專利名稱：一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體地說是涉及一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法。
ELISA定量檢測抗原濃度的方法可分為夾心法和競爭法。雙抗體夾心法的原理為通過包被特異抗體-抗原(檢樣)-酶標記特異抗體的模式檢測抗原。競爭法是通過酶標記的抗原和抗原(檢樣)共同競爭包被抗體，或包被抗原和抗原(檢樣)共同競爭酶標記的抗體來檢測抗原。放射免疫測定法和ELISA測定原理類似，只是標記物不同。由于放射免疫測定法需要用同位素標記，已有逐漸被ELISA取代的趨勢。
免疫層析是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它通常以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應。層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測線)，通過酶反應、或直接利用可目測的標記物(如膠體金)所看到的直觀的實驗現(xiàn)象(如顯色)而獲得測定結果。而游離標記物(即未與待測物結合的標記物)則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。免疫層析技術常見的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金。
免疫層析一般用于抗原的定性檢測，也可用于定量檢測，主要通過以下途徑來實現(xiàn)①樣本中的抗原和層析膜上的抗體/示蹤粒子標記的抗體形成雙抗體夾心的檢測模式。例如市面上大量使用的早早孕膠體金試紙。
②樣本中的抗原/層析膜上的抗原共同競爭示蹤粒子標記的限量抗體，通過檢測條帶出現(xiàn)與否判斷結果。例如，我們先前公開的專利“一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法及試紙的制備”(申請?zhí)枺?2131321.0)。
③樣本中的抗原/示蹤粒子標記的抗原共同競爭層析膜上的限量抗體，通過檢測條帶出現(xiàn)與否判斷結果。例如，公開的實用新型專利“鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條(II)”(申請?zhí)枺?2228104.5)。
④樣本中的抗原/示蹤粒子標記的抗原共同競爭層析膜上的限量抗體，通過檢測條帶出現(xiàn)的條數(shù)判斷結果。例如，公開的專利“半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產(chǎn)和使用方法”(申請?zhí)枺?2139704.X)。
ELISA定量檢測抗原濃度一般用于批量檢測，免疫層析法一般用于單個樣本檢測。為了方便檢測單個樣本，許多生產(chǎn)ELISA的公司推出了雙孔ELISA法，一個孔加入樣本，另一個孔加入標準品，根據(jù)顯色深淺來判斷結果。和經(jīng)典ELISA一樣，雙孔ELISA法需要加樣本(標準品)，加酶標記物，洗滌，顯色和終止等數(shù)個步驟，檢測時間至少30分鐘以上。
上述4種免疫層析檢測模式有一個共同的特點，就是用于定量時沒有標準品作參照，必需通過檢測體系中加入抗原/抗體的量或選擇嚴格的檢測材料，通過控制檢測靈敏度的方法來定量。由此產(chǎn)生的缺點為生產(chǎn)工藝復雜化，或定量的準確性隨著保存時間的延長而發(fā)生變化。而雙孔ELISA操作復雜，檢測步驟多，需要的試劑多，不能常溫保存。因此，迫切需要建立一種簡單、快速、準確的適用于測定多個樣品的檢測抗原濃度的方法。
本發(fā)明的目的通過以下的方案來實現(xiàn)一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法，包括按以下順序進行的步驟(1)單元試紙的制作，其中層析膜上的檢測線為1-8條；優(yōu)選為2-5條。
(2)參比免疫層析試紙的制作，其方法是把單元試紙條安裝在底卡上，2-10張成排即成為參比免疫層析試紙。
(3)檢測流程在參比免疫層析試紙上的單元試紙條上分別加入標準抗原和樣本，加入標準抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例。根據(jù)檢測線出現(xiàn)時間，或一定時間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結果。
單元試紙的制作包括以下步驟
(1)層析膜檢測線的制備，用以下的模式1或模式2制備檢測線①模式1用能與待測抗原特異性結合的抗體在層析膜上線狀點樣作為檢測線。將硝酸纖維素膜(NC膜)按10-35mm寬的尺寸剪裁。抗體溶液用緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測線之間的距離為2-12mm。
②模式2用全抗原或人工抗原(半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物)在層析膜上線狀點樣作為檢測線。將NC膜按10-35mm寬的尺寸剪裁。全抗原或人工抗原溶液用緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測線之間的距離為2-12mm。
根據(jù)層析的原理，層析的距離離加樣孔越遠，層析的速度越慢，分辨率越高。本發(fā)明利用了層析的原理，采用多條層析膜檢測線，以提高分辨率。本發(fā)明采用的層析膜檢測線為1-8條，優(yōu)選2-5條。
(2)示蹤粒子結合物墊的制備，用以下的模式3或模式4制備示蹤粒子結合物墊①模式3用示蹤粒子標記全抗原或人工抗原(半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物)，把標記好的示蹤粒子-抗原結合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結合物墊；②模式4用示蹤粒子標記能與待測抗原特異性結合的抗體，把標記好的示蹤粒子-抗體結合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結合物墊。
制備示蹤粒子結合物墊的示蹤粒子選自膠體金顆粒、膠體硒顆粒、乳膠顆粒，其制備和標記方法如下①膠體金顆粒膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測定為10-80nm；膠體金標記抗原/抗體取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH(可選擇待標記抗原/抗體的等電點，也可略為偏堿)，攪拌下將膠體金溶膠和抗原/抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使其終濃度為0.05％。將粗制品在4,000-20,000×g下離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
②膠體硒顆粒
膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶內(nèi)加入去離子水550ml和聚丙烯酸5-20g，通氮室溫攪拌并加入水合肼40-100ml，繼續(xù)攪拌10-30分鐘。將亞硒酸5-15g溶解于280ml水中，室溫攪拌下滴入反應混合液得到50-250nm紅色硒溶膠。
膠體硒標記抗原/抗體抗原/抗體用20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH可選擇待標記抗原/抗體的等電點，也可略為偏堿)配成1-8mg/ml濃度溶液，取25μl加入25ml硒溶膠中，室溫攪拌10分鐘后加1ml 1％的PEG8000，混勻，于4℃以3,000-10,000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。
③乳膠顆粒彩色乳膠顆粒購自Bangs Laboratories公司。
乳膠顆粒標記抗原/抗體用磷酸鹽緩沖液將乳膠稀釋到1％濃度，攪拌下加入一定量的抗原/抗體溶液，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴保溫60分鐘，4℃放置4-5小時。15,000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
(3)單元試紙的組裝，用以下的模式5或模式6組裝單元試紙，其中的襯墊為涂布粘膠的塑料板或紙板①模式5在襯墊上先加上用模式1制備檢測線的層析膜、然后向下依次加上用模式3制備的示蹤粒子結合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊；②模式6在襯墊上先加上用模式2制備檢測線的層析膜、然后向下依次加上用模式4制備的示蹤粒子結合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊。
(4)單元試紙的剪切，試紙組裝完成后剪切成適當寬度，即為單元試紙條。
參比免疫層析試紙制作的方法如下把單元試紙條安裝在底卡上，2-10張成排即成為參比免疫層析試紙。底卡一般為塑料卡，它能使襯墊上的層析膜、示蹤粒子結合物墊、樣品墊和吸水墊緊密結合。根據(jù)本發(fā)明的參比免疫層析試紙適用于非批量、多個樣品測定的特征，選用2-10張單元試紙條為合適。
檢測流程是在參比免疫層析試紙的2-10張單元條試紙上分別加入標準抗原和樣本，根據(jù)檢測線出現(xiàn)時間，或一定時間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結果。加入標準抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例。檢測流程為以下的一種
(1)在參比免疫層析試紙的2-10張單元試紙條上分別加入標準抗原和樣本，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的時間比某標準單元試紙條出現(xiàn)的時間晚，則樣品內(nèi)抗原濃度大于某標準濃度。
(2)參比免疫層析試紙的2-10張單元試紙條上分別加入標準抗原和樣本，在相同時間內(nèi)，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的顏色比某標準單元試紙條出現(xiàn)的顏色淺，則樣本內(nèi)抗原濃度大于某標準濃度。
加入標準抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)的比例，以及標準抗原的濃度可以根據(jù)待測樣本的特征而定。
本發(fā)明同以往定量檢測抗原的方法，特別是ELISA相比有如下優(yōu)點①操作簡便，只需一個操作步驟；②檢測速度快，5-20分鐘即可得到結果；③可單份測定也可數(shù)份同時測定、室溫保存、保存時間長，并可隨身攜帶。
本發(fā)明同以往定量檢測抗原的方法，特別是免疫層析法相比有如下優(yōu)點①用標準單元試紙條作參照，不需要額外的質(zhì)控線抗體(抗示蹤粒子標記物抗體)；②定量的準確性隨著保存時間的增長不會發(fā)生變化；③檢測方式靈活，可根據(jù)檢測線出現(xiàn)時間或一定時間檢測線的顏色差異來判斷結果；④可加入一個標準，也可同時作幾個標準；⑤可檢測一個樣本，也可同時檢測數(shù)個樣本。
本發(fā)明可應用于免疫學檢測的所有方面，但主要用于檢測正常生物樣本中不存在的抗原性物質(zhì)(如診斷傳染病的抗原，糧食、飲料或動物飼料中污染的真菌毒素，抗生素)；正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)(如HCG、甲胎蛋白、C-反應蛋白等)；以及違禁添加的物質(zhì)(如蔬菜、水果中的殘留農(nóng)藥，牛奶中的抗生素，肉類食品中的興奮劑類藥)。本發(fā)明的試紙條的使用單位主要為醫(yī)院、部隊、公檢法部門、運動員興奮劑檢測部門、防疫站等國家監(jiān)測部門等，個人也可使用。
參比免疫層析(模式5)試紙由兩條單獨并排的單元試紙條，即檢測單元試紙條1-1和參比單元試紙條1-2構成。單元試紙條由樣品墊3、示蹤粒子結合物墊4、層析膜5和吸水墊6構成。示蹤粒子結合物墊4上有示蹤粒子標記抗原8所形成的結合物10，層析膜5上有檢測線7，檢測線7上有抗體9。
圖2.是參比免疫層析(模式6)試紙的結構圖。
參比免疫層析(模式6)試紙由兩條單獨并排的單元試紙條，即檢測單元試紙條2-1和參比單元試紙條2-2構成。單元試紙條由樣品墊3、示蹤粒子結合物墊4、層析膜5和吸水墊6構成。示蹤粒子結合物墊4上有示蹤粒子標記抗體9所形成的結合物11，層析膜5上有檢測線7，檢測線7上有抗原8。
參照

圖1，在樣品墊3上滴加樣本或標準品后，樣本或標準品向吸水墊6端擴散，使示蹤粒子結合物墊4上的示蹤粒子結合物10進入樣本或標準品的液相，并與其一起向吸水墊6端擴散，在層析膜5上，樣本或標準品中的抗原與示蹤粒子結合物中的抗原競爭，阻止示蹤粒子結合物10和抗體9的反應。由于擴散速度較快，反應是動態(tài)且不完全的。在參比單元試紙條1-2的樣品墊3上加入標準品后，標準品抗原和示蹤粒子結合物10上的標記抗原比例是一定的，因此，標準品阻止示蹤粒子結合物10和抗體9的反應的速率一定，檢測線出現(xiàn)可見顏色所需的時間也就一定。在檢測單元試紙條1-1的樣品墊3上同時加入樣本，如果樣本中的抗原濃度大于標準，樣本抗原阻止示蹤粒子結合物10中的抗原和抗體9反應的速率增大，檢測線7上的抗體9富集示蹤粒子結合物10至可見顏色所需的時間也增加?；蛘?，在一定的時間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的抗原濃度小于標準，檢測線7上的抗體9富集示蹤粒子結合物10至可見顏色所需的時間減少?；蛘?，在一定的時間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據(jù)可見顏色出現(xiàn)的先后，或同一時間內(nèi)出現(xiàn)的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的抗原濃度大于或小于標準。
參照圖2，在樣品墊3上滴加樣本或標準品，樣本或標準品向吸水墊6端擴散，使示蹤粒子結合物墊4上的示蹤粒子結合物11進入樣本或標準品的液相，并與其一起向吸水墊6端擴散，在層析膜5上，樣本或標準品中的抗原與檢測線7上的抗原8競爭，阻止檢測線7上的抗原8和示蹤粒子結合物11的反應。由于擴散速度較快，反應是動態(tài)且不完全的。在參比單元試紙條2-2的樣品墊3上加入標準品后，標準品中的抗原阻止檢測線7中的抗原和示蹤粒子結合物11反應的速率是一定的，檢測線出現(xiàn)可見顏色所需的時間也就一定。在檢測單元試紙條2-1的樣品墊3上同時加入樣本，如果樣本中的抗原濃度大于標準，樣本抗原阻止檢測線7中的抗原和示蹤粒子結合物11中的抗體反應的速率增大，檢測線7上抗原8富集示蹤粒子結合物11至可見顏色所需的時間增加?；蛘?，在一定的時間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的抗原濃度小于標準，檢測線7上抗原8富集示蹤粒子結合物11至可見顏色所需的時間減少?；蛘撸谝欢ǖ臅r間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據(jù)可見顏色出現(xiàn)的先后，或同一時間內(nèi)出現(xiàn)的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的抗原濃度大于或小于標準。
本發(fā)明方法用于生物樣品中抗原濃度的定量檢測。
權利要求
1.一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法，包括按以下順序進行的步驟(1)單元試紙的制作(2)參比免疫層析試紙制作(3)檢測流程，其特征在于(1)單元試紙的制作中，層析膜上的檢測線為1-8條；(2)參比免疫層析試紙制作方法是把單元試紙條安裝在底卡上，數(shù)張成排即成為參比免疫層析試紙，單元紙條的數(shù)量為2-10張；(3)檢測流程是在參比免疫層析試紙條的單元試紙條上分別加入標準抗原和樣本，加入標準抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，根據(jù)檢測線出現(xiàn)的時間，或一定時間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結果。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗原濃度的檢測方法，其特征在于層析膜上的檢測線為2-5條。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗原濃度的檢測方法，其特征在于檢測流程為以下的一種(1)參比免疫層析試紙的單元試紙條上分別加入標準抗原和樣本，加入標準抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)檢測線條帶的時間比某標準單元試紙條出現(xiàn)的時間晚，則樣本內(nèi)抗原濃度大于某標準濃度；(2)參比免疫層析試紙的單元試紙條上分別加入標準抗原和樣本，加入標準抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，在相同時間內(nèi)，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)檢測線條帶的顏色比某標準單元試紙條出現(xiàn)的顏色淡，則樣本內(nèi)抗原濃度大于某標準濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法。該方法的步驟包括單元試紙的制作；參比免疫試紙制作；檢測流程。本發(fā)明的詳細方法見說明書。本發(fā)明用2張－10張單元試紙條并排制成參比免疫層析試紙。在免疫層析試紙的單元試紙條上分別加入標準抗原和樣本，加入標準抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，根據(jù)檢測線出現(xiàn)顏色的時間，或一定時間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結果。本發(fā)明的優(yōu)點是定量準確，可選用一個或數(shù)個標準品，也可同時檢測一個或數(shù)個樣本。本發(fā)明方法用于生物樣本中抗原濃度的定量檢測。
文檔編號G01N33/531GK1460858SQ03147860
公開日2003年12月10日 申請日期2003年6月27日 優(yōu)先權日2003年6月27日
發(fā)明者陳高明, 李林 申請人:江西中德生物工程有限公司