專利名稱：乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及基因芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體地是涉及乙肝病毒突變位點(diǎn)的寡核苷酸檢測(cè)芯片，利用寡核苷酸芯片的固相PCR來(lái)檢測(cè)乙肝病毒突變位點(diǎn)。
基因芯片技術(shù)是在二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新興的生物技術(shù)，它是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和邵氏(Southern)雜交的集成。它通過(guò)微電子技術(shù)和微加工技術(shù)將大量特定序列的DNA有序地固定在載體表面，形成儲(chǔ)存有大量信息的DNA陣列。該陣列與標(biāo)記的探針雜交后，在短時(shí)間內(nèi)快速、準(zhǔn)確地獲取大量信息。具有高通量、縮微化及平行分析的特點(diǎn)?；蛐酒闹苽渲饕袃煞N方式，固相合成和合成后點(diǎn)樣。埃菲麥瑞克斯(Affymetrix)公司利用固相光化學(xué)合成法已開(kāi)發(fā)出一系列寡核苷酸芯片，每平方厘米上探針的數(shù)量可達(dá)244000個(gè)。但該方法合成成本高，不適合較長(zhǎng)的寡核苷酸。與之相比，合成后點(diǎn)樣法是將合成的寡核苷酸或是其它DNA分子通過(guò)點(diǎn)樣儀點(diǎn)到基片上。該方法靈活多樣，可以根據(jù)需要靈活設(shè)計(jì)探針的排列，尤其適合低密度的臨床檢測(cè)芯片。

發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片。
本實(shí)用新型的乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，包括長(zhǎng)方形或正方形玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層，所述點(diǎn)涂層為圓形涂層，在玻璃基片上陣列式均勻分布的，含有包括乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個(gè)突變位點(diǎn)和其相對(duì)應(yīng)的野生位點(diǎn)的72條寡核苷酸探針。
上述玻璃基片表面有修飾層，修飾層是3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化層或者經(jīng)三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾、丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的層面。
上述寡核苷酸芯片上的所有探針通過(guò)5′末端氨基己烷連接在上表面修飾后的玻璃載片上。
上述寡核苷酸探針?biāo)陉嚵信c對(duì)照的點(diǎn)涂層的大小可以根據(jù)點(diǎn)的大小，點(diǎn)間距的變化而變化；陣列的排列和分布數(shù)量可以根據(jù)待分析樣品的數(shù)目而變化。
上述寡核苷酸探針排列如附

圖1所示，探針點(diǎn)直徑為100μm，點(diǎn)間距為300μm，寡核苷酸探針?biāo)陉嚵信c相應(yīng)的點(diǎn)涂層大小為2.2mm×2.5mm。
上述的72條寡核苷酸探針包含的12個(gè)突變位點(diǎn)是，乙肝表面抗原區(qū)已知的5個(gè)突變位點(diǎn)546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原區(qū)7個(gè)已知的突變位點(diǎn)1896G-A、1762A-T與1764G-A聯(lián)合突變、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
上述的72條寡核苷酸探針，每一個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)包括6條探針，突變位點(diǎn)和野生位點(diǎn)的正、反義鏈探針共計(jì)4條。陽(yáng)性對(duì)照探針2條，分別位于正、反義鏈，它缺少3′末端的待檢測(cè)堿基。
上述的寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為14-19mer。
本實(shí)用新型總的構(gòu)思是集寡核苷酸芯片和固相PCR反應(yīng)于一體。在PCR反應(yīng)中，鑒于TaqDNA聚合酶在引物的3′末端存在錯(cuò)配時(shí)不能正確延伸的特點(diǎn)，將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在檢測(cè)探針的3′末端，然后將其5′末端固定在修飾層的玻璃基片上作為寡核苷酸芯片的探針、固相PCR反應(yīng)的固相引物，其3′末端游離。設(shè)計(jì)不同的液相引物，使其與固相引物配對(duì)。為確保擴(kuò)增的效率和準(zhǔn)確性，所擴(kuò)增的PCR區(qū)域不超過(guò)150bp，熒光標(biāo)記采用Cy3-dCTP。固相PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)采用熒光掃描或是熒光顯微鏡觀察。
本實(shí)用新型中，乙肝每一個(gè)突變位點(diǎn)在DNA的正、反義鏈上分別設(shè)計(jì)有相應(yīng)的檢測(cè)探針，同時(shí)還有與檢測(cè)探針相對(duì)應(yīng)，僅缺少3′末端待檢測(cè)堿基在內(nèi)的陽(yáng)性對(duì)照探針。所以，每一突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)有6條寡核苷酸探針，陽(yáng)性對(duì)照探針2條、突變檢測(cè)探針2條、野生檢測(cè)探針2條，均分別設(shè)計(jì)在DNA的正、反義鏈上。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照，如果某一位點(diǎn)的在正、反義鏈上的突變探針的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于野生探針，證明該位點(diǎn)為純合突變位點(diǎn)M/M；反之為純合野生位點(diǎn)W/W。如果同一位點(diǎn)在正、反義鏈上的探針信號(hào)強(qiáng)度相近，證明該位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)M/W。
表1乙肝前S區(qū)與C區(qū)突變位點(diǎn)檢測(cè)探針
Tm值是解鏈溫度，GC％是鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶的百分含量。
其中，每一位點(diǎn)所標(biāo)出的6條探針的排列次序按序號(hào)從低到高分別是正義鏈的陽(yáng)性對(duì)照探針、野生檢測(cè)探針和突變檢測(cè)探針，反義鏈的陽(yáng)性對(duì)照探針、野生檢測(cè)探針和突變檢測(cè)探針。同時(shí)，該表中還包含了探針的序列、長(zhǎng)度、Tm值和GC百分比等內(nèi)容。
本實(shí)用新型的優(yōu)良效果是，與傳統(tǒng)的突變檢測(cè)技術(shù)，如PCR和RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)相比，它可以同時(shí)高通量地檢測(cè)很多突變位點(diǎn)，平行分析多個(gè)樣品。與常規(guī)的基因芯片相比，它直接在芯片上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)束后即可直接通過(guò)掃描檢測(cè)結(jié)果而不必要經(jīng)過(guò)雜交，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間。本實(shí)用新型利用寡核苷酸芯片的固相PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)，可獲得與突變位點(diǎn)相關(guān)的臨床信息，指導(dǎo)臨床用藥。
其中，1為玻璃基片，2為寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層，3為修飾層。圓圈內(nèi)的數(shù)字與表1所列出的寡核苷酸探針序號(hào)相對(duì)應(yīng)。
寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層2陣列共計(jì)8行9列，探針點(diǎn)直徑為100μm，點(diǎn)間距為300μm，總面積為2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分別代表乙肝S區(qū)待檢測(cè)位點(diǎn)546、551、552、585、587；前C區(qū)待檢測(cè)位點(diǎn)1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12組72條寡核苷酸檢測(cè)探針。每一組的6條探針?lè)肿笥覂膳排帕?，左邊的一排從上到下分別是該位點(diǎn)正義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照、野生探針和突變探針；右邊的一排從上到下分別是該位點(diǎn)反義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照、野生探針和突變探針。點(diǎn)樣后的陣列經(jīng)水合后直接用于固相PCR擴(kuò)增。
固相PCR在寡核苷酸芯片上進(jìn)行，寡核苷酸探針同時(shí)是固相PCR擴(kuò)增的固相引物，三對(duì)液相引物包括了所有待檢測(cè)突變位點(diǎn)在內(nèi)的區(qū)域，且保證最長(zhǎng)的擴(kuò)增片段不超過(guò)150bp。在固相PCR擴(kuò)增過(guò)程中采用Cy-3-dCTP熒光摻入標(biāo)記。寡核苷酸芯片的固相PCR產(chǎn)物經(jīng)激光共聚焦掃描儀掃描后分析各突變位點(diǎn)。
實(shí)施例2.如實(shí)施例1所述的乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，所不同的是玻璃基片1是正方形薄片，是經(jīng)過(guò)三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾、丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片，3是修飾層。
權(quán)利要求1.乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，包括長(zhǎng)方形或正方形玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層，其特征在于點(diǎn)涂層為圓形，所述點(diǎn)涂層是在玻璃基片上陣列式均勻分布的，含有包括乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個(gè)突變位點(diǎn)和其相對(duì)應(yīng)的野生位點(diǎn)的72條寡核苷酸探針。
2.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，其特征在于，所述玻璃基片上表面有修飾層，修飾層是3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化層或者經(jīng)三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾、丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的層面。
3.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，其特征在于，所述寡核苷酸芯片上的所有探針通過(guò)5′末端氨基己烷連接在修飾后的玻片上。
4.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針?biāo)陉嚵信c對(duì)照的點(diǎn)涂層的大小是探針點(diǎn)直徑為100μm，點(diǎn)間距為300μm時(shí)，肽核酸探針?biāo)陉嚵信c相應(yīng)的點(diǎn)涂層大小為2.2mm×2.5mm。
5.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為14-19mer。
專利摘要乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)寡核苷酸檢測(cè)芯片，屬于基因芯片技術(shù)領(lǐng)域。包括長(zhǎng)方形或正方形玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層，點(diǎn)涂層是在玻璃基片上陣列式均勻分布的，含有包括乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個(gè)突變位點(diǎn)和其相對(duì)應(yīng)的野生位點(diǎn)的72條寡核苷酸探針；玻璃基片是硅烷化玻璃載片，或是經(jīng)過(guò)三甲氧基丙基－乙烯亞胺修飾、丁二酸－N－羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片；寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為15－19mer。本發(fā)明用于乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)的檢測(cè)，集寡核苷酸芯片和固相PCR于一體，具有快速、高效、準(zhǔn)確、平行診斷的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/574GK2574056SQ0227006
公開(kāi)日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2002年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者魯艷芹, 韓金祥 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心