(3)固相洗滌；
(4)加入2，4-二硝基苯酚修飾的抗表皮生長因子抗體或使之接觸；(5)加入標(biāo)記的抗2，4-二硝基苯酚抗體或使之接觸；(6)通過該標(biāo)記測定EGF的量。
作為固相的形狀可舉例為小球狀、孔狀、實驗管狀等。
用作抗原或符合ELISA標(biāo)準(zhǔn)的表皮生長因子可在市場上購入、或者用以下方法制備。
基于基因工程學(xué)的方法，將編碼表皮生長因子的基因重組到合適的載體上，在合適的宿主中導(dǎo)入該重組體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，可從該轉(zhuǎn)導(dǎo)體的細(xì)胞中或培養(yǎng)物上清液中得到重組的EGF(例如Biotechnol Appl Biochem 2000Jun；31(Pt3)245-248)，本方法適合生產(chǎn)大量的均勻的EGF。雖然對上述的宿主細(xì)胞無特別的限定，但可依據(jù)現(xiàn)有的基因工程學(xué)方法應(yīng)用各種宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、植物或動物細(xì)胞。
抗表皮生長因子(EGF)抗體的制備可通過EGF本身或其部分肽作為抗原，對兔、雞、火雞等進(jìn)行免疫。以火雞為例子，將純化的EGF同完全福氏佐劑混合，皮下注射給藥。每月進(jìn)行一次，重復(fù)免疫過程，當(dāng)免疫滴度達(dá)到合適的時候，收集動物的血清。
標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體可通過生物素標(biāo)記的試劑(NHS-LC-Biotin，Pirece公司)和/或如帶有偶聯(lián)劑的過氧化物酶(Maleimideactivated HRP，Pirce公司)與抗EGF抗體反應(yīng)制得。
另外，應(yīng)用本發(fā)明的測定試劑盒，可診斷精神分裂癥。也就是說，從人體中采集血液用于制備血清，利用各種方法對血清中EGF的量進(jìn)行定量測定，通過判斷EGF的量是否在正常對照EGF量的范圍之內(nèi)，由此可診斷精神分裂癥。如后述實施例所示，患有精神分裂癥患者的血清中EGF量較對照組表現(xiàn)為有意義的降低。因此，作為診斷的過程是，從采集的人體血液中測定血清EGF量，當(dāng)血清中EGF量的平均值為正常對照組EGF量的1/2或1/2以下時，將其診斷為精神分裂癥，或者當(dāng)EGF量的平均值為精神分裂癥組EGF量的2倍或2倍以上時，將其診斷為非精神分裂癥，以上所述的精神分裂癥的診斷方法屬于本發(fā)明的范疇。根據(jù)后述的實施例，精神分裂癥患者血清中的EGF量，優(yōu)選不超過200pg/ml。其具體特征是，首先采集人的血液，然后具備一種位于在固相上的抗表皮生長因子(Epidermal GrowthFactor)抗體的反應(yīng)器以及標(biāo)記的抗表皮生長因子(Epidermal Growth Factor)抗體，應(yīng)用本發(fā)明的診斷試劑盒來測定血清中的EGF量，作為診斷的過程包括，當(dāng)血清中的EGF量的平均值為對照組EGF量的1/2或1/2以下時，將其診斷為精神分裂癥，或者當(dāng)EGF量的平均值為精神分裂癥組的2倍或2倍以上時，將其診斷為非精神分裂癥，以上所述的精神分裂癥的診斷方法屬于本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明的測定試劑盒，不僅對人類，就連精神分裂癥的動物模型血清中EGF的量也可通過試劑盒進(jìn)行測定。不僅人類，在動物中通過本發(fā)明的試劑盒測定血清中EGF的量，也可作為診斷精神分裂癥的方法，該方法也屬于本發(fā)明的范圍。而且通過所述精神分裂癥的動物模型，可進(jìn)行精神分裂癥治療藥物的開發(fā)和藥效的評價。也就是說，本發(fā)明的測定試劑盒由于在活體內(nèi)可進(jìn)行精神分裂癥治療藥物的開發(fā)和藥效的評價，進(jìn)而可成為用于精神分裂癥治療藥物的開發(fā)和藥效評價的強(qiáng)有力的工具。
選擇2組慢性精神分裂癥組(45名)和自愿者對照組(45名)，其中他們的性別和平均年齡相一致，用two site ELISA法測定人體新鮮血清中EGF的水平。在慢性精神分裂癥組中EGF水平的平均值是136pg/ml，S.D.是111，在自愿者對照組中EGF水平的平均值是392pg/ml，S.D.是343。當(dāng)比較兩組間血清EGF水平時發(fā)現(xiàn)慢性精神分裂癥組表現(xiàn)為有意義的降低(p＜0.001)(

圖1)。在圖1中，左側(cè)表示對照組血清EGF的水平，右側(cè)表示精神分裂癥組血清EGF的水平。為了找出藥物對血清EGF水平的影響，制作了給藥2周氟哌啶醇(0.5mg/kg)的大鼠。然后分別采集給藥大鼠和對照大鼠的血液，使用與人血清相同的two site ELISA法測定血清中EGF水平。在這兩組間沒有觀察到有意義差(p＞0.05)(圖2)。在圖2中，左側(cè)表示對照組血清EGF水平，右側(cè)表示精神分裂癥組血清EGF水平。從圖2的結(jié)果可以推斷，慢性精神分裂癥組EGF水平的低下并沒有受慢性藥物的影響。
統(tǒng)計學(xué)檢測三組的EGF值的分布，無論哪一組都找不出規(guī)律性，進(jìn)而不能檢測個別EGF值的異常性。這些組EGF的對數(shù)值(log值)在表中顯示了有規(guī)律的分布。將其圖表化即成圖3。對照組EGF平均對數(shù)值是2.43，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41。從這個分布中假設(shè)下限異常值不超過5％，則EGF水平為2.43-(0.41×1.9)＝1.64(44pg/ml)，那么慢性精神分裂癥患者(45名)中有5名被認(rèn)為「不在正常值的范圍內(nèi)」。還有，精神分裂癥組EGF平均對數(shù)值是2.01，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.275。從這個分布中假設(shè)上限異常值超過5％，則EGF水平為2.01+(0.275×1.9)＝2.53(339pg/ml)，那么對照組(45名)中有21名被認(rèn)為「不在有病值范圍內(nèi)」。還有其他的幾個人為假陽性，無法進(jìn)行判斷。
圖1表示服藥過程中的患者，為了論證服藥對EGF水平的影響，發(fā)明人分別對自愿者對照組和未給藥的慢性精神分裂癥患者組(未投藥患者組)進(jìn)行血清EGF含量的測定。圖4中，在14名自愿者對照(○)和未投藥患者(▲)中，表示采用上述同樣方法所測定的EGF含量的結(jié)果。圖4的縱軸表示，當(dāng)將自愿者對照組血清EGF含量的平均值設(shè)定為100時，圖中所表示的自愿者對照組和未投藥患者組中每個個體血清中的EGF含量。在這兩組間進(jìn)行血清EGF含量比較時，在未投藥慢性精神分裂癥組中觀察到血清中EGF的含量為有意義的降低(p＜0.001)，其結(jié)果與圖1相同。因此，可以證實慢性精神分裂癥組其血清中EGF含量低下，并不是由于服藥所致。
本發(fā)明提供一種診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，該試劑盒的特征是，通過抗表皮生長因子抗體測定血清中表皮生長因子的水平。
權(quán)利要求
1.一種診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，其特征在于，它包含固相、固定在該固相上的抗表皮生長因子抗體以及標(biāo)記的抗表皮生長因子抗體。
2.權(quán)利要求1所述診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，其中所述標(biāo)記是，酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記。
3.權(quán)利要求2所述診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，其中所述酶標(biāo)記，選自過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶及6-磷酸葡糖脫氫酶。
4.一種診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，其特征在于，它包含固相、固定在該固相上的抗表皮生長因子抗體、生物素修飾的抗表皮生長因子抗體、以及與該生物素反應(yīng)的帶有標(biāo)記的抗生物素蛋白。
5.一種診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，其特征在于，它包含固相、固定在該固相上的抗表皮生長因子抗體、2，4-二硝基苯酚修飾的抗表皮生長因子抗體、以及與該2，4-二硝基苯酚反應(yīng)的帶有標(biāo)記的抗2，4-二硝基苯酚抗體。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，其特征在于，用所述抗表皮生長因子抗體測定血清中表皮生長因子的濃度。
7.權(quán)利要求1-6中任一項所述診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，其中所述精神分裂癥包括急性精神分裂癥或慢性精神分裂癥。
8.一種用于診斷受檢者是否患有精神分裂癥的診斷方法，該方法包括以下3個步驟(1)在所述受檢者及正常對照組中采血并從每個個體的血液中得到各自的血清；(2)用所述抗表皮生長因子抗體測定每個個體血清的表皮生長因子濃度；以及，(3)在所述受檢者中表皮生長因子的濃度為所述正常對照組中表皮生長因子濃度的平均值的1/2或小于1/2時，則將該受檢者診斷為精神分裂癥。
9.一種用于診斷受檢者是否患有精神分裂癥的診斷方法，該方法包括以下3個步驟(1)在所述受檢者及精神分裂癥組中采血并從每個個體的血液中得到各自的血清；(2)用所述抗表皮生長因子抗體測定每個個體血清的表皮生長因子濃度；以及，(3)在所述受檢者中表皮生長因子的濃度為所述精神分裂癥組中表皮生長因子濃度的平均值的2倍或大于2倍時，則將所述受檢者診斷為未患精神分裂癥。
10.權(quán)利要求8或9所述精神分裂癥的診斷方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述診斷精神分裂癥的藥物試劑盒測定所述血清中表皮生長因子的濃度。
11.權(quán)利要求8或9所述精神分裂癥的診斷方法，其中所述精神分裂癥包括急性精神分裂癥或慢性精神分裂癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種診斷精神分裂癥的藥物試劑盒，該試劑盒是通過抗表皮生長因子抗體來測定血清中表皮生長因子水平的。本發(fā)明的診斷藥物試劑盒有益于客觀地診斷精神分裂癥。
文檔編號G01N33/68GK1394282SQ01803333
公開日2003年1月29日 申請日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月31日
發(fā)明者那波宏之, 二村隆史, 染矢俊幸, 淺間弘惠 申請人:新澙大學(xué)校長代表的日本國