專利名稱：用于調(diào)節(jié)連接蛋白半通道的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)一般涉及用于調(diào)節(jié)連接蛋白半通道的組合物和方法。本申請(qǐng)還涉及用于檢測(cè)該類化合物的有用的篩選。
背景技術(shù)：
公認(rèn)間隙連接是有助于細(xì)胞與其周圍環(huán)境進(jìn)行聯(lián)系的重要的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。例如，認(rèn)為大多數(shù)間隙連接可以促進(jìn)小分子和離子在相互連接的細(xì)胞之間的通行。認(rèn)為該類活動(dòng)會(huì)對(duì)細(xì)胞生理學(xué)的許多方面產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。認(rèn)為毗鄰細(xì)胞的質(zhì)膜包括由幫助形成該間隙連接的被稱為“連接蛋白”的多聚體蛋白所形成的半通道，“連接子”。此外，半通道在小分子量化合物在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞周質(zhì)間隙或細(xì)胞外間隙間的交換中起著獨(dú)立的作用。一般可參見(jiàn)Bennett，M.等人(1991)Neuron 6305；Kumar，N.和Gilula，N.B.(1996)Cell 84381；和Quist，A.P等人(2000)J.CellBiol.1481063和其中所引用的參考資料。
特別地，已經(jīng)有許多間隙連接是具有濃密的疊集通道聚簇的細(xì)胞膜特定區(qū)域的報(bào)道。認(rèn)為該類間隙連接通道直接連接兩個(gè)毗鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)隔室。
公認(rèn)間隙連接通道由兩個(gè)毗鄰細(xì)胞各自所提供的兩個(gè)半通道(連接子)所組成。已經(jīng)公開(kāi)了各連接子(半通道)包括六個(gè)被稱為連接蛋白的蛋白。認(rèn)為各連接蛋白共享四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)細(xì)胞外回路、和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)回路。認(rèn)為電脈沖的傳導(dǎo)是通過(guò)間隙連接而發(fā)生的，從而有助于正常的心臟傳導(dǎo)和節(jié)律。一般參見(jiàn)P.A.Guerrero，R.B.等人，JClin Invest 1997，99 1991；D.L.Lerner，K.A.等人，Circulation1999，99 1508；S.Kirchhoff，E.等人，Curr Biol 1998，8 295。
認(rèn)為大多數(shù)心臟連接蛋白的分布在該器官的各處變化很大。已經(jīng)公開(kāi)了Cx43同種型是主要的心室類型，而Cx40是心房和傳導(dǎo)系統(tǒng)中最豐富的同種型。
有報(bào)道稱連接蛋白異常和心臟病之間有密切關(guān)系，見(jiàn)A.C.deCarvalho，等人，J Cardiovasc Electrophysiol 1994，5 686；R.R.Kaprielian，等人，Circulation 1998，97 651；N.S.Peters，等人，Circulation 1993，88 864；和J.E.Saffitz，R.B.等人，Cardiovasc Res1999，42 309。
已知在心律不齊中涉及間隙連接的異常表達(dá)、分布和調(diào)整。據(jù)報(bào)道，Larsen，B.等人在PCT/DK01/00127(WO01/62775)中所公開(kāi)的抗心律失常的肽可增加脊椎動(dòng)物組織中間隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)。
特別是對(duì)由連接蛋白(Cx)基因族所編碼的哺乳動(dòng)物間隙連接蛋白進(jìn)行了報(bào)道。見(jiàn)Bruzzone，R.等人(1996)Eur.J Biochem.2381。該Cx族包括Cx26、30、31、32、37、40、43、45、46和50。在無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了間隙連接通道，其中該形成蛋白的通道被稱為“innexins”。
已知除Cx26蛋白外，大多數(shù)連接蛋白都可被磷酸化。Cx43蛋白在組織中被廣泛表達(dá)。有報(bào)道稱Cx43蛋白的磷酸化作用可影響間隙連接細(xì)胞內(nèi)通訊(GJIC)。例如，已知通過(guò)磷酸化作用可以影響Cx43的周轉(zhuǎn)、運(yùn)輸、磷酸化和門(mén)控。見(jiàn)Darrow，B.J.，等人(1995).Circ Res76381。
例如，Saffitz及同事已經(jīng)用電導(dǎo)測(cè)量表明在局部缺血期間，在15分鐘內(nèi)，連接蛋白絲氨酸脫磷酸化作用增加。見(jiàn)圖1(表示具有一些已經(jīng)被確定的磷酸化作用部位的哺乳動(dòng)物Cx43跨膜蛋白)。
連接蛋白的磷酸化作用和溶解度已經(jīng)引起了研究者的興趣。特別是發(fā)現(xiàn)Cx43在大鼠乳腺肌上皮細(xì)胞中被磷酸化。見(jiàn)Wang，Y.，等人(1995).JBiol Chem 270，26581；和Yamanaka，I.，等人(1997).Eur J CellBiol 72166。
如上所述，認(rèn)為間隙連接通道是連接毗鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的專門(mén)的孔。半通道與細(xì)胞外環(huán)境相連通。已經(jīng)報(bào)道了心臟細(xì)胞的代謝抑制可以活化由連接蛋白半通道所構(gòu)成的流入通道。認(rèn)為代謝抑制可以打開(kāi)該半通道并增加鉀的損耗、誘導(dǎo)質(zhì)子，鈉和鈣的流入，從而損害心臟組織。見(jiàn)Kondo等人，J.MoI.Cell.Cardiol.321859-72，2000；Li等人，J.Mol.Cell.Cardiol.332145-55，2001)。
認(rèn)為急性心肌局部缺血過(guò)程中間隙連接處電的解偶聯(lián)有助于傳導(dǎo)異常和折返性心律不齊。局部缺血期間細(xì)胞內(nèi)Ca2+和H+水平增加和兩親性脂質(zhì)代謝物的積聚促進(jìn)了解偶聯(lián)。其它機(jī)理可能也起作用。例如，已經(jīng)報(bào)道了由急性局部缺血所誘發(fā)的解偶聯(lián)與連接蛋白43(Cx43)磷酸化作用的改變有關(guān)。已經(jīng)報(bào)道的結(jié)果與在急性局部缺血期間的心肌解偶聯(lián)和心律失常形成中起作用的快速可逆的Cx43脫磷酸化作用相一致。見(jiàn)Beardslee MA等人，Circ Res.2000；87656和其中所引用的參考資料。
半通道的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)引起了人們的興趣。例如，原子力顯微鏡檢查(AFM)、熒光染料攝取試驗(yàn)、和激光同焦點(diǎn)免疫熒光成像已經(jīng)表明半通道涉及細(xì)胞體積的細(xì)胞外鈣-依賴性調(diào)節(jié)。如所報(bào)道的那樣，細(xì)胞體積的改變?nèi)Q于連接蛋白43是否被表達(dá)。報(bào)道用間隙連接的阻滯劑(例如，油酰胺和β-甘草次酸)來(lái)防止這些改變或可以通過(guò)使細(xì)胞外的鈣恢復(fù)到正常水平來(lái)逆轉(zhuǎn)這些改變。已經(jīng)表明作為對(duì)其它等滲情況中細(xì)胞外生理學(xué)變化的響應(yīng)，非間隙連接的半通道對(duì)細(xì)胞體積進(jìn)行調(diào)節(jié)。見(jiàn)Quist，A.P.等人，同上。
已經(jīng)提出開(kāi)放半通道，尤其是在局部缺血或代謝應(yīng)激中開(kāi)放半通道可以導(dǎo)致細(xì)胞攝取Ca2+、質(zhì)子和兩親性脂質(zhì)代謝物在細(xì)胞中的積聚，從而造成細(xì)胞膨脹、細(xì)胞損害或編程性細(xì)胞死亡。見(jiàn)Beardslee等人，同上和Quist等人，同上。
已經(jīng)報(bào)道了Cx43在體外被Src蛋白在Tyr247(Y247)、Tyr265(Y265)以及可能的其它部位上被磷酸化。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，間隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)對(duì)由v-Src所介導(dǎo)的磷酸化作用所導(dǎo)致的破壞具有抵抗性。已知Cx43的Y247和Y265上的磷酸化是很重要的。見(jiàn)Lin R，等人(2001)J Cell Biol 154(4)815。還可參見(jiàn)圖1。
還可參見(jiàn)Larsen，B.D等人在于2002年2月22日提交的標(biāo)題為“細(xì)胞內(nèi)通訊促進(jìn)化合物的新醫(yī)學(xué)應(yīng)用”的PCT申請(qǐng)PCT/US02/05773(WO 02/077017)，其中公開(kāi)了各種GJIC調(diào)節(jié)化合物。
希望有可以調(diào)節(jié)半通道功能的化合物。優(yōu)選的化合物將幫助打開(kāi)或關(guān)閉該半通道。尤其希望有一些分子篩選來(lái)對(duì)該類化合物進(jìn)行鑒別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一般特征是涉及一些化合物以及用這些化合物來(lái)對(duì)半通道功能進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法。特別是可以調(diào)節(jié)半通道磷酸化作用的化合物。本發(fā)明另外的化合物可以調(diào)節(jié)半通道功能并且在一些情況中還可以影響間隙連接通訊(GJIC)例如，通過(guò)打開(kāi)或關(guān)閉間隙連接通道來(lái)對(duì)其進(jìn)行影響。還提供了用于檢測(cè)該類化合物和對(duì)該類化合物的特性進(jìn)行描述的有用的篩選。本發(fā)明具有許多有用的應(yīng)用，包括為由不適宜的半通道功能所調(diào)控的各種情況提供了用于進(jìn)行治療或預(yù)防的治療。
急需對(duì)可以調(diào)節(jié)(增加或降低)半通道功能的化合物進(jìn)行鑒別?！鞍胪ǖ拦δ堋敝傅氖谴蜷_(kāi)或關(guān)閉連接蛋白半通道從而增加或降低分子或離子通過(guò)該半通道進(jìn)行的流通。短語(yǔ)“間隙連接功能”指的是打開(kāi)或關(guān)閉間隙連接從而增加或降低分子或離子通過(guò)該間隙連接進(jìn)行的流通。本發(fā)明優(yōu)選的化合物可以調(diào)節(jié)半通道的磷酸化作用，并且一般還可以幫助打開(kāi)或關(guān)閉該半通道?？梢酝ㄟ^(guò)一種或多種這里所公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定來(lái)容易地檢測(cè)半通道功能和間隙連接功能并可以任選地對(duì)其進(jìn)行定量。
更特定的半通道調(diào)節(jié)化合物可以調(diào)節(jié)(增加或降低)所識(shí)別的連接蛋白的磷酸化作用。優(yōu)選的磷酸化或脫磷酸化的部位包括該連接蛋白上的一個(gè)或多個(gè)酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基。正如下面將要討論的那樣，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)這些殘基中一種或多種的磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)可以影響半通道功能，特別是可以通過(guò)打開(kāi)和關(guān)閉半通道而影響其功能。因此，如下所述的那樣，本發(fā)明的目的是提供適于對(duì)該連接蛋白的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的篩選以及對(duì)具有調(diào)節(jié)半通道功能能力的化合物進(jìn)行檢測(cè)和任選地對(duì)其特性進(jìn)行刻劃的方法。
例如，本發(fā)明的某些化合物能磷酸化該連接蛋白的至少一個(gè)酪氨酸殘基。在這種實(shí)施方案中，該連接蛋白的磷酸化作用將幫助關(guān)閉該半通道。其它適宜的半通道調(diào)節(jié)化合物可以降低該連接蛋白的至少一個(gè)絲氨酸殘基的磷酸化作用(脫磷酸)。在這種實(shí)例中，該絲氨酸的脫磷酸化作用將幫助打開(kāi)該半通道。本發(fā)明范圍內(nèi)還有一些其它化物將增加連接蛋白至少一個(gè)蘇氨酸殘基的磷酸化作用，其一般有助于該半通道的閉合。本發(fā)明另一些適宜的化合物可以促進(jìn)下面活動(dòng)中的至少一種增加或降低該連接蛋白絲氨酸的磷酸化作用、增加或降低其酪氨酸的磷酸化作用、和增加或降低其蘇氨酸的磷酸化作用。優(yōu)選地，一種或多種氨基酸的改變將有助于該半通道可檢測(cè)的開(kāi)放或關(guān)閉。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種用于調(diào)節(jié)半通道功能的方法，優(yōu)選地是通過(guò)關(guān)閉半通道來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括關(guān)閉細(xì)胞、組織或器官中的半通道，所說(shuō)的半通道優(yōu)選地是處于應(yīng)激中的半通道，該方法包括使處于應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞、組織或器官與治療有效量的至少一種下面式I或II所示的化合物進(jìn)行接觸。相對(duì)于適宜對(duì)照而言，本發(fā)明優(yōu)選的接觸足以在與應(yīng)激接觸前、接觸期間或接觸后關(guān)閉半通道。該類應(yīng)激包括一種或多種代謝抑制、缺氧、pH降低、或如下所述的細(xì)胞外鉀離子增加。
在一個(gè)更特定的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)所識(shí)別的連接蛋白的磷酸化作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所說(shuō)的所識(shí)別的連接蛋白優(yōu)選地是連接蛋白43(Cx43)。該方法一般將檢測(cè)并報(bào)告在其上的酪氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸殘基中的至少一種上Cx43磷酸化作用的任何增加或降低，優(yōu)選地檢測(cè)并報(bào)告酪氨酸和蘇氨酸中的至少一種中磷酸化作用的增加。在這種實(shí)施方案中，該方法還包括關(guān)閉該半通道，并且任選地，相對(duì)于適宜對(duì)照而言，打開(kāi)或關(guān)閉間隙連接通道。
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)半通道功能的其它方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)所識(shí)別的連接蛋白，優(yōu)選地為Cx43的磷酸化作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)以檢測(cè)其上的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基中的至少一種上Cx43磷酸化作用的任何增加或降低，優(yōu)選地對(duì)那些殘基如絲氨酸中一種或多種的磷酸化作用相對(duì)于對(duì)照而言的降低進(jìn)行檢測(cè)。在本發(fā)明的這種實(shí)例中，該方法包括打開(kāi)與應(yīng)激情況相接觸的細(xì)胞、組織或器官中的半通道，其包括將處于應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞、組織或器官與治療有效量的至少一種下式I或II所示的化合物進(jìn)行接觸。相對(duì)于適宜的對(duì)照而言，優(yōu)選的接觸足以打開(kāi)該半通道，并任選地打開(kāi)或關(guān)閉間隙連接通道。
需要對(duì)該類半通道調(diào)節(jié)化合物進(jìn)行檢測(cè)和更明確地定性的篩選。具有該類篩選將是對(duì)該新的半通道調(diào)節(jié)化合物進(jìn)行鑒別和定性的第一個(gè)重要步驟，例如通過(guò)將該候選化合物與對(duì)照進(jìn)行比較試驗(yàn)來(lái)探測(cè)其幫助關(guān)閉半通道的能力，例如其應(yīng)比對(duì)照化合物高至少5％。通過(guò)該類篩選所確定的包括下面式I或II所示的化合物在內(nèi)的化合物可被用于促進(jìn)細(xì)胞、組織和器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的治療，例如，其可以通過(guò)預(yù)防、降低細(xì)胞組分向細(xì)胞外環(huán)境的損失或保護(hù)細(xì)胞組分不損失到細(xì)胞外環(huán)境中來(lái)起作用。
因此，本發(fā)明還提供了用于對(duì)具有調(diào)節(jié)半通道功能能力的候選化合物進(jìn)行篩選的特定的體外方法。該方法一般包括將適宜的細(xì)胞、組織或器官與至少一種下面如式I或II所示的化合物進(jìn)行接觸。優(yōu)選地，該接觸是在用于對(duì)所識(shí)別的連接蛋白，優(yōu)選地是連接蛋白43(Cx43)的磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)并對(duì)Cx43磷酸化作用相對(duì)于適宜對(duì)照而言的改變進(jìn)行檢測(cè)的條件下進(jìn)行的。該磷酸化作用的改變還優(yōu)選地被看成是半通道調(diào)節(jié)化合物的標(biāo)識(shí)。任選地，根據(jù)這里所公開(kāi)的試驗(yàn)，通過(guò)篩選方法而發(fā)現(xiàn)的該類化合物可以打開(kāi)或關(guān)閉間隙連接通道。
在前述方法的各方法中，本發(fā)明優(yōu)選的磷酸化作用的改變幾乎全部發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)該連接蛋白的C-末端上或附近。Cx43更優(yōu)選的磷酸化和脫磷酸化作用部位如圖1所示。短語(yǔ)“連接蛋白的C-末端”指的是如圖1所示的跨越約氨基酸殘基240至281的區(qū)域。
本發(fā)明一種用于檢測(cè)連接蛋白磷酸化作用的特定的體外篩選測(cè)定涉及用來(lái)對(duì)半通道功能、間隙連接功能(或半通道功能和間隙連接功能)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的一個(gè)或多個(gè)步驟。該類測(cè)定一般包括下面步驟中的至少一個(gè)并優(yōu)選地包含下面的所有步驟1)將細(xì)胞、組織或器官如得自心臟或肌肉的那些物質(zhì)的群體進(jìn)行培養(yǎng)，2)對(duì)該細(xì)胞、組織或器官施加應(yīng)激，優(yōu)選地通過(guò)剝奪氧氣或代謝抑制來(lái)對(duì)其施加應(yīng)激，3)加入已知的或候選的半通道調(diào)節(jié)化合物如下面式I或II所示的那些化合物，4)檢測(cè)連接蛋白磷酸化作用(優(yōu)選地為Cx43)相對(duì)于適宜對(duì)照而言的改變；和5)任選地對(duì)該作為調(diào)節(jié)半通道功能并任選地調(diào)節(jié)間隙連接功能的化合物的標(biāo)識(shí)的改變進(jìn)行測(cè)量。
該測(cè)定可以有效地測(cè)量該半通道調(diào)節(jié)化合物增加或降低優(yōu)選的Cx43蛋白的絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸殘基中的至少一種的磷酸化作用的能力。這里所涉及的“標(biāo)準(zhǔn)的體外連接蛋白磷酸化作用測(cè)定”或相關(guān)短語(yǔ)指的是上面步驟1)至5)的方案。該測(cè)定可以用幾乎任何群體的原代細(xì)胞、次代細(xì)胞、或無(wú)限增殖化細(xì)胞如那些得自心臟或肌肉的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。
上述的標(biāo)準(zhǔn)體外測(cè)定通常是可變形的。例如，只要可以獲得所需的篩選結(jié)果，可以以任何順序來(lái)進(jìn)行步驟1)-5)。因此，在該測(cè)定的一個(gè)實(shí)施方案中，可以在步驟1)、步驟2)(或步驟1)和步驟2))加入候選化合物來(lái)代替僅在步驟2)后加入該候選化合物。
本發(fā)明提供了用于對(duì)候選化合物調(diào)節(jié)半通道功能的能力進(jìn)行篩選的其它方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使適宜的細(xì)胞、組織或器官與至少一種選自下面式I或II所示的化合物進(jìn)行接觸。一般在存在化合物的情況下對(duì)該細(xì)胞、組織或器官對(duì)可檢測(cè)指示劑進(jìn)行的任何攝取進(jìn)行監(jiān)測(cè)并且其是在與適宜的對(duì)照進(jìn)行比較的情況下進(jìn)行的。優(yōu)選的可檢測(cè)指示劑具有有助于通過(guò)開(kāi)放的半通道的分子大小。因此當(dāng)該半通道在測(cè)定中開(kāi)放時(shí)，該可檢測(cè)的指示劑進(jìn)入到細(xì)胞、組織或器官中。但是，當(dāng)半通道關(guān)閉時(shí)，阻止了可檢測(cè)的指示劑通過(guò)半通道進(jìn)行的流通。該接觸優(yōu)選地是在有益于檢測(cè)該可檢測(cè)的指示劑的攝取相對(duì)于適宜對(duì)照而言的任何改變的條件下進(jìn)行的。
正如例如在標(biāo)準(zhǔn)體外連接蛋白磷酸化作用測(cè)定中所檢測(cè)到的那樣，如果連接蛋白，優(yōu)選Cx43的C-末端區(qū)域中至少一個(gè)酪氨酸殘基被磷酸化，優(yōu)選地在至少247位或265位上的酪氨酸被磷酸化，更優(yōu)選地247位和265位上的酪氨酸都被磷酸化，則根據(jù)本發(fā)明半通道是“關(guān)閉”的?！瓣P(guān)閉”還意味著該連接蛋白C-末端區(qū)域中至少一個(gè)蘇氨酸殘基被磷酸化，其可以被單獨(dú)磷酸化，或除酪氨酸磷酸化作用之外也被磷酸化。如果該連接蛋白C-末端區(qū)域中至少一個(gè)絲氨酸殘基被脫磷酸化，則半通道是“開(kāi)放的”。此外，優(yōu)選的酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸殘基在圖1中被表示為激酶部位。
一種用于檢測(cè)可檢測(cè)的指示劑通過(guò)半通道進(jìn)行的流通的更特定的體外篩選測(cè)定包括一步或多步下面的步驟1)對(duì)細(xì)胞、組織或器官例如那些得自心臟或肌肉的物質(zhì)的群體進(jìn)行培養(yǎng)，2)對(duì)該細(xì)胞、組織或器官施加應(yīng)激，優(yōu)選地通過(guò)剝奪氧氣或代謝抑制如通過(guò)加入葡萄糖衍生物來(lái)對(duì)其施加應(yīng)激，3)加入已知或候選的半通道調(diào)節(jié)化合物如下面式I或II所示的那些化合物，4)加入可檢測(cè)的指示劑如熒光、化學(xué)發(fā)光、或磷光性化合物如熒光染料如鈣黃綠素及相關(guān)化合物，5)檢測(cè)相對(duì)于適宜對(duì)照而言的細(xì)胞、組織或器官中的可檢測(cè)的指示劑的攝取改變；和6)任選地對(duì)該作為調(diào)節(jié)半通道功能化合物的標(biāo)識(shí)的改變進(jìn)行測(cè)量。
該測(cè)定可以有效測(cè)量候選化合物打開(kāi)或關(guān)閉細(xì)胞、組織或器官中的半通道的能力，其半通道的改變可以通過(guò)對(duì)該可檢測(cè)的指示劑進(jìn)行目測(cè)容易地用顯微鏡檢測(cè)出來(lái)。這里涉及的“標(biāo)準(zhǔn)的體外攝取測(cè)定”或相關(guān)短語(yǔ)指的是上面步驟1)至6)的方案。該測(cè)定可以用幾乎任何原代細(xì)胞、次代細(xì)胞、或無(wú)限增殖化細(xì)胞如那些得自心臟或肌肉的物質(zhì)的群體來(lái)進(jìn)行。其它可接受的指示劑包括也具有允許進(jìn)行通過(guò)該半通道的流通的大小的適宜的放射性化合物。特定的化合物包括那些用一種或多種下面的放射性核素進(jìn)行了標(biāo)記的化合物3H、35S、和14C。
重要的是，只要可以獲得所需的測(cè)定結(jié)果，則上面進(jìn)行了一般性描述的標(biāo)準(zhǔn)的體外攝取測(cè)定并不限于任何特定的步驟次序。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)和4)的至少一種候選化合物和可檢測(cè)的指示劑可以在該方法的步驟2)之前分別被加入或一起被加入。在這種測(cè)定實(shí)例中，在存在化合物和可檢測(cè)的指示劑的情況下對(duì)細(xì)胞、組織或器官施加應(yīng)激?；蛘?，可以將該可檢測(cè)的指示劑在步驟1)時(shí)“負(fù)載”到細(xì)胞中以對(duì)這些化合物打開(kāi)半通道的能力進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明還提供了用于對(duì)一種或多種候選化合物調(diào)節(jié)半通道功能的能力進(jìn)行篩選的另外的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使細(xì)胞、組織或器官與至少一種選自下面式I或II所示那些化合物的化合物進(jìn)行接觸。一般給細(xì)胞、組織或器官加載可檢測(cè)的指示劑以對(duì)體積進(jìn)行測(cè)量。用于測(cè)定的優(yōu)選的可檢測(cè)的指示劑具有適于通過(guò)開(kāi)放的半通道的分子大小。正如由可檢測(cè)的指示劑和適宜的參考對(duì)照所提示的那樣，接觸優(yōu)選地是在有助于對(duì)細(xì)胞、組織或器官體積的任何改變進(jìn)行檢測(cè)的條件下進(jìn)行的。優(yōu)選地對(duì)細(xì)胞、組織或器官施加應(yīng)激和候選化合物關(guān)閉該半通道，從而使得與適宜對(duì)照相比，細(xì)胞體積被維持或降低得十分緩慢。
用于對(duì)細(xì)胞體積的改變進(jìn)行檢測(cè)的一種特定的體外篩選測(cè)定包括一種或多種下面的步驟1)對(duì)細(xì)胞、組織或器官例如那些得自心臟或肌肉的物質(zhì)的群體進(jìn)行培養(yǎng)，2)用可檢測(cè)的指示劑如熒光、化學(xué)發(fā)光、或磷光性化合物如染料，如鈣黃綠素或相關(guān)化合物對(duì)細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行裝填，
3)通過(guò)對(duì)得自可檢測(cè)的指示劑的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和定量來(lái)對(duì)細(xì)胞、組織或器官的體積進(jìn)行估計(jì)，4)加入已知的或候選的半通道調(diào)節(jié)化合物如下面式I或II所示的那些化合物，5)對(duì)該細(xì)胞、組織或器官施加應(yīng)激，優(yōu)選地通過(guò)剝奪氧氣或代謝抑制如通過(guò)加入葡萄糖衍生物來(lái)對(duì)其施加應(yīng)激，6)檢測(cè)相對(duì)于適宜對(duì)照而言的細(xì)胞體積改變；和7)任選地對(duì)作為調(diào)節(jié)半通道功能并任選地調(diào)節(jié)間隙連接功能化合物的標(biāo)識(shí)的改變進(jìn)行測(cè)量。
該測(cè)定可以通過(guò)用顯微鏡對(duì)細(xì)胞體積變化進(jìn)行觀測(cè)來(lái)有效地對(duì)候選的半通道化合物打開(kāi)或關(guān)閉細(xì)胞、組織或器官中的半通道的能力進(jìn)行測(cè)量。這里涉及的“標(biāo)準(zhǔn)的體外細(xì)胞體積測(cè)定”或相關(guān)短語(yǔ)指的是上面步驟1)至7)的方案。該測(cè)定可以用得自心臟或肌肉如心肌細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞或組織的原代細(xì)胞或次代細(xì)胞的幾乎任何群體來(lái)進(jìn)行。
只要可獲得所需的測(cè)定結(jié)果，該標(biāo)準(zhǔn)的體外細(xì)胞體積測(cè)定不會(huì)受到步驟任何特定次序的束縛。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟4)的候選化合物可以在步驟3)中在對(duì)細(xì)胞施加應(yīng)激后被加入來(lái)對(duì)該化合物關(guān)閉在通過(guò)細(xì)胞體積降低的速率更慢而表現(xiàn)出來(lái)已經(jīng)受到影響的細(xì)胞中的半通道的能力進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因此在一個(gè)測(cè)定實(shí)施方案中，在預(yù)定的時(shí)間框架內(nèi)對(duì)細(xì)胞體積降低或增加速率的改變進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但是，在另外的實(shí)施方案中，可以在固定的時(shí)間點(diǎn)例如在對(duì)細(xì)胞、組織或器官施加應(yīng)激后約1至120分鐘的時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞體積的改變進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
正如所討論的那樣，本發(fā)明的體外測(cè)定是靈活易變的并且可以對(duì)其進(jìn)行調(diào)整以適合所需的篩選應(yīng)用。例如，可以用特定的候選半通道調(diào)節(jié)化合物，如下面式I或II所示的那些化合物作為唯一的活性物質(zhì)或者將其與包括被試驗(yàn)的其它化合物在內(nèi)的其它物質(zhì)聯(lián)用。在大多數(shù)但是不是所有的情況中，該體外測(cè)定是參考適宜的對(duì)照測(cè)定來(lái)進(jìn)行的，所說(shuō)的適宜的對(duì)照測(cè)定通常包括與上面步驟中的條件相同或密切相關(guān)的試驗(yàn)條件，但是沒(méi)有向培養(yǎng)基質(zhì)中加入所試驗(yàn)的化合物。在該類情況中，可以通過(guò)在測(cè)定中表現(xiàn)出比對(duì)照至少高2％的活性來(lái)對(duì)候選的半通道調(diào)節(jié)化合物進(jìn)行鑒別，該候選化合物的活性更優(yōu)選地比對(duì)照測(cè)定高至少約5％，更優(yōu)選地高至少約10％或更高，例如比對(duì)照測(cè)定高約20％至約40％。
正如這里所討論的那樣，特定的半通道調(diào)節(jié)化合物還會(huì)影響間隙連接通道。例如，某些化合物可幫助關(guān)閉該半通道并有助于間隙連接通道的開(kāi)放。但是，其它化合物可幫助打開(kāi)半通道，同時(shí)有助于間隙連接通道的閉合。還有一些其它的化合物可以既打開(kāi)半通道又打開(kāi)間隙連接，而其他的可以關(guān)閉間隙連接和半通道。
因此，本發(fā)明還提供了一種增加細(xì)胞、組織或器官中的間隙連接細(xì)胞內(nèi)通訊(GJIC)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自如下所述的式I或II所示那些化合物的化合物。優(yōu)選地，相對(duì)于適宜的對(duì)照而言，該接觸足以增加細(xì)胞、組織或器官中的GJIC。
還提供了對(duì)化合物調(diào)節(jié)半通道和間隙連接的能力進(jìn)行選擇的體外測(cè)定的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，將標(biāo)準(zhǔn)體外連接蛋白磷酸化作用測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)體外攝取測(cè)定、和標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞體積測(cè)定中的至少一種與Larsen，B.等人在于2001年2月22日提交的標(biāo)題為“新型抗心律失常的肽類”的PCT申請(qǐng)PCT/DK01/00127(WO01/62775)或Larsen，B.等人在于2002年2月22日提交的標(biāo)題為“細(xì)胞內(nèi)通訊促進(jìn)化合物的新醫(yī)學(xué)應(yīng)用”的PCT申請(qǐng)PCT/US02/05773(WO 02/077017)中所公開(kāi)的GJIC測(cè)定中的一種或多種相組合。該類適宜GJIC測(cè)定的實(shí)例包括通過(guò)膜片鉗、鈣波測(cè)量和染料傳遞測(cè)定進(jìn)行的對(duì)細(xì)胞傳導(dǎo)進(jìn)行測(cè)量的那些測(cè)定。PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和PCT/US02/05773(WO02/077017)申請(qǐng)?jiān)谶@里被引入作為參考。
通過(guò)非限制性地解釋，用上面所述的標(biāo)準(zhǔn)體外連接蛋白磷酸化作用測(cè)定來(lái)對(duì)一種或多種半通道調(diào)節(jié)化合物進(jìn)行選擇。隨后可以用PCT/US02/05773(WO 02/077017)申請(qǐng)中所描述的心肌細(xì)胞膜片鉗測(cè)定對(duì)一種或多種該化合物進(jìn)行進(jìn)一步篩選。在兩種測(cè)定中都提供了適宜活性的化合物對(duì)半通道和間隙連接具有調(diào)節(jié)能力。
本發(fā)明還提供了幫助對(duì)調(diào)節(jié)心臟心律不齊的治療能力進(jìn)行檢測(cè)并任選地對(duì)其進(jìn)行定量的候選半通道調(diào)節(jié)化合物的體內(nèi)試驗(yàn)。正如這里所討論的這樣，其認(rèn)為可以通過(guò)使用一種本發(fā)明的化合物或本發(fā)明化合物的組合來(lái)預(yù)防、緩解或治療大多數(shù)心律不齊。在PCT/DK01/00127(WO01/62775)以及PCT/US02/05773(WO 02/077017)中公開(kāi)了在這里被稱為“標(biāo)準(zhǔn)的體外小鼠心律不齊測(cè)定”或相關(guān)短語(yǔ)的優(yōu)選的體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在測(cè)定中，本發(fā)明的某些化合物將令人滿意地將所誘導(dǎo)的房室(AV)阻滯(至少2的得分)開(kāi)始的時(shí)間延長(zhǎng)至少約20％。其它一些化合物表現(xiàn)出將試驗(yàn)中所誘導(dǎo)的AV阻滯(至少3的得分)開(kāi)始的時(shí)間延長(zhǎng)至少約60％。在廣義上，該測(cè)定包括將一種或多種化合物給予注射了用于誘導(dǎo)心律不齊的氯化鈣的適宜小鼠，并對(duì)與適宜對(duì)照相比的心律不齊(優(yōu)選第2級(jí)AV阻滯)開(kāi)始的時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。
值得注意的是，使用多種檢測(cè)形式(即，至少一種這里所公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)體外測(cè)定和體內(nèi)心律不齊測(cè)定的組合)可以有效進(jìn)行復(fù)合分析，從而可以增加對(duì)具有良好治療能力的半通道調(diào)節(jié)化合物(例如式I和II所示的化合物)進(jìn)行確定的準(zhǔn)確度和概率。當(dāng)對(duì)大量化合物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，本發(fā)明的這種特性尤其有用。例如，可以對(duì)一些或幾乎所有的式I或II的化合物進(jìn)行試驗(yàn)。供替代地或者此外，可以用包括組合型化學(xué)操作在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)合成方法來(lái)制備適宜的化合物并根據(jù)本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)。
在進(jìn)行復(fù)合檢測(cè)形式的實(shí)施方案中，重要的是要注意通過(guò)這里所描述的測(cè)定所測(cè)得的顯著的體外和體內(nèi)活性不是該半通道調(diào)節(jié)化合物的必需特征。即，這里所描述的某些化合物在這里所述的至少一種標(biāo)準(zhǔn)體外測(cè)定中會(huì)表現(xiàn)出良好的活性，但是在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)心律不齊測(cè)定中可能不會(huì)表現(xiàn)出顯著的活性?；蛘撸承┢渌衔飳⒃隗w內(nèi)心律不齊測(cè)定中表現(xiàn)出顯著的活性，而在一種或多種標(biāo)準(zhǔn)體外測(cè)定中將不會(huì)表現(xiàn)出良好的活性。但是，優(yōu)選的半通道調(diào)節(jié)化合物將在本申請(qǐng)所描述的體外和體內(nèi)測(cè)定中的至少一種中表現(xiàn)出良好的活性。
在標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)心律不齊測(cè)定中表現(xiàn)出良好活性的化合物有時(shí)被稱為“抗心律失?；衔铩被蛴糜诒硎酒淇稍跍y(cè)定中延長(zhǎng)至心律不齊的時(shí)間的類似短語(yǔ)。
正如在下面更詳細(xì)地討論的那樣，本發(fā)明的化合物可用來(lái)預(yù)防或治療與分子和/或離子通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行的不希望出現(xiàn)或異常流通有關(guān)或懷疑與之有關(guān)的廣泛的醫(yī)學(xué)情況。例如，可以以這種方式影響PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和PCT/US02/05773(WO 02/077017)中所公開(kāi)的幾乎所有醫(yī)學(xué)情況。所說(shuō)的醫(yī)學(xué)適應(yīng)征中的一些在這里被公開(kāi)。通過(guò)使用本發(fā)明所公開(kāi)的化合物中的一種或其組合，可以對(duì)這些醫(yī)學(xué)適應(yīng)征進(jìn)行預(yù)防、緩解或治療，所說(shuō)的化合物特別是這些在這里所提供的體外和體內(nèi)測(cè)定的至少一種中表現(xiàn)出良好的活性的化合物。
Larsen，B.D等人在PCT/US02/05773(WO 02/077017)中公開(kāi)了適于進(jìn)行試驗(yàn)和本發(fā)明應(yīng)用的另外的化合物。
另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物組織或器官應(yīng)激的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自上面式I和II所示化合物的化合物。優(yōu)選地，該接觸足以對(duì)組織或器官中的應(yīng)激進(jìn)行預(yù)防或治療。
本發(fā)明還提供了一種治療燒傷的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的化合物。
還提供了一種治療血栓形成的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的化合物。
在另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療呼吸性和代謝性酸中毒的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的化合物。
本發(fā)明還提供了一種治療病灶性心律不齊的方法。在該方法的一個(gè)實(shí)例中，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的化合物。
本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防由血液葡萄糖水平升高所導(dǎo)致的細(xì)胞和組織損害的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的化合物。
本發(fā)明還提供了一種治療慢性心房纖維性顫動(dòng)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的化合物。
還提供了一種治療癲癇的方法。該方法通常包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以促進(jìn)連接蛋白半通道開(kāi)放的化合物。
還提供了一種對(duì)需要進(jìn)行該類治療的哺乳動(dòng)物的組織或器官進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)的方法，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物再灌注性損傷的方法，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物。
在上述各治療方法中，本發(fā)明化合物的特征為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)體外小鼠心律不齊測(cè)定進(jìn)行測(cè)定時(shí)具有良好的抗心律不齊活性(即至少2分)。該類化合物在這里有時(shí)被稱為“抗心律失?！被衔锘蛳嚓P(guān)短語(yǔ)。
本發(fā)明另外的應(yīng)用和優(yōu)點(diǎn)將隨著下面的討論和實(shí)例而變得顯而易見(jiàn)。在下面還對(duì)本發(fā)明的其它方面進(jìn)行了討論。


圖1是表示連接蛋白(Cx43)上的磷酸化作用部位的圖。正如可以看到的那樣，Cx43跨膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有一些潛在的絲氨酸和酪氨酸磷酸化作用部位。
圖2是表示由除去葡萄糖所誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激的圖。正如可以從圖中看出來(lái)的那樣，化合物1的給藥降低了應(yīng)激，這可由相對(duì)傳導(dǎo)延遲的降低來(lái)證明。
圖3A-B表示表明在連接蛋白43(Cx43)中檢測(cè)酪氨酸磷酸化作用的免疫印跡。圖3A表示了給予化合物1所獲得的結(jié)果。圖3B表示了給予化合物1和化合物2所獲得的結(jié)果。
圖4A-B表示表明檢測(cè)Cx43酪氨酸磷酸化作用(8A)和絲氨酸磷酸化作用(8B)的免疫印跡。
圖5是表示10nM化合物1對(duì)所培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中局部缺血-誘導(dǎo)的鈣黃綠素?cái)z取的影響的圖。
圖6A是表示優(yōu)選的ELISA測(cè)定形式的圖。圖6B是表示在HeLa細(xì)胞中在Tyr-P上的磷酸化Cx43的ELISA結(jié)果的圖。圖6C是說(shuō)明在CHO細(xì)胞中在Tyr-P上磷酸化Cx43的ELISA結(jié)果的圖。
圖7A-C是表示所培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中的染料攝取的顯微照片。圖7A光學(xué)顯微鏡下的心肌細(xì)胞；圖7B對(duì)照條件下(與圖7A中的細(xì)胞相同)的熒光；圖7C代謝抑制30分鐘后的熒光。
圖8是表示化合物1以劑量依賴方式降低了應(yīng)激誘導(dǎo)的鈣黃綠素?cái)z取的圖。
圖9A-B是表示化合物1對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞膨脹的作用的圖。圖9A在存在或不存在化合物1(0.1nM)情況下代謝抑制期間的相對(duì)體積。圖9B表示對(duì)照數(shù)據(jù)。
圖10是表示化合物1(0.1nM)對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞膨脹的作用的圖。
圖11是表示在給予患有心肌梗死的大鼠化合物1后心臟重量與體重比例降低的圖。
圖12是表示給予化合物1后大鼠梗死大小降低的圖。
圖13是表示給予患有心肌梗死的大鼠化合物1后心肌功能得到改善的圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述正如所討論的那樣，本發(fā)明提供了一些化合物和用其來(lái)對(duì)半通道功能進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法。更特定的化合物可以調(diào)節(jié)半通道磷酸化作用以幫助打開(kāi)或關(guān)閉半通道。還提供了用于對(duì)該類化合物進(jìn)行檢測(cè)和定性描述的有用篩選，該篩選包括體外測(cè)定、體內(nèi)測(cè)定、或其組合。還提供了用于治療或預(yù)防受不適當(dāng)?shù)陌胪ǖ拦δ苡绊懙那闆r的治療方法。
本發(fā)明的目的是第一次證明通過(guò)關(guān)閉和打開(kāi)半通道可以對(duì)細(xì)胞、組織和器官應(yīng)激產(chǎn)生相反的影響。不希望受到理論束縛，其認(rèn)為代謝應(yīng)激，如局部缺血期間缺氧、缺葡萄糖、由HCN所造成的氧化磷酸化作用的解偶聯(lián)、或枸櫞酸循環(huán)的解偶聯(lián)可能有助于細(xì)胞間間隙連接通訊(GJIC)的解偶聯(lián)。還認(rèn)為這種解偶聯(lián)與連接蛋白磷酸化作用的調(diào)節(jié)有關(guān)，更特定地是與間隙連接中連接蛋白-酪氨酸殘基和/或連接蛋白-絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基的脫磷酸化作用有關(guān)。作為解釋，其認(rèn)為在心房纖維性顫動(dòng)期間，由于高頻率的速度，心房細(xì)胞代謝需求增加。認(rèn)為這會(huì)導(dǎo)致乳酸鹽酸中毒，從而開(kāi)放半通道和使間隙連接解偶聯(lián)。
本發(fā)明的目的還在于要提供對(duì)半通道功能并且任選地對(duì)間隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法，該方法包括使細(xì)胞、組織和器官與治療有效量的一種或多種具有該類活性的化合物進(jìn)行接觸。B.Larsen等人在PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和PCT/US02/05773(WO02/077017)中已經(jīng)公開(kāi)了優(yōu)選的化合物。
適用于本發(fā)明的更有選的化合物包括下面式I所示的那些化合物及其鹽 其中R1表示H或乙酰基(Ac)R2表示氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F中的一種的側(cè)鏈，R3表示任何氨基酸側(cè)鏈R4表示氨基酸氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F中的一種的側(cè)鏈，R5表示OH或NH2和a、S、T、P和Q是整數(shù)并且分別＝0或1。
更特定的化合物包括那些具有下面式II的化合物及其鹽
R1-X1-X2-X3-R2II其中，X1是0、Ala、Gly、β-Ala、Tyr、D-Tyr、Asp，X2是0；Ala-Gly-T4c-Pro；Ala-Sar-Hyp-Pro；；Ala-Asn；D-Asn-D-Ala；D-Asn；；Gly，Ala；D-Ala；β-Ala；；Asn；或；X3是Tyr；D-Tyr；Gly，，或Phe；和R1是H或Ac，前提是X1和X2不能都是0。
R2是OH或NH2上面式I或II所示的更特定的化合物包括下面的化合物及其鹽G-(DBF)-Y-NH2，，H-GA-Sar-Hyp-PY-NH2，H-GAG-T4c-PY-NH2，Gly-Ala-Asn-Tyr，D-Tyr-D-Asn-D-Ala-Gly，D-Tyr-D-Asn-Gly，，，Gly-Gly-Tyr，Gly-Ala-Tyr，D-Tyr-D-Ala-Gly，Gly-D-Asn-Tyr，Gly-βAla-Tyr，βAla-βAla-Tyr，，Gly-βAla-Phe，Gly-Asn-Phe，，Asn-Tyr，Ac-Gly-Tyr，Ac-Ala-Tyr，(被還原的Gly)-Gly-Tyr(H2N-CH2-CH2-NH-CH2-C(O)-Tyr)，
本發(fā)明另外優(yōu)選的候選化合物的特征為通過(guò)可接受的口服生物利用度測(cè)定進(jìn)行測(cè)定時(shí)其口服生物利用度高于約5％。優(yōu)選的測(cè)定一般包括將候選化合物十二指腸內(nèi)給藥于適宜的試驗(yàn)個(gè)體。然后優(yōu)選地對(duì)該化合物在生物學(xué)樣品，優(yōu)選血液樣品中的利用度進(jìn)行檢測(cè)并優(yōu)選地對(duì)其進(jìn)行定量。
進(jìn)一步優(yōu)選的候選化合物一般滿足Lipinski′s規(guī)則5。在應(yīng)用時(shí)，其對(duì)生物利用度進(jìn)行了規(guī)定。根據(jù)該規(guī)則，當(dāng)一種特別優(yōu)選的化合物具有一種或多種下面的特征時(shí)其更可能具有較不令人滿意的吸收1)多于5個(gè)H-鍵供體(被表示為OH′s和NH′s的和)，2)分子量高于500，3)Log P高于5，4)多于10個(gè)H-鍵受體(被表示為N′s和O′s的和)，和5。對(duì)于許多本發(fā)明的實(shí)施方案而言應(yīng)避免兩個(gè)參數(shù)在該范圍之外。
本發(fā)明更優(yōu)選的化合物在血漿中相對(duì)穩(wěn)定?？山邮艿臏y(cè)定包括使所需的候選化合物與血漿(例如嚙齒動(dòng)物、兔子或靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清)進(jìn)行接觸，用血漿對(duì)該化合物進(jìn)行培養(yǎng)，然后在一段時(shí)間內(nèi)對(duì)該化合物進(jìn)行檢測(cè)并優(yōu)選地對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行定量。優(yōu)選的血漿來(lái)源是大鼠、狗、貓、小鼠、豬、牛、馬、和人。在PCT申請(qǐng)PCT/US02/05773(WO02/077017)中已經(jīng)公開(kāi)了優(yōu)選的測(cè)定，其在這里有時(shí)被稱為“標(biāo)準(zhǔn)的血漿穩(wěn)定性測(cè)定”。在測(cè)定中給出了良好活性的典型化合物的特征為C-末端酰胺化或酯化、使用D-氨基酸以及天然氨基酸的衍生物、N-末端修飾、以及環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該類改變中的一種或其組合可以增加穩(wěn)定性而同時(shí)仍基本保留其生物學(xué)活性。
本發(fā)明使用的尤其優(yōu)選的半通道調(diào)節(jié)化合物包括Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)；Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物2)；以及它們的鹽。
優(yōu)選的半通道調(diào)節(jié)化合物在這里所公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)體外和體內(nèi)測(cè)定的一種或組合中表現(xiàn)出顯著的活性。該類化合物還具有關(guān)閉或打開(kāi)半通道的能力，并任選地具有調(diào)節(jié)GJIC的能力。優(yōu)選地，在用標(biāo)準(zhǔn)的體外連接蛋白磷酸化作用測(cè)定進(jìn)行測(cè)定時(shí)，適宜的化合物增加或降低了連接蛋白43(Cx43)的磷酸化作用。更特定的測(cè)定對(duì)圖1所示的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸氨基酸殘基中一種或多種的磷酸化作用和/或脫磷酸化作用進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。一種更特定的測(cè)定如下。
1)將約105個(gè)細(xì)胞的群體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)如融合或半融合的大鼠心肌細(xì)胞或H9c2細(xì)胞，2)通過(guò)對(duì)其進(jìn)行洗滌對(duì)細(xì)胞施加應(yīng)激并隨后將其在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約1小時(shí)或更短的時(shí)間，3)在約10分鐘至8小時(shí)內(nèi)將化合物1加入到培養(yǎng)基中至約0.1至約200nM的濃度，4)將細(xì)胞溶解，然后對(duì)Cx43酪氨酸、絲氨酸、和/或蘇氨酸磷酸化作用相對(duì)于適宜對(duì)照而言的改變進(jìn)行檢測(cè)；和5)測(cè)量作為調(diào)節(jié)半通道功能化合物的標(biāo)識(shí)的磷酸化作用的改變。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟4)還包括用免疫學(xué)或基于細(xì)胞分選的測(cè)定對(duì)候選化合物進(jìn)行試驗(yàn)。在使用免疫學(xué)測(cè)定的情況中，該測(cè)定一般包括將細(xì)胞與候選化合物在足以增加或降低連接蛋白的磷酸化作用的情況下進(jìn)行接觸。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括產(chǎn)生細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物；并檢測(cè)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中連接蛋白磷酸化作用的增加或降低。將該增加或降低看成是該半通道調(diào)節(jié)化合物的另一個(gè)標(biāo)識(shí)。
已經(jīng)對(duì)用于該方法的優(yōu)選的免疫學(xué)測(cè)定進(jìn)行了描述，并且包括免疫沉淀法測(cè)定、抗體捕捉測(cè)定、雙-抗體夾層測(cè)定、抗原捕捉測(cè)定、放射免疫測(cè)定(RIAs)等等。一般可參見(jiàn)E.Harlow和D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1988)；Ausubel等人(1989)，Current Protocols inMolecular Biology，J.Wiley&Sons，New York，其涉及許多標(biāo)準(zhǔn)的免疫方法討論，其公開(kāi)內(nèi)容在這里引入作為參考。
優(yōu)選的免疫學(xué)測(cè)定是ELISA測(cè)定。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法還包括下面步驟中的至少一步，優(yōu)選地包括下面步驟的全部a)用與連接蛋白，優(yōu)選地為連接蛋白43(Cx43)特異性結(jié)合的第一抗體對(duì)固體支撐物進(jìn)行涂布，b)使細(xì)胞溶胞產(chǎn)物與該固體支撐物在足以在第一抗體和連接蛋白之間形成結(jié)合復(fù)合體的條件下進(jìn)行接觸，c)使該第一抗體連接蛋白結(jié)合復(fù)合體與第二抗體進(jìn)行接觸，該接觸是在足以在第二抗體和第一抗體連接蛋白結(jié)合復(fù)合體中的任何被磷酸化的連接蛋白之間形成特定的結(jié)合復(fù)合體的情況下進(jìn)行的，d)將該第一抗體連接蛋白第二抗體結(jié)合復(fù)合體與進(jìn)行了可檢測(cè)標(biāo)記的可以與第二抗體結(jié)合的第三抗體進(jìn)行接觸；和e)檢測(cè)作為該化合物的另一個(gè)標(biāo)識(shí)的該固體支撐物上所存在的進(jìn)行了可檢測(cè)標(biāo)記的第三抗體。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，用生物素、FITC、TRITC、放射性碘或過(guò)氧化物酶中的至少一種對(duì)該方法的第三抗體進(jìn)行可檢測(cè)性標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案，該第二抗體是抗-磷酸酪氨酸抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該第二抗體是抗-磷酸絲氨酸抗體。在一些情況中，該進(jìn)行了可檢測(cè)標(biāo)記的第三抗體的檢測(cè)是通過(guò)放射性-或γ閃爍計(jì)數(shù)來(lái)進(jìn)行的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，被用作檢測(cè)步驟的免疫學(xué)方法是放射免疫測(cè)定(RIA)。優(yōu)選地，該類RIA包括下面步驟中的至少一步并優(yōu)選地包括下面的全部步驟a)在產(chǎn)生細(xì)胞溶胞產(chǎn)物之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可檢測(cè)的標(biāo)記，其中所說(shuō)的標(biāo)記是在有助于對(duì)磷酸化連接蛋白，優(yōu)選地為連接蛋白43(Cx43)進(jìn)行標(biāo)記的條件下進(jìn)行的，b)使該細(xì)胞溶解產(chǎn)物與可以與該連接蛋白形成特定的結(jié)合復(fù)合體的抗體進(jìn)行接觸，c)將該結(jié)合復(fù)合體與該進(jìn)行了可檢測(cè)標(biāo)記的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物分開(kāi)；和d)對(duì)作為該間隙連接調(diào)節(jié)化合物的另一個(gè)標(biāo)識(shí)的進(jìn)行了標(biāo)記和磷酸化的連接蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是抗-連接蛋白抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該檢測(cè)步驟還包括進(jìn)行蛋白免疫印跡測(cè)定。該RIA方法可以與許多可檢測(cè)的標(biāo)記相容，但是對(duì)于許多應(yīng)用而言，優(yōu)選地使用放射性無(wú)機(jī)磷。
包括抗-磷酸酪氨酸、抗-磷酸絲氨酸、和抗-Cx43抗體在內(nèi)的用于上述本發(fā)明方法的抗體可以通過(guò)各種來(lái)源通過(guò)商業(yè)途徑獲得，例如可以得自the American Type Culture Collection(ATCC)；SigmaChemical Co.，St.Louis，MO；Zymed Lab，Inc.，of California；和Amersham Biosciences，U.K.。
用上面標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗(yàn)所確定的優(yōu)選的半通道調(diào)節(jié)化合物表現(xiàn)出良好的調(diào)節(jié)Cx43磷酸化作用的能力，特別是對(duì)圖1所示的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)上的磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)的能力。更優(yōu)選的該類化合物在該類磷酸化作用(以Cx43上磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、和/或磷酸蘇氨酸中的一種或多種的出現(xiàn)的降低的增加來(lái)進(jìn)行測(cè)量)上相對(duì)于應(yīng)激的細(xì)胞而言表現(xiàn)出至少5％的改變，優(yōu)選地表現(xiàn)出至少約10％，更優(yōu)選至少約50％的改變，其中化合物的存在濃度為約0.1nM至約200nM。
見(jiàn)下面的實(shí)施例2-5，其是標(biāo)準(zhǔn)體外連接蛋白磷酸化測(cè)定的特定實(shí)例。
正如所討論的這樣，本發(fā)明的特征還在于可用于對(duì)半通道調(diào)節(jié)化合物進(jìn)行檢測(cè)并任選地對(duì)其進(jìn)行定性的標(biāo)準(zhǔn)的體外攝取測(cè)定。該測(cè)定可以被單獨(dú)使用或者可以與標(biāo)準(zhǔn)的體外連接蛋白磷酸化作用測(cè)定聯(lián)合應(yīng)用。該標(biāo)準(zhǔn)體外攝取測(cè)定特定實(shí)施方案的描述如下。
1)將約105個(gè)融合大鼠心室肌細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，
2)通過(guò)將該培養(yǎng)基用缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基進(jìn)行替換培養(yǎng)約2小時(shí)以下，優(yōu)選約30分鐘來(lái)對(duì)該細(xì)胞施加應(yīng)激，3)向該培養(yǎng)基中加入化合物1至約0.01pM至100nM的濃度，4)向該培養(yǎng)基中加入鈣黃綠素染料至約10至約500微摩爾的濃度，小于約2小時(shí)并且優(yōu)選地為約30分鐘，5)對(duì)進(jìn)入細(xì)胞的鈣黃綠素的攝取變化進(jìn)行檢測(cè)；和6)對(duì)該作為調(diào)節(jié)半通道功能化合物的標(biāo)識(shí)的改變進(jìn)行測(cè)量可以用一種或多種標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)鈣黃綠素?cái)z取改變的步驟，所說(shuō)的方法包括熒光光學(xué)顯微鏡和/或相關(guān)的細(xì)胞分選方法。見(jiàn)實(shí)施例6，一種標(biāo)準(zhǔn)體外攝取測(cè)定的特定實(shí)例。
用上述標(biāo)準(zhǔn)的體外攝取測(cè)定所檢測(cè)到的優(yōu)選化合物在存在約0.01pM至100nM試驗(yàn)化合物的情況下相對(duì)于應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞而言，在染料攝取(關(guān)閉細(xì)胞半通道)方面表現(xiàn)出至少約5％的降低，優(yōu)選至少約20％的降低并且更優(yōu)選至少約50％的降低。
正如所討論的那樣，本發(fā)明還提供了體外細(xì)胞體積測(cè)定，該測(cè)定可以單獨(dú)進(jìn)行或者可以與該標(biāo)準(zhǔn)體外連接蛋白磷酸化作用和標(biāo)準(zhǔn)體外攝取測(cè)定中的一種聯(lián)用或者可以與二者同時(shí)聯(lián)用。該標(biāo)準(zhǔn)的體外細(xì)胞體積測(cè)定的一個(gè)特定實(shí)施方案如下。
1)將約105個(gè)融合大鼠心室肌細(xì)胞群體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，2)在小于約2小時(shí)并且優(yōu)選約15分鐘內(nèi)以約0.5至約100微摩爾，優(yōu)選約5微摩爾的量給細(xì)胞加載鈣黃綠素-AM3)通過(guò)對(duì)得自鈣黃綠素-AM的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)并優(yōu)選地對(duì)其進(jìn)行定量來(lái)對(duì)細(xì)胞體積進(jìn)行估計(jì)，4)將化合物1加入到培養(yǎng)基中至約0.01nM至約100nM的濃度，5)通過(guò)在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)對(duì)細(xì)胞施加應(yīng)激，6)對(duì)相對(duì)于適宜對(duì)照而言的細(xì)胞體積改變進(jìn)行檢測(cè)；和7)對(duì)該作為調(diào)節(jié)半通道功能化合物的標(biāo)識(shí)改變進(jìn)行測(cè)量。
對(duì)細(xì)胞體積的變化進(jìn)行檢測(cè)的步驟可以通過(guò)一種或多種標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行，包括激光同焦點(diǎn)顯微鏡檢查和/或相關(guān)的細(xì)胞分選方法。實(shí)施例7提供了該標(biāo)準(zhǔn)的體外細(xì)胞體積測(cè)定的一個(gè)特定實(shí)例。
在存在約0.01nM至100nM試驗(yàn)化合物的情況下，由上述標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞體積測(cè)定所檢測(cè)出的優(yōu)選化合物將在細(xì)胞體積中相對(duì)于應(yīng)激細(xì)胞而言表現(xiàn)出至少約5％的降低(關(guān)閉半通道)，優(yōu)選至少約20％的降低并且最優(yōu)選至少約50％的降低。按照本測(cè)定所選擇的化合物可抑制滲壓劑通過(guò)半通道流動(dòng)并在產(chǎn)生細(xì)胞膨脹的情況下幫助維持正常的細(xì)胞體積。重要的是，細(xì)胞膨脹與被纖維性囊所圍繞著的器官(例如心、腎、骨骼肌)或被骨所圍繞著的器官(腦、脊髓)中灌注受損有關(guān)，從而，具有半通道阻滯性質(zhì)的化合物可用于治療與細(xì)胞膨脹有關(guān)的疾病。
適宜的對(duì)照實(shí)驗(yàn)一般與使用的特定測(cè)定形式相適應(yīng)。例如，大多數(shù)對(duì)照試驗(yàn)包括將試驗(yàn)樣品(例如所培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞群體)用非應(yīng)激性條件進(jìn)行處理例如在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。一般平行或單獨(dú)地向該測(cè)定中加入水、緩沖劑、磷酸鹽緩沖的鹽水等等來(lái)代替向其中加入試驗(yàn)化合物(試驗(yàn)化合物)。然后根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行所需的測(cè)定。在實(shí)施例部分提供了適宜對(duì)照的特定實(shí)例。
本發(fā)明的實(shí)踐可以與許多常規(guī)檢查測(cè)定相容。可以根據(jù)需要用手動(dòng)、半手動(dòng)或以自動(dòng)方式來(lái)進(jìn)行該類測(cè)定。對(duì)于需要進(jìn)行迅速或大規(guī)模篩選策略的應(yīng)用而言，本發(fā)明還可以與標(biāo)準(zhǔn)的“高-處理量”和/或“超高處理量”篩選方法相容。該類方法的實(shí)例包括免疫學(xué)和細(xì)胞分選型測(cè)定如這里所描述的那些測(cè)定。
正如所討論的這樣，本發(fā)明可以與許多試驗(yàn)策略相容。因此，在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)候選化合物進(jìn)行另外的體內(nèi)試驗(yàn)，優(yōu)選地對(duì)該半通道改變活性進(jìn)行確證。例如，可以用這里所述標(biāo)準(zhǔn)體外方法中的一種或其組合來(lái)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)心律不齊模型中半通道調(diào)節(jié)活性的化合物進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。B.Larsen等人在PCT/DK01/00127(WO01/62775)和PCT/US02/05773(WO02/077017)中公開(kāi)了標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)小鼠心律不齊測(cè)定，在下面以參考實(shí)施例1的形式對(duì)其進(jìn)行了描述。
用一種或多種本發(fā)明的方法所確定的候選化合物具有各種重要的應(yīng)用，包括用作用于確定細(xì)胞、組織和器官中間隙連接并且特別是半通道的探針。該類化合物可以用作檢測(cè)各種進(jìn)程和疾病狀態(tài)中的間隙連接和半通道的探針并且可以用作檢測(cè)具有不同碳水化合物裝飾和/或磷酸化作用模式的那些結(jié)構(gòu)的探針。發(fā)現(xiàn)該類化合物可用作用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色譜操作對(duì)間隙連接組分進(jìn)行純化的固體支撐組分。
通過(guò)這里所描述體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)所選擇的化合物可以用作預(yù)防或治療受半通道開(kāi)放增加(細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞外隔室的滲透性增加)影響的情況的藥物，所說(shuō)的情況例如，創(chuàng)傷如燒傷、血栓形成、呼吸性和代謝性酸中毒、組織腫脹例如，由于細(xì)菌毒素或環(huán)境毒素所導(dǎo)致的組織腫脹、和病灶性心律不齊?？梢杂帽景l(fā)明的其它藥物來(lái)保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生破壞性體積改變。包括過(guò)熱、局部缺血、毒素、炎癥、水腫、電解質(zhì)失調(diào)、葡萄糖水平增加、和糖尿病晚期并發(fā)癥在內(nèi)的因素中的一種或多種可以加速該類改變。還考慮治療與絲氨酸磷酸化作用增加有關(guān)的慢性心房纖維性顫動(dòng)。可以用另外的化合物作為用于預(yù)防、治療、緩解或降低下面情況的嚴(yán)重程度的藥物。還可以參見(jiàn)PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和PCT/US02/05773(WO 02/077017)申請(qǐng)。
本發(fā)明的治療方法一般包括給予需要進(jìn)行該類治療的個(gè)體如哺乳動(dòng)物并且特別是靈長(zhǎng)類動(dòng)物如人治療有效量的這里所公開(kāi)的半通道調(diào)節(jié)化合物中的一種或其組合。本發(fā)明的治療方法還包括給予需要進(jìn)行對(duì)這里所公開(kāi)的適應(yīng)癥進(jìn)行該類治療的個(gè)體，特別是哺乳動(dòng)物如人有效量的上面所定義的式I或II的化合物。
典型的個(gè)體包括患有一種或多種這里在下面部分A-R中所描述的病癥的哺乳動(dòng)物。
A.神經(jīng)組織公所周知的是，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中主要的免疫效應(yīng)器，其被許多觸發(fā)腦炎癥響應(yīng)的損傷所激活，所說(shuō)的損傷包括頭部損傷和局部缺血、神經(jīng)變性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、朊病毒病、和腦腫瘤?；罨男∩窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)移動(dòng)至CNS區(qū)域，在該區(qū)域中其發(fā)生增生并且逐漸除去細(xì)胞碎片。Eugenin等人表明小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以彼此通過(guò)被炎性細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的間隙連接來(lái)進(jìn)行交流(Eugenin，EA，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第98卷，4190-4195，2001)。這一點(diǎn)在下面的試驗(yàn)中得到了證明。在腦戳傷中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在幾天中逐漸積聚并形成在細(xì)胞間接觸面上常常表現(xiàn)出Cx43免疫反應(yīng)性的聚集體。在原代培養(yǎng)中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出蛋白質(zhì)印跡測(cè)定所測(cè)定的低水平的Cx43、彌散的細(xì)胞內(nèi)Cx43免疫反應(yīng)性、和低發(fā)生率的染料偶合。在用免疫促進(jìn)劑細(xì)菌脂多糖(LPS)或細(xì)胞因子干擾素-γ(INF-γ)或腫瘤壞死因子-α(TNF-α)進(jìn)行一次治療時(shí)并不會(huì)增加染料偶合的發(fā)生率。但是，用INF-γ加LPS進(jìn)行處理的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出被抗-TNF-α抗體的共同應(yīng)用所阻止的染料偶合的顯著增加，其表明TNF-α的釋放和自分泌作用。用INF-γ加TNF-α進(jìn)行的治療也可以大大增加染料偶合的發(fā)生率和具有細(xì)胞-細(xì)胞接觸易位的Cx43的Cx43水平。18-甘草次酸——一種間隙連接阻滯劑可以可逆性抑制細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的染料偶合。所培養(yǎng)的小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)Cx43并且在用細(xì)胞因子進(jìn)行處理時(shí)也形成染料偶合，但是得自純合的Cx43缺陷小鼠的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在用INF-γ加LPS或INF-γ加TNF-α進(jìn)行處理后并沒(méi)有形成顯著的染料偶合。
間隙連接蛋白、連接蛋白的強(qiáng)迫表達(dá)確保了間隙連接-缺陷的細(xì)胞系可以傳播細(xì)胞間的鈣波。Cotrina等人證明連接蛋白表達(dá)可以將由偶合差的細(xì)胞系，C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤、HeLa、和U373成膠質(zhì)細(xì)胞瘤分泌的ATP增加5-至15倍。這些觀察表明與連接蛋白表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞-至-細(xì)胞信號(hào)是由通過(guò)連接蛋白半通道所介導(dǎo)的增強(qiáng)的ATP釋放所產(chǎn)生的(Cotrina ML等人，ProcNatl Acad Sci USA 1998 Dec 22；95(26)15735-40；Cotrina等人，JNeurosci 2000 Apr 15；20(8)2835-44)。此外，在具有代謝應(yīng)激(例如，局部缺血)的情況中，得自星形膠質(zhì)細(xì)胞的半通道-介導(dǎo)的ATP釋放的情況可能會(huì)影響毗鄰神經(jīng)原并引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高，其又可能導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡和神經(jīng)原死亡。
例如，由于化合物1和化合物2對(duì)Cx43酪氨酸的磷酸化作用，給予這些化合物將有助于半通道關(guān)閉并促進(jìn)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間通訊，從而增加或加速了上述疾病(腦炎性反應(yīng)，包括腦損傷和局部缺血、神經(jīng)變性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、朊病毒病、和腦腫瘤)中的“愈合”過(guò)程。此外，其期望半通道的關(guān)閉將阻止ATP釋放并從而降低了原發(fā)性損傷的擴(kuò)張。
B.肺組織肺泡細(xì)胞通過(guò)肺泡細(xì)胞間的間隙連接進(jìn)行的肺泡的細(xì)胞間通訊對(duì)于離子遷移的傳播、機(jī)械化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)和表面因子的分泌而言都是很重要的(Ashino Y，等人，(AmJPhysiol Lung Mol Physiol 2000；279L5-L13))。在肺的肺泡區(qū)域的急性和慢性炎性損害后的體內(nèi)修復(fù)包括作為細(xì)胞外基質(zhì)的一部分的纖連蛋白的形成(Charash WE，等人(Am RevRespir Dis 1993；148467-476)和Torikata C，等人(Lab Invest1985；52399-408))。肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)研究已經(jīng)證明間隙連接數(shù)目的增加與細(xì)胞外纖連蛋白濃度的增加平行(Alford AI，Rannels DE.(Am.JPhysiol Lung Cell Mol Physiol 2001；280；L680-L688))。體內(nèi)動(dòng)物研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在二氧化氮在肺泡組織、終末細(xì)支氣管壁、肺泡小管和細(xì)支氣管周小泡中都誘發(fā)了嚴(yán)重的肺炎后，間隙連接數(shù)目降低。這些結(jié)果是劑量依賴性的。但是，如果用牛磺酸進(jìn)行預(yù)處理，則與產(chǎn)生炎性反應(yīng)顯著降低相平行地防止了這種間隙連接的損失。在對(duì)大鼠的肺進(jìn)行放療和用化療化合物博萊霉素進(jìn)行治療后，看到了相似的結(jié)果。
因此，在肺組織中維持間隙連接通訊對(duì)于防止肺纖維化而言是很重要的，并且作為對(duì)炎性進(jìn)程、各種毒性刺激物如氣體吸入、氣管阻塞物和放療的反應(yīng)，看到連接蛋白數(shù)量降低。在肺出現(xiàn)例如肺癌、乳癌治療、甲狀腺和食管癌的情況中，在進(jìn)行治療性放療之前，表明可以用可以磷酸化Cx43酪氨酸殘基并可以促進(jìn)半通道關(guān)閉和/或間隙連接開(kāi)放或間隙連接通訊的本發(fā)明的化合物進(jìn)行預(yù)處理。
用可以促進(jìn)或介導(dǎo)半通道關(guān)閉和/或間隙連接開(kāi)放的化合物進(jìn)行治療將進(jìn)一步防止肺氣腫、石棉肺、矽肺、肺纖維化、肺炎、藥物誘導(dǎo)的肺纖維化中和與肺毒性氣體如二氧化氮接觸的患者中的肺功能衰退。優(yōu)選地在這些情況的常規(guī)治療中加入該治療。這些化合物可以被口服給藥、胃腸外給藥、鼻給藥、或通過(guò)肺吸入來(lái)進(jìn)行給藥。
C.平滑肌1.血管系統(tǒng)通過(guò)間隙連接通道進(jìn)行的細(xì)胞間通訊在整個(gè)血管樹(shù)血管肌細(xì)胞緊張度調(diào)節(jié)和調(diào)控中起著基礎(chǔ)性的作用(Christ GJ等人，Circ Res.1996；79631-646)。間隙連接通訊另一種重要的作用是在血管松弛反應(yīng)中所涉及的平滑肌細(xì)胞中的超極化的傳播(Benny JL等人，PhysiolHeart Circ Physiol 1994；266H1465-72))。
內(nèi)皮的特定功能需要單層中的內(nèi)皮細(xì)胞間和內(nèi)皮以及存在于血管壁中的其它細(xì)胞間的間隙連接細(xì)胞間通訊。在一些研究中已經(jīng)證明了在冠狀毛細(xì)管以及所有其它血管中通過(guò)間隙連接進(jìn)行的這些不同細(xì)胞類型之間的通訊。還已經(jīng)證明在在適應(yīng)動(dòng)脈形成中涉及的跡象(CaiW-J等人，J Mol Cell Cardiol 2001；33957-67)，Wang H-Z等人，Am JPhysiol Cell Physiol.2001；281C75-88)，Schuster A等人，Am J PhysiolHeart Circ Physiol.2001；280H1088-96))。
在其中當(dāng)在飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥(hypercholestrolemic)損害中內(nèi)皮單層被破裂的不同血管病理生理學(xué)(patophysiological)情況中，血管平滑肌中的間隙連接交流被降低(Polacek D等人.J Vasc Res1997；3419-30)。在靜脈停滯過(guò)程中和當(dāng)形成血栓性靜脈炎時(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞層上看到了損傷。Kwak BR等人，Molec Biol Cell 2001；12831-845已經(jīng)清楚地證明了間隙連接通訊可協(xié)調(diào)內(nèi)皮修復(fù)期間的細(xì)胞移行并且對(duì)于血管形成期間的毛細(xì)管萌芽而言也很重要。
用本發(fā)明可以促進(jìn)半通道關(guān)閉和/或間隙連接通訊的化合物進(jìn)行的治療將改善受影響的血管區(qū)域中受損的細(xì)胞間通訊并且在器官局部缺血，例如claudicatio intermittns和心肌梗死中特別有用。
但是，在大鼠頸動(dòng)脈中囊(baloon)導(dǎo)管損傷后，血管愈合過(guò)程的特征為間隙連接通訊增加。(Yeh HI等人Arterioscle Thromb VascBiol 1997；173174-84)。將在囊干預(yù)前給予本發(fā)明適宜的化合物并且其優(yōu)選地是這種情況常規(guī)醫(yī)學(xué)治療的附加治療。該化合物的給藥優(yōu)選地是胃腸外給藥。可以在囊導(dǎo)管損傷前、損傷后的不同時(shí)間在組織樣品中對(duì)其作用進(jìn)行試驗(yàn)。用常規(guī)的顯微鏡檢查可以看到內(nèi)皮表面愈合加速。還將發(fā)現(xiàn)間隙連接通訊得到了改善。還可參見(jiàn)Arterioscle ThrombVasc Biol 1997；173174-84)。
2.勃起機(jī)能障礙在海綿體中，通過(guò)間隙連接建立了合胞體的細(xì)胞網(wǎng)，該細(xì)胞網(wǎng)對(duì)于勃起功能而言很關(guān)鍵并且可以確保陰莖的體和動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞可以以均一和協(xié)調(diào)的方式做出響應(yīng)。(Christ GJ.(Int JImpot Res.2000；12增刊4S15-25)，Melman A，ChristJC.(Urolog ClinNorthAmerica.2001；28217-31))。在糖尿病、動(dòng)脈硬化、不同的神經(jīng)病學(xué)疾病和許多慢性疾病中可以看到勃起功能失調(diào)。從糖尿病研究來(lái)看，雖然沒(méi)有確立通過(guò)間隙連接進(jìn)行的功能細(xì)胞間的通訊，但是在神經(jīng)支配和細(xì)胞間偶合之間的反相相關(guān)指向了體環(huán)境的潛在的功能塑性。
用促進(jìn)半通道關(guān)閉和/或間隙連接開(kāi)放的化合物進(jìn)行治療將改善通過(guò)間隙連接進(jìn)行的通訊，從而使海綿體中平滑肌細(xì)胞和脈管之間的復(fù)雜協(xié)調(diào)正?；?。
可以如Rehman J，等人，(Am JPhysiol 1997；272H1960-71)所述的那樣在用鏈脲霉素(35mg/kg i.p.)在大鼠(8周大)體內(nèi)誘導(dǎo)糖尿病后進(jìn)行該化合物的勃起功能體內(nèi)藥理學(xué)試驗(yàn)。在不同劑量不同半通道調(diào)節(jié)化合物的局部或全身給藥過(guò)程中用由相同研究人員所描述的測(cè)量和技術(shù)對(duì)陰莖反射和海綿體內(nèi)的壓力進(jìn)行測(cè)量?？梢钥吹疥幥o反射和海綿體內(nèi)的壓力增加25％或更多。
可以通過(guò)皮下注射形式的陰莖體局部給藥或通過(guò)口服給藥來(lái)對(duì)勃起機(jī)能障礙進(jìn)行治療。該治療可以是單一治療或可以是這種情況常規(guī)治療的附加治療。
3.失禁尿囊中的平滑肌的特征為階段性收縮并表現(xiàn)出自發(fā)性的階段性收縮。但是，健康情況下的膀胱能包含數(shù)百毫升的尿而不表現(xiàn)出膀胱內(nèi)壓力的增加。與正常的膀胱相反，在尿失禁中所涉及不穩(wěn)定的膀胱形成膀胱內(nèi)壓力自發(fā)性增加(TurnerWH，Brading AF.(PharmacolTherap.1997；7577-110)。與胃腸道平滑肌相比，膀胱平滑肌不會(huì)自動(dòng)產(chǎn)生協(xié)調(diào)性收縮(Stevens RJ，等人，(Am JPhysiol.199；2777C448-60)，Hashitani H，等人(JPhysiol.2001；530273-86))。已經(jīng)證明膀胱平滑肌細(xì)胞之間通過(guò)間隙連接進(jìn)行電和形態(tài)學(xué)交流(Hashitani H等人(JPhysiol.2001；530273-86)，Wang H-Z等人(Urology.2001；增刊6A111))。通過(guò)特定的通訊抑制試驗(yàn)已經(jīng)證明了這些間隙連接的重要性。膀胱平滑肌中自動(dòng)激發(fā)的波通過(guò)間隙連接進(jìn)行傳播。
因此，可以通過(guò)用半通道關(guān)閉化合物或間隙連接開(kāi)放劑進(jìn)行治療來(lái)調(diào)節(jié)不受控制的急促失禁。可以胃腸外、口服給藥或者可以給藥于尿囊內(nèi)。該給藥優(yōu)選地作為用使尿囊內(nèi)肌肉收縮正常化的藥物進(jìn)行治療的附加治療。
因?yàn)榇嬖谟谙骂M下腺管、urether、膽管、胰腺管、淚小管中的肌上皮細(xì)胞用間隙連接相連，所以細(xì)胞間通訊對(duì)于肌上皮細(xì)胞收縮功能的同步而言是必需的(Taugner R，Schiller A.(Cell TissueRes.1980；20665-72)?？梢酝ㄟ^(guò)用半通道關(guān)閉化合物或間隙連接開(kāi)放劑胃腸外或口服給藥進(jìn)行治療來(lái)使這些管中失調(diào)的收縮性正?；?。
D.治愈可以用如Yeh HI等人(Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997；173174-84)所述那樣建立的實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)用半通道關(guān)閉劑或間隙連接開(kāi)放劑，如化合物1和化合物2進(jìn)行的治療的預(yù)防作用進(jìn)行試驗(yàn)?？梢栽谀腋深A(yù)之前給予化合物1或化合物2，其劑量范圍為10-11至10-8的范圍，其將取決于化合物的生物動(dòng)力學(xué)，例如在上面所述的氯化鈣誘導(dǎo)的心律不齊模型中所測(cè)定的動(dòng)力學(xué)?？梢栽谀覍?dǎo)管損傷前和損傷后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)組織進(jìn)行取樣。用常規(guī)顯微鏡檢查可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮表面愈合加快。該化合物可以被例如胃腸外給藥。
愈合進(jìn)行一系列從止血(血凝固)開(kāi)始的重疊過(guò)程。愈合過(guò)程的第二階段是炎性反應(yīng)的級(jí)聯(lián)，在所說(shuō)的炎性反應(yīng)中小噬細(xì)胞在傷口旁邊積聚并且開(kāi)始形成除其它組分外還包含成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的肉芽組織。然后上皮細(xì)胞開(kāi)始從傷口邊緣進(jìn)行移動(dòng)從而覆蓋該創(chuàng)傷區(qū)域。還涉及從正常組織向傷口中進(jìn)行的毛細(xì)管噴涌以確保營(yíng)養(yǎng)物、氧氣和不同細(xì)胞的供應(yīng)。所有的細(xì)胞和毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞都具有通過(guò)間隙連接進(jìn)行的活躍的細(xì)胞間通訊(AbdullahKM，等人(內(nèi)分泌.1999；1035-41)。在具有壞死組織的傷口、糖尿病、動(dòng)脈硬化、手術(shù)創(chuàng)傷、水腫、感染、燒傷和靜脈機(jī)能不全中常常看到的氧供應(yīng)量低和/或自由基濃度高的區(qū)域的間隙連接通訊降低(Nagy JI，等人Cell Growth Diff1996；7745-51))。
用半通道關(guān)閉化合物或間隙連接開(kāi)放劑進(jìn)行治療將確保認(rèn)為在復(fù)雜的修復(fù)過(guò)程中起重要作用的不同細(xì)胞間的最大程度的間隙連接通訊，從而改善了傷口修復(fù)。該化合物可以被局部給藥、全身給藥或口服給藥。
E.糖尿病視網(wǎng)膜病通過(guò)確定血流速度的改變(Bursell S-V等人(Curr Eye Res.1992；11287-95)、血-視網(wǎng)膜屏障的破裂(Cunha-Vaz JG等人，(BrJOphthalmol 1975；59649-56)，Do Carmo A等人(Exp Eye Res.1998；67569-75))和/或自體調(diào)節(jié)的損失(Kohner EM，Patel V，RassamSMB.(Diabetes 1995；44603-607))可以在該疾病開(kāi)始后十分早地對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病進(jìn)行診斷。通過(guò)同時(shí)使用示蹤劑轉(zhuǎn)運(yùn)和雙細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，Oku H等人(Invest Ophthalmol Vis Sci.2001；421915-1920)已經(jīng)證明了廣泛的細(xì)胞-至-細(xì)胞偶合。間隙連接途徑的關(guān)閉干擾了視網(wǎng)膜微管的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)并有助于產(chǎn)生糖尿病性視網(wǎng)膜血管機(jī)能障礙。ZhouZY等人(Neuroscience.2001；102959-67)進(jìn)一步證明當(dāng)供給gluthation時(shí)在視網(wǎng)膜間隙連接的解偶聯(lián)和復(fù)偶聯(lián)中涉及活性氧。
可以用上面所描述的鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型對(duì)半通道關(guān)閉劑對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病的作用進(jìn)行體外研究。如Oku H，等人(InvestOphthalmol Vis Sci.2001；421915-1920)所述的那樣將新分離出來(lái)的視網(wǎng)膜微管(Sakagami K等人J Physiol(Lond).1999；521637-50)轉(zhuǎn)移到蓋玻片上。在這種制劑中，用染料或示蹤劑對(duì)血管壁細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊進(jìn)行測(cè)量。可以對(duì)本發(fā)明的化合物例如間隙開(kāi)放劑化合物1或2在10-10-10-7M的不同濃度范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，在糖尿病視網(wǎng)膜中將發(fā)現(xiàn)與基準(zhǔn)相比，細(xì)胞間通訊顯著增加。當(dāng)與對(duì)照(健康的動(dòng)物)相比時(shí)可以看到相似的改善?？梢酝ㄟ^(guò)全身、局部或口服來(lái)進(jìn)行治療。該治療優(yōu)選地是常規(guī)抗糖尿病治療的附加治療。
不僅糖尿病視網(wǎng)膜病，而且視網(wǎng)膜中的其它血管異常例如動(dòng)脈硬化也可以從用有助于Cx酪氨酸磷酸化的化合物進(jìn)行的治療而產(chǎn)生的半通道關(guān)閉增加或間隙連接通訊的改善而獲益?；衔镆话惚晃改c外給藥。
F.心臟病癥1.心房-心室(AV)阻滯心臟av結(jié)中的細(xì)胞間通訊是通過(guò)間隙連接被維持的。功能降低導(dǎo)致傳導(dǎo)降低，并且可導(dǎo)致整個(gè)a-v阻滯。
在急性心肌梗死、局部缺血性心臟病、洋地黃中毒、鈣通道阻滯劑中毒中可以看到AV阻滯，半通道關(guān)閉化合物能改善av傳導(dǎo)。半通道關(guān)閉化合物應(yīng)被胃腸外或口服給藥。
2.心房纖維性顫動(dòng)Nao等人2001已經(jīng)發(fā)現(xiàn)患有慢性心房纖維性顫動(dòng)(AF)的患者的心肌細(xì)胞中連接蛋白40的絲氨酸磷酸化作用降低。已知連接蛋白的絲氨酸磷酸化作用降低與可導(dǎo)致AF的細(xì)胞的解偶聯(lián)有關(guān)。如果這種慢性AF情況的特征還有連接蛋白的酪氨酸磷酸化作用降低，則用化合物如這里的化合物1或2進(jìn)行治療可增加酪氨酸磷酸化作用、關(guān)閉半通道、打開(kāi)間隙連接通道并除去AF的原因。
3.局部缺血/再灌注性損傷在局部缺血過(guò)程中，心臟出現(xiàn)代謝應(yīng)激，其造成細(xì)胞膨脹，該細(xì)胞膨脹又增加了組織壓力并降低了局部缺血邊界區(qū)域組織的灌注。認(rèn)為局部缺血邊界區(qū)域的灌注降低有助于梗死的逐漸擴(kuò)展，其與心臟功能的進(jìn)一步損害有關(guān)。如實(shí)施例7和8所示的那樣，化合物1預(yù)防了局部缺血過(guò)程中的細(xì)胞膨脹，降低了梗死的大小并防止了心肌(mypocardial)梗死后心臟功能的損傷。
此外，通過(guò)給予溶栓劑或通過(guò)經(jīng)皮的經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)，在心肌梗死患者體內(nèi)再建了冠狀灌注。雖然血流的恢復(fù)是心肌獲救的先決條件，但是再灌注本身也可以導(dǎo)致除由局部缺血單獨(dú)產(chǎn)生的組織損傷之外的另外的組織損傷——這被稱為“再灌注性損傷”。提出了許多再灌注性損傷的機(jī)理，包括氧自由基超載、嗜中性白細(xì)胞介導(dǎo)的心肌損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、和滲透環(huán)境的改變(Wang等人，Cardiovasc Res.2002 Ju1；55(1)25-37.Review)。
公認(rèn)體液的克分子滲透壓濃度受到了嚴(yán)格控制，從而使得大多數(shù)細(xì)胞在正常情況下不會(huì)經(jīng)歷滲透壓的變化，但是，在病理學(xué)狀態(tài)如局部缺血、膿毒性休克、糖尿病性昏迷中滲透壓可能會(huì)發(fā)生變化?？朔肿訚B透壓濃度改變的主要影響是急劇改變細(xì)胞體積。如果細(xì)胞周圍的克分子滲透壓濃度降低，則細(xì)胞膨脹，如果增加，則其萎縮。為了耐受克分子滲透壓濃度的變化，細(xì)胞形成了被滲透性激發(fā)所激活的體積調(diào)節(jié)機(jī)理以將細(xì)胞體積正常化并維持正常功能。在心臟中，在當(dāng)代謝物如乳酸鹽在細(xì)胞內(nèi)積聚并在細(xì)胞外達(dá)到一定程度時(shí)出現(xiàn)滲透性應(yīng)激并且造成細(xì)胞膨脹。在再灌注時(shí)，當(dāng)高滲的細(xì)胞外環(huán)境被正常滲透壓的血液替代時(shí)這種膨脹進(jìn)一步加劇，其甚至能造成心臟細(xì)胞膜破裂(Wright AR，Rees SA.Pharmacol Ther.1998 Oct；80(1)89-121.Review)。因此，認(rèn)為本發(fā)明所選擇的化合物可以防止再灌注期間的心肌損傷，例如可以通過(guò)與實(shí)施例7中所述的作用相似的機(jī)理來(lái)防止損傷(圖9A)。
此外，已經(jīng)報(bào)道了在常用的PCTA方法中，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂，其在PTCA部位的遠(yuǎn)側(cè)微循環(huán)中造成了微栓塞，其與心衰進(jìn)程加快和死亡率增加有關(guān)Henriques JP等人.Eur Heart J 2002 Jul；23(14)1112-7)。如實(shí)施例7和8所示的那樣，化合物1防止了局部缺血期間的細(xì)胞膨脹、降低了梗死大小并防止了心肌梗死后心臟功能的損害，并且化合物的這些性質(zhì)將降低再灌注期間的損傷。
因此，本發(fā)明提供了一種對(duì)需要該類治療的哺乳動(dòng)物的組織和器官進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物。短語(yǔ)“細(xì)胞保護(hù)”指的是降低、預(yù)防和緩解與不希望的細(xì)胞膨脹有關(guān)的癥狀。將從該方法獲益的特定組織和器官包括狹窄的或者受纖維囊(fiborous capsule)影響的這些組織和器官如心臟或腎。還包括與骨有關(guān)的組織如腦、脊髓和骨髓。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括使哺乳動(dòng)物的該組織或器官出現(xiàn)局部缺血情況如這里所描述的那些情況。一個(gè)實(shí)例是其中局部缺血與有害的心肌細(xì)胞膨脹有關(guān)的心梗(心臟病發(fā)作)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)給予哺乳動(dòng)物Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)和Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物2)中的至少一種來(lái)降低或避免該類膨脹。
正如所討論的那樣，本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療再灌注性損傷的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物。在更特定的實(shí)施方案中，該方法還包括哺乳動(dòng)物心臟出現(xiàn)梗死的情況。根據(jù)該方法，其希望盡可能快地建立冠狀動(dòng)脈灌注。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括給予出現(xiàn)梗死的心臟溶栓劑(例如組織纖溶酶原活化劑(“TPA”))或進(jìn)行冠狀血管成形術(shù)以幫助進(jìn)行冠狀動(dòng)脈的灌注。在一個(gè)實(shí)施方案中，該化合物是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)和Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物2)中的至少一種。
G.免疫學(xué)細(xì)胞成熟細(xì)胞-至-細(xì)胞的相互作用對(duì)于淋巴細(xì)胞的成熟和活化而言是很重要的。膜分子廣泛的激動(dòng)(rage)確保了細(xì)胞間的粘合并確保了免疫系統(tǒng)中細(xì)胞遷移和活化過(guò)程中細(xì)胞-細(xì)胞的信號(hào)傳輸。循環(huán)的人T、B和NK淋巴細(xì)胞表達(dá)Cx43并且已經(jīng)用前面所述的染料法證明了這些細(xì)胞之間的有效的間隙連接。還證明了細(xì)胞間間隙連接的偶聯(lián)的降低顯著降低了IgM、IgG和IgA的分泌，其表明穿越間隙連接的細(xì)胞間的信號(hào)傳輸是經(jīng)歷免疫系統(tǒng)中代謝協(xié)作機(jī)理的重要組成(Oviedo-Orta E，等人(Immunology.2000；99578-90)，Oviedo-Orta E，等人(FASEB.2001；15768-774))。
在亞慢性或慢性炎癥中，免疫球蛋白合成的局部增加令人希望地獨(dú)立于aethiology。在炎癥中的組織常常與正常的健康組織不同并且低的氧張力產(chǎn)生了細(xì)胞間間隙連接通訊的解偶聯(lián)。在一些不同的細(xì)胞系統(tǒng)中已經(jīng)證明了低氧對(duì)于GJIC解偶聯(lián)而言的重要性，其表明氧張力是GJIC的普通調(diào)節(jié)劑。所說(shuō)的解偶聯(lián)是間隙連接通道中連接蛋白的酪氨酸和/或絲氨酸和/或蘇氨酸磷酸化作用改變的結(jié)果，本發(fā)明化合物如這里的化合物1或2的給藥將抵消這種作用、關(guān)閉半通道并恢復(fù)GJIC。
H.改善GJIC主要有兩種方法可以維持GJIC——保持間隙連接通道的開(kāi)放或促進(jìn)半通道的對(duì)接。在特征為存在局部缺血情況的疾病狀態(tài)的治療或預(yù)防中，優(yōu)選或推薦同時(shí)使用這兩種方法。
在新生大鼠心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)中，剝奪氧和葡萄糖可以將去甲腎上腺素誘導(dǎo)的磷酸肌醇(IP)興奮周轉(zhuǎn)降低至正常大氣壓和營(yíng)養(yǎng)情況下的水平的約50％。已經(jīng)表明該間隙連接改性劑化合物1可以通過(guò)將PI周轉(zhuǎn)升高至正常水平的約90％而將這種缺氧和葡萄糖期間受損的去甲腎上腺素-誘導(dǎo)的PI周轉(zhuǎn)正?；?。此外，已經(jīng)表明化合物1不會(huì)改變正常大氣壓和營(yíng)養(yǎng)情況過(guò)程中去甲腎上腺素-誘導(dǎo)的PI周轉(zhuǎn)水平(Meier，E和Beck，MM2001 International Gap JunctionConference，Aug 4-9，2001，Hawaii，USA，文摘號(hào)132)。同樣，在進(jìn)行培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞培養(yǎng)物和成骨細(xì)胞的大鼠骨肉瘤細(xì)胞系中，在注射Lucifer Yellow后用染料轉(zhuǎn)移來(lái)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)低氧降低了細(xì)胞內(nèi)的鈣波傳播?？梢酝ㄟ^(guò)用化合物1進(jìn)行治療來(lái)完全逆轉(zhuǎn)這種降低(Teilmann，SC，等人，2001 International Gap Junction Conference，Aug 4-9，2001，Hawaii，USA，文摘號(hào)176)。
例如，由于炎癥期間的細(xì)胞解偶聯(lián)，可以關(guān)閉半通道和打開(kāi)間隙連接的化合物將可以改善炎癥期間免疫球蛋白的合成。
I.外周神經(jīng)病和神經(jīng)病性疼痛據(jù)報(bào)道，在糖尿病中、透析期間、肝硬化和許多其它情況中看到的外周神經(jīng)病和疼痛既涉及體干神經(jīng)又涉及植物性神經(jīng)。正在對(duì)各種情況中的外周神經(jīng)損傷的確切機(jī)理進(jìn)行研究，但是已經(jīng)對(duì)神經(jīng)末端破壞、傳導(dǎo)降低、脫髓鞘作用和炎癥反應(yīng)增加進(jìn)行了描述。對(duì)于所確定試驗(yàn)中各種情況而言通常發(fā)現(xiàn)自由基增加、一氧化氮增加、氧氣應(yīng)激和缺乏自由基清除劑并且記錄了間隙連接通訊的降低(Pitre DA，等人(Neurosci Lett.2001；30367-71)，Bolanos JP，MedinaJM.(JNeurochem.1996；662019-9)，Low PA，Nickander，KK.(Diabetes.1991；40873-7)，Levy D，等人(Neurosci Lett.1999；260207-9)，Bruzzone R，Ressot C.JEur Neurosci.1997；91-6))。因此，通過(guò)將半通道連接蛋白磷酸化來(lái)幫助關(guān)閉半通道的本發(fā)明的化合物在外周神經(jīng)病的治療中是有益的。一般進(jìn)行胃腸外給藥。
J.聽(tīng)力不足噪音誘導(dǎo)的聽(tīng)力喪失、已知與自由基的產(chǎn)生有關(guān)的老年性耳聾都與得自耳蝸中的Corti’s器官的Hensen細(xì)胞和Deiters細(xì)胞間的間隙連接偶合的抑制有關(guān)(TodtI，等人，(JMembran Biol.2001；181107-114)，Blasits S，等人，(Phlugers Arch.2000；440710-12)Lagostena L，等人，(JPhysiol.2001；531693-707))。這些支撐耳蝸細(xì)胞間的間隙連接通訊為感覺(jué)細(xì)胞提供了重要的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定并且從而為外毛細(xì)胞提供了正常的神經(jīng)活性(Johnstone BM，等人(JPhysiol 1989；40877-92))。這種通訊在氧化應(yīng)激期間被破壞(Todt I等人(J MembraneBiol.2001；181107-114)。當(dāng)用可以增加連接蛋白半通道中酪氨酸殘基磷酸化作用(關(guān)閉半通道)并可以維持支撐細(xì)胞中間隙連接通訊的化合物進(jìn)行處理時(shí)將防止獲得性或年齡依賴性聽(tīng)力喪失。本發(fā)明的適宜化合物可以被胃腸外給藥。
前庭器官暗細(xì)胞區(qū)域中的黑素細(xì)胞可以通過(guò)間隙連接大量進(jìn)行通訊，并且可以在內(nèi)淋巴和外淋巴間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，并且對(duì)于維持內(nèi)耳中微環(huán)境的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而言也很重要(Masuda M，等人(Anat Rec.2001；262；137-146))。在特征為頭暈和聽(tīng)力下降的各種臨床情況中涉及內(nèi)淋巴水腫。間隙連接通訊能力降低在通過(guò)特定類型的運(yùn)輸器調(diào)節(jié)一些最初分泌或排泄物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中也很重要。
K.年齡依賴性貧血和骨髓移植造血微環(huán)境的造血祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間是否存在功能性間隙連接許多年來(lái)一直有爭(zhēng)議，但是現(xiàn)在研究證明存在人間隙連接通訊(Rosendaal M，等人，Tissue Cell.1991；23457-470)，Dürig J，等人(BritJHaematol.2000；111416-25))。還已經(jīng)證明該通訊是雙相有利的假說(shuō)，基質(zhì)細(xì)胞不僅控制造血祖細(xì)胞的增生行為，而且還可以通過(guò)不成熟的造血細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)其功能狀態(tài)(Gupta P，等人(Blood.1998；913724-3733))。
隨著年齡的增加，該造血組織的功能性降低并且在老年人中常?？吹截氀?。在血液學(xué)惡性腫瘤中和用化療劑進(jìn)行治療后也可以發(fā)現(xiàn)造血組織能力降低。用得自供體的骨髓移植來(lái)防止各類血細(xì)胞減少。
使用用高劑量環(huán)磷酰胺進(jìn)行了預(yù)處理的大鼠對(duì)有助于半通道關(guān)閉和/或促進(jìn)間隙連接通訊的本發(fā)明化合物的作用進(jìn)行研究。在這些動(dòng)物中，骨髓停止產(chǎn)生成熟的造血細(xì)胞。在使用環(huán)磷酰胺后，與未進(jìn)行預(yù)處理的動(dòng)物相比，使用劑量為約100μL 10-10M至約10-8M的化合物1，在用連接蛋白酪氨酸磷酸化化合物1進(jìn)行了預(yù)處理的動(dòng)物中，不同時(shí)間間隔的網(wǎng)狀細(xì)胞數(shù)目顯著更高。本發(fā)明的適宜化合物可被胃腸外給藥。
L.腦垂體和下丘腦機(jī)能減退得自垂體前葉腺的激素在數(shù)分鐘、小時(shí)、天和季節(jié)中表現(xiàn)出24小時(shí)晝夜節(jié)律分泌。神經(jīng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)大多數(shù)晝夜節(jié)律的部分位于被稱為視交叉上核的丘腦下部中的結(jié)構(gòu)對(duì)中。在這種中心中，這種生物學(xué)時(shí)鐘是各細(xì)胞固有的。但是，協(xié)調(diào)的電活性是通過(guò)間隙連接通訊被介導(dǎo)到毗鄰細(xì)胞中的。(Colwell CS.(JNeurobiol.2000；43379-88))。因?yàn)榇贵w前葉也缺乏直接神經(jīng)分布，所以該腺體內(nèi)間隙連接-介導(dǎo)的細(xì)胞-至-細(xì)胞通訊對(duì)于可確保適宜的和定時(shí)的激素分泌所需的充分的細(xì)胞-至-細(xì)胞協(xié)調(diào)和同步而言是必需的。(Vitale ML等人(BiolReporo.2001；64625-633))。Guerineau NC等人(J BiolChem.1998；27310389-95)推斷自發(fā)活化的內(nèi)分泌細(xì)胞是單一單元或排列在分散在垂體前葉腺中的同步的間隙連接-偶合的集合中。自發(fā)興奮細(xì)胞之間的同步可以幫助形成基礎(chǔ)分泌的模式。在下丘腦刺激激素控制下，從垂體前葉腺中合成生長(zhǎng)激素、催乳素、腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、和促性腺激素。因此，在一種軸內(nèi)的復(fù)雜的下丘腦-腦垂體-內(nèi)分泌腺的dysrhythm機(jī)理中的一種還涉及通過(guò)間隙連接降低通訊。該疾病是尿崩癥、hypogonadotrope hypogonadism、粘液性水腫、腎上腺類皮質(zhì)激素機(jī)能減退、和侏儒癥。用本發(fā)明適宜化合物，優(yōu)選地為間隙連接開(kāi)放劑進(jìn)行治療可以改善這些癥狀。
丘腦下部視交叉上核中的神經(jīng)元也依賴于最佳的間隙連接通訊。在上述軸中，在這種區(qū)域中具有作用模式的間隙連接開(kāi)放劑也對(duì)患有晝夜節(jié)律失調(diào)的患者有益(Shinohara K等人(NeusosciLett.2000；286107-10))。
M.腎血管高血壓和腎毒性腎和內(nèi)皮的特異性間隙連接廣泛分布于存在于腎中的包括腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞毛細(xì)管和近腎小球(juxaglomerular)小動(dòng)脈在內(nèi)的腎小球、小管和脈管系統(tǒng)中(Haefliger J-A，等人(KidneyInt.2001；60190-201))。在該項(xiàng)研究中，作者證明存在連接入球小動(dòng)脈的腎素分泌細(xì)胞的間隙連接。間隙連接的作用可能有助于血負(fù)荷信號(hào)如由血壓增加所激發(fā)的信號(hào)的檢測(cè)和傳播。在腎中，該類信號(hào)需要通過(guò)入球小動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌刺激并被傳遞到腎素分泌細(xì)胞中。因此，間隙連接通訊在形成相互連接的近腎小球裝置中起著重要的作用。間隙連接通道從開(kāi)放到關(guān)閉的迅速轉(zhuǎn)變進(jìn)一步意味著易于對(duì)局部改變發(fā)生響應(yīng)，從而確保了使腎小球和小管功能以及腎素分泌與生理學(xué)需要相匹配所需的連續(xù)反饋。特征為腎間隙連接通訊受損的疾病將從用本發(fā)明化合物口服給藥或胃腸外給藥進(jìn)行的治療獲益，所說(shuō)的本發(fā)明的化合物優(yōu)選的是特定的間隙連接開(kāi)放劑。
重金屬可以使腎中毒并造成腎損傷。已經(jīng)證明得自大鼠近小管的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中的有毒的金屬鎘(Fukumoto M，等人(Life Sciences.2001；69247-54))以及汞(Yoshida M，等人(Arch Toxicol.1998；72192-96))使間隙連接解偶聯(lián)并且兩組都表明腎機(jī)能障礙與細(xì)胞間通訊下降有關(guān)。用連接蛋白酪氨酸磷酸化化合物對(duì)重金屬中毒進(jìn)行治療將降低組織損害并防止?jié)u進(jìn)性組織毀壞。
可以在得自小管細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行體外試驗(yàn)，并且當(dāng)與重金屬相接觸時(shí)對(duì)預(yù)防間隙連接解偶聯(lián)的化合物(濃度為約10-10-10-7M的化合物1或化合物2)進(jìn)行了試驗(yàn)。用前面所述的Lucifer染料法對(duì)間隙連接通訊進(jìn)行了試驗(yàn)。
在用重金屬進(jìn)行長(zhǎng)期處理前和處理后的不同時(shí)間點(diǎn)，在將重金屬全身給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠)后，用3H-胰島素作為腎小球過(guò)濾速度的清除標(biāo)記，用14C-標(biāo)記的四乙基銨作為腎血流的清除標(biāo)記并用鋰作為近小管功能的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行測(cè)量(Petersen JS，等人，J.Pharmacol.Esp.Ther.1991，2581-7)。當(dāng)在處理后看到腎功能受損和腎功能參數(shù)(腎小球?yàn)V過(guò)速度和血壓)發(fā)生顯著的改變時(shí)，開(kāi)始用本發(fā)明的特定化合物如化合物1進(jìn)行長(zhǎng)期治療。適宜化合物被胃腸外給藥。
在腎功能方面誘發(fā)了顯著的非特異性慢性變化的非感染性炎癥以及不同微生物感染的特征還在于腎小球?yàn)V過(guò)速率降低、電解質(zhì)和水的排泄降低和血壓變化。這些癥狀中的一些也可以用特異的連接蛋白酪氨酸磷酸化化合物進(jìn)行治療，并且癥狀將降低。
N.牙齒的形成和改變Murakami S和Muramatsu T(Anat Embryol.2001；203367-374)以前的研究確證了成牙質(zhì)細(xì)胞間存在間隙連接通訊和細(xì)胞活性是通過(guò)這些細(xì)胞間的橋梁來(lái)進(jìn)行協(xié)調(diào)的(Iguchi Y，等人(Arch Oral Biol.1984；29489-497))，但是其最近的研究還證明了在牙齒形成早期(前牙質(zhì)細(xì)胞)以及這些年輕和老年的成牙質(zhì)細(xì)胞中的成牙質(zhì)細(xì)胞中存在間隙連接通訊。成牙質(zhì)細(xì)胞下的髓細(xì)胞也具有間隙連接。這些發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞間的間隙連接通訊在牙齒形成期間和牙齒改型和有蟲(chóng)(wormed)期間都很重要。
用本發(fā)明的連接蛋白磷酸化化合物如化合物2進(jìn)行的治療將可以使牙齒受干擾的發(fā)育正常化，可以對(duì)所說(shuō)化合物對(duì)成牙質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞間通訊的作用進(jìn)行體外試驗(yàn)，該測(cè)定基本可以與這里所述的成骨細(xì)胞測(cè)定相提并論。治療還可以促進(jìn)牙齒的成型并且可以使牙齒更耐受齲。
O.干細(xì)胞Lumelsky等人(2001)由小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生了表達(dá)胰島素和其它胰腺內(nèi)分泌激素的細(xì)胞。見(jiàn)Nadya Lumelsky等人，Differentiation ofEmbryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similar toPancreatic Islets.Science，292，1389-1394，2001)。該細(xì)胞自身集合形成在局部解剖學(xué)結(jié)構(gòu)上與正常的胰島相似的其中胰腺細(xì)胞類型與神經(jīng)原緊密相連的三維簇。葡萄糖通過(guò)與那些體內(nèi)所用機(jī)理相似的機(jī)理觸發(fā)了胰島素從這些細(xì)胞簇中的釋放。當(dāng)被注射到糖尿病小鼠體內(nèi)時(shí)，產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞經(jīng)受了快速的血管形成并維持了成簇的島狀結(jié)構(gòu)。
在臨床背景中，這種以胚胎干細(xì)胞-為基礎(chǔ)的系統(tǒng)將使得同時(shí)發(fā)生分泌胰島素和已知在調(diào)節(jié)胰島素分泌到功能結(jié)構(gòu)單位中起重要作用的其它島細(xì)胞類型的產(chǎn)生和裝配。這些單位可以提供用于將胰島素的產(chǎn)生最優(yōu)化的物質(zhì)并可以對(duì)葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的良好控制進(jìn)行分析。胚胎干細(xì)胞對(duì)于這些研究而言是很理想的，這是因?yàn)榭梢杂眠z傳工具來(lái)確定胰島形成和功能的分子基礎(chǔ)?？赡芸梢砸约?xì)胞為基礎(chǔ)來(lái)進(jìn)行治療對(duì)于涉及人和非人胚胎干細(xì)胞和胚細(xì)胞的應(yīng)用而言顯然是有吸引力的目標(biāo)。還可以用成熟的組織作為功能性胰腺細(xì)胞的來(lái)源。這里所述的分化系統(tǒng)可以提供用于治療糖尿病的功能性胰島的來(lái)源。這是表明可以從體外胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生一些內(nèi)分泌胰腺的細(xì)胞類型的第一次報(bào)道。雖然得自尸體的胰島在移植后可以在肝中起作用，但是仍然有待解決組織排斥和有效性的爭(zhēng)論。顯然，用于戰(zhàn)勝這種爭(zhēng)論和與糖尿病有關(guān)的其它問(wèn)題的爭(zhēng)論的用胚胎干細(xì)胞作為制備免疫學(xué)可相容的用于移植的組織的豐富來(lái)源的工程學(xué)越來(lái)越有前途。
肌梗死導(dǎo)致組織損失和心臟行為的損害。剩余的肌細(xì)胞不能重構(gòu)壞死的組織，并且梗死后的心臟隨著時(shí)間的流逝而惡化。通過(guò)遠(yuǎn)離的干細(xì)胞來(lái)對(duì)靶器官的損傷進(jìn)行檢測(cè)，干細(xì)胞遷移到損害部位并且進(jìn)行交替的干細(xì)胞分化；這些事件促進(jìn)了結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。Orlic等人(Nature 410，701-705(2001))提出用這種干細(xì)胞的高度可塑性來(lái)對(duì)是否可以通過(guò)移植骨髓細(xì)胞來(lái)修復(fù)梗死小鼠中死亡的心肌進(jìn)行試驗(yàn)。他們通過(guò)以c-試劑盒表達(dá)為基礎(chǔ)的熒光活化細(xì)胞分選把得自表現(xiàn)出綠熒光蛋白升高的轉(zhuǎn)基因小鼠的系-陰性(Lin-)骨髓細(xì)胞進(jìn)行分類。在對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎不久，將Lin-α-kitPOS細(xì)胞注射到該梗死邊界的收縮壁中。在移植骨髓細(xì)胞后9天，其發(fā)現(xiàn)新形成的心肌占心室梗死部分的68％。形成組織包含增生的肌細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)。其研究表明局部傳遞的骨髓細(xì)胞產(chǎn)生了新生的心肌、改善了冠狀動(dòng)脈疾病的結(jié)果。
為了對(duì)這些肌細(xì)胞的性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步定性，其對(duì)連接蛋白43的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定。這種蛋白對(duì)細(xì)胞間的連接和肌細(xì)胞間通過(guò)產(chǎn)生漿膜通道而進(jìn)行的電偶合負(fù)責(zé)；連接蛋白43出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中和緊密排列的分化細(xì)胞表面上。這些結(jié)果與所預(yù)期的心肌表型的功能型活性相一致。
因?yàn)楣δ苄约?xì)胞是由胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的，并且因?yàn)樵诠Ｋ佬呐K組織中的這些細(xì)胞中的確表達(dá)了連接蛋白，所以認(rèn)為其對(duì)于由胚胎干細(xì)胞分化的其它細(xì)胞的情況而言也是如此。因?yàn)檫B接蛋白在這些組織(包括胰腺β細(xì)胞和心肌細(xì)胞)的功能中起著重要的作用，所以增加連接蛋白酪氨酸磷酸化作用和半通道關(guān)閉(最終還可增加間隙連接通訊)的本發(fā)明的化合物如化合物1和化合物2將增加已經(jīng)移植了干細(xì)胞的器官中胚胎干細(xì)胞向功能性細(xì)胞的增生。
因此，本發(fā)明的目的是提供可以刺激移植器官如用于糖尿病治療的胰腺、用于心梗治療的心臟、和用于帕金森氏病治療的腦基底神經(jīng)節(jié)中的干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成功能性細(xì)胞的連接蛋白酪氨酸磷酸化化合物如化合物1和化合物2。一般認(rèn)為這些化合物將加速干細(xì)胞的分化，其可以加速所有器官如心臟、腦、皮膚、骨、胰腺、肝、和其它內(nèi)臟器官的愈合過(guò)程?？梢杂肙rlic等人，同上，所述的心肌梗死的一般試驗(yàn)方案來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，例如，在增生過(guò)程中將化合物1和化合物2重復(fù)進(jìn)行給藥。認(rèn)為這些實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)化合物1和化合物2或加快再生過(guò)程增加了連接蛋白43的表達(dá)。
P.癌1.腫瘤進(jìn)展在腫瘤形成過(guò)程中，正常細(xì)胞與其毗鄰細(xì)胞生理學(xué)相互作用的中斷和分化特征的喪失是腫瘤進(jìn)行中常見(jiàn)的共同特性。認(rèn)為間隙連接通訊的變化是細(xì)胞腫瘤形成過(guò)程中最早的變化(Wolburg H，Rohlmann A.Int Rev Cytol.1995；157315-73)，Klaunig JE，Ruch RJ.1990；135-46))。
Kyung-Sun Kang，等人(Cancer Letters 166(2001)147-153)已經(jīng)表明在TAP處理的大鼠肝上皮細(xì)胞中用GeO2進(jìn)行培養(yǎng)前或共同培養(yǎng)時(shí)取消了由TPA造成的GJIC的向下調(diào)節(jié)，表明可以恢復(fù)GJIC抑制的物質(zhì)可用于預(yù)防或抑制腫瘤的升級(jí)。Suzuki J，Na H-K，等人(Nutritionand Cancer，第36卷第1期第122-8頁(yè))已經(jīng)表明食品添加劑λ-角叉菜膠與得到良好證明的腫瘤促進(jìn)劑佛波醇酯(TPA)相似地抑制了肝表皮細(xì)胞中的GJIC，從而可以作為腫瘤促進(jìn)劑在癌形成中起重要的作用。因此，本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防或治療由腫瘤促進(jìn)劑如TPA和λ-角叉菜膠所造成的癌癥。
2.藥物靈敏度耐受性間隙連接通訊增加改善了腫瘤中的微環(huán)境。見(jiàn)Chen等人，ChemBiol Interact 1998年4月24；111-112263-753.轉(zhuǎn)移細(xì)胞間的間隙連接通訊的損失與具有轉(zhuǎn)移可能性的所有癌癥中的高轉(zhuǎn)移可能性有關(guān)。(Saunders MM，等人，Cancer-Res.2001；611765-1767)，Nicolson GI，等人Proc.Natl Acad Sci USA.1988；85473-6))。通過(guò)用有助于維持腫瘤中間隙連接交流的連接蛋白酪氨酸磷酸化化合物進(jìn)行治療來(lái)預(yù)防轉(zhuǎn)移。該治療是常規(guī)化療的附加治療。
認(rèn)為將本發(fā)明化合物中的一種或其組合(例如化合物1或化合物2)以治療有效量進(jìn)行給藥可以預(yù)防或治療癌癥。
Q.各種細(xì)胞間隙連接也在胃粘膜細(xì)胞的細(xì)胞間通訊、增生和分化中起著重要作用。在誘導(dǎo)損傷后，間隙連接開(kāi)放劑可刺激再生過(guò)程(Endo K，等人(J Gastroenterol Hepatol.1995；10589-94))。
半月板細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分依賴于間隙連接通訊。半月板的纖維軟骨部分以及腱的纖維軟骨結(jié)構(gòu)依賴于細(xì)胞間通訊。在損傷期間，間隙連接開(kāi)放劑將提高修復(fù)的速度。
R.癲癇癥希望用半通道開(kāi)放劑來(lái)對(duì)特征為GJIC高度異常的疾病狀態(tài)如癲癇進(jìn)行治療，其優(yōu)選地作為輔助治療以使得可以攝取作為將間隙連接通道解偶合的藥物或小分子調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的目的是要提供對(duì)這里所述的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥或情況中的一種或多種進(jìn)行治療或預(yù)防的方法。一般，但不是唯一地，該類方法包括以足以治療、預(yù)防或降低該適應(yīng)癥或情況的嚴(yán)重程度的量給予至少一種上述化合物，優(yōu)選地給予上述化合物中的一種。已經(jīng)通過(guò)一種或多種這里所述的體外和體內(nèi)測(cè)定來(lái)對(duì)優(yōu)選的化合物進(jìn)行選擇。特定的給藥策略對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的并且可以根據(jù)例如性別、重量、一般健康、和被治療或預(yù)防的特定適宜癥或情況而變化。正如所討論的那樣，這里所公開(kāi)的化合物可以在本發(fā)明的方法中被用作唯一的活性成分?；蛘?，其可以被用作“附加”治療，如其中表明將該化合物與公認(rèn)的治療方法聯(lián)用的那些治療。本發(fā)明治療或預(yù)防的優(yōu)選的適應(yīng)癥或情況一般與細(xì)胞間通訊受損或間隙連接功能受損有關(guān)。已經(jīng)在上面對(duì)本發(fā)明所涉及的更特定的適應(yīng)癥和情況進(jìn)行了討論。
本發(fā)明的治療方法可以用一種或多種這里所公開(kāi)的化合物作為唯一的活性成分。優(yōu)選地，使用該化合物中的一種。如果需要，預(yù)防性使用該類化合物，即用于預(yù)防或降低特定適應(yīng)癥或情況的嚴(yán)重程度?；蛘撸梢詫⒃摶衔锱c公認(rèn)的治療方法聯(lián)合使用。正如在一個(gè)用放療進(jìn)行治療的實(shí)施方案中所說(shuō)明的那樣，一般優(yōu)選地該治療方法是“附加的”，即，與公認(rèn)可以對(duì)該情況進(jìn)行治療的方法聯(lián)用?？梢愿鶕?jù)需要與該公認(rèn)的治療同時(shí)進(jìn)行本發(fā)明的該類“附加”治療方法或在不同的時(shí)間進(jìn)行該類“附加”治療方法。已經(jīng)對(duì)已經(jīng)確立的用于各種疾病和醫(yī)學(xué)情況的治療方法進(jìn)行了描述。一般可參見(jiàn)，例如Harrison′s Principlesof Internal Medicine(1991)，第12版，McGraw-Hill，Inc.和ThePharmacological Basis of Therapeutics(1996)Goodman，Louis S.第9版，Pergammon Press；該公開(kāi)物在這里被引入作為參考。
治療組合物中的一種或多種治療化合物的濃度將隨著許多因素而變化，所說(shuō)的因素包括被給藥的半通道調(diào)節(jié)化合物的劑量、所使用組合物的化學(xué)特性(例如，疏水性)和所需的給藥方式和途徑。一般而言，可以在包含約0.1至10％w/v化合物的用于胃腸外給藥的生理緩沖劑水溶液提供一種或一種以上的半通道調(diào)節(jié)化合物。
可以意識(shí)到在給定治療中所用的活性化合物的實(shí)際優(yōu)選用量將根據(jù)例如所用的特定化合物、所制備的特定組合物、給藥的方式和個(gè)體的特性例如個(gè)體的種屬、性別、體重、一般健康和年齡而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用根據(jù)上述規(guī)則所進(jìn)行的常規(guī)的劑量判定試驗(yàn)容易地確定對(duì)于給定的給藥方案而言最佳的給藥比率。適宜的劑量范圍包括每天約1μg/kg體重至約100mg/kg體重(“治療有效量”)。
本發(fā)明的治療化合物可以以質(zhì)子化和水溶性形式進(jìn)行適宜的給藥，所說(shuō)的形式例如可以是可藥用的鹽，一般是酸加成鹽如無(wú)機(jī)酸加成鹽例如鹽酸鹽、硫酸鹽、或磷酸鹽或有機(jī)酸加成鹽如醋酸鹽、馬來(lái)酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽、或枸櫞酸鹽的形式。本發(fā)明治療化合物的可藥用的鹽還包括金屬鹽，特別是堿金屬鹽如鈉鹽或鉀鹽；堿土金屬鹽如鎂或鈣鹽；銨鹽如銨或四甲基銨鹽；或氨基酸加成鹽如賴氨酸、甘氨酸、或苯丙氨酸鹽。在下面提供了另外的適宜的鹽。
更特定的本發(fā)明的半通道調(diào)節(jié)化合物是以可藥用鹽、與直鏈化合物的C-末端羧酸官能團(tuán)或如果存在的話的環(huán)狀化合物的游離羧酸官能團(tuán)形成的烷基酯、酰胺、烷基酰胺、二烷基酰胺、或酰肼的形式。酰胺和直鏈化合物的低級(jí)烷基酰胺是本發(fā)明優(yōu)選的化合物。鹽包括可藥用的鹽，如酸加成鹽和堿鹽。已經(jīng)對(duì)酸加成鹽的實(shí)例進(jìn)行了描述，并且包括鹽酸鹽、鈉鹽、鈣鹽、鉀鹽等等。堿鹽的實(shí)例有其中陽(yáng)離子選自堿金屬如鈉和鉀、堿土金屬如鈣、和銨離子+N(R3)3(R4)的鹽，其中R3和R4獨(dú)立地是任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-鏈烯基、任選取代的芳基、或任選取代的雜芳基?？伤幱名}的其它實(shí)例有例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences 17.Ed.Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985和更新版本，以及在Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中所描述的那些鹽。
在本發(fā)明的治療方法中，可以以一些方法中的任何一種方法將治療化合物給藥于個(gè)體。例如，可以將用所提供的體外和/或體內(nèi)測(cè)定中的一種或其組合所選擇的半通道調(diào)節(jié)化合物預(yù)防性進(jìn)行給藥以預(yù)防靶向情況的開(kāi)始或降低其嚴(yán)重程度?；蛘?，可以在靶向情況的過(guò)程中將該化合物進(jìn)行給藥。
可以單獨(dú)或者與一種或多種治療劑聯(lián)合地將治療化合物給藥于個(gè)體，其可以為混有常規(guī)賦形劑的藥物組合物，所說(shuō)的常規(guī)賦形劑即適于胃腸外、腸內(nèi)或鼻內(nèi)應(yīng)用的不會(huì)與活性化合物進(jìn)行有害反應(yīng)并且不會(huì)對(duì)其接受者造成危害的可藥用的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體物質(zhì)。適宜的可藥用載體非限制性地包括水、鹽溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、硅酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸單甘油酯和二甘油酯、petroethral脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等?？梢詫?duì)該藥物制劑進(jìn)行滅菌，并且如果需要的話，可以將其與不會(huì)與活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)的輔助物質(zhì)進(jìn)行混合，所說(shuō)的輔助物質(zhì)例如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、矯味劑和/或芳香物質(zhì)等等。
該類組合物可以被制備成用于胃腸外給藥，特別是可以被制備成液體溶液或混懸液的形式；被制備成用于口服給藥的形式，特別是片劑或膠囊的形式；被制備成鼻內(nèi)給藥的形式，特別是粉末、滴鼻劑、或氣霧劑形式；陰道給藥的形式；局部給藥例如乳膏形式；直腸給藥例如栓劑形式；等等。
該藥學(xué)物質(zhì)可以方便地以單位劑量的形式被給藥并且可以用藥學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的方法來(lái)進(jìn)行制備，例如可以如在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)中所述的那樣來(lái)進(jìn)行制備。用于胃腸外給藥的制劑可以包含普通賦形劑如無(wú)菌的水或鹽水、聚亞烷基二醇如聚乙二醇、植物來(lái)源的油、氫化萘等等。特別是可以用可生物相容、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧化乙烯-聚氧化乙烯共聚物作為用于控制本發(fā)明某些半通道調(diào)節(jié)化合物的釋放的賦形劑。
可能有用的其它胃腸外傳遞系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸入系統(tǒng)、以及脂質(zhì)體。用于吸入給藥的制劑包含賦形劑如乳糖，或者是可以包含例如聚氧化乙烯-9-月桂基醚、甘氨膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液、或者是油溶液，其可以是滴鼻劑的形式或者可以是可被鼻內(nèi)應(yīng)用的凝膠形式。用于胃腸外給藥的制劑還可以包括用于口腔給藥的甘氨膽酸鹽、用于直腸給藥的甲氧基水楊酸酯、或用于陰道給藥的枸櫞酸。其它傳遞系統(tǒng)可以將治療劑(治療劑們)直接給藥到手術(shù)部位，例如在囊血管成形術(shù)后可以通過(guò)使用斯滕特固定模將半通道調(diào)節(jié)化合物進(jìn)行給藥。
縮寫(xiě)和公式在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，用三個(gè)字母代碼來(lái)表示天然氨基酸，一般可接受的用于表示其它α-氨基酸的三個(gè)字母代碼如Sarcosin(Sar)、α-氨基-異-丁酸(Aib)、萘基丙氨酸(Nal)，包括-萘基丙氨酸(lNal)和2-萘基丙氨酸(2Nal)、苯基甘氨酸Phg、2，4-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丙酸(Dapa)、和羥脯氨酸(Hyp)。在沒(méi)有詳細(xì)說(shuō)明的情況中，Hyp表示4-羥脯氨酸。天然或必需氨基酸是蛋白的氨基酸組分。芳族氨基酸是Phe、Tyr、Trp、1Nal、2Nal和His。在沒(méi)有詳細(xì)說(shuō)明L或D型的情況中，應(yīng)當(dāng)清楚的是所懷疑的氨基酸具有天然的L型，cf.Pure&Appl.Chem.第56(5)卷第595-624頁(yè)(1984)。在沒(méi)有詳細(xì)說(shuō)明的情況中，應(yīng)當(dāng)清楚的是本發(fā)明化合物的C-末端氨基酸是以游離羧酸的形式存在地，這也可以被指定為“-OH”。本發(fā)明化合物的C-末端氨基酸可以表現(xiàn)出具有“-OH/NH2”的末端官能團(tuán)，其指的是該化合物有兩種優(yōu)選的形式游離酸酸和酰胺化衍生物。
除非特別說(shuō)明，否則使用下面的特定定義ASAL指的是4-疊氮基水楊?；籄B指的是4-疊氮基苯甲?；籉moc指的是9-芴基甲氧基羰基；Ac指的是乙?；?。除非特別說(shuō)明，否則在本公開(kāi)物中使用下面的定義；Acm指的是乙酰氨基甲基；T4c指的是L-噻唑烷-4-羧酸基；Pc指的是L-哌啶酸基；DNP指的是二硝基苯基；；DBF被定義為2-氨基乙基-6-二苯并呋喃丙酸；；Acm指的是乙酰氨基甲基；和Sar指的是肌氨酸基；DNP官能團(tuán)是用于抗體識(shí)別的半抗原，和包含DNP部分的本發(fā)明的化合物可以優(yōu)選地被用作研究工具。
另外的信息還可以見(jiàn)PCT/DK01/00127(WO01/62775)和PCT/US02/05773(WO 02/077017)。
這里所公開(kāi)的所有參考資料在這里都被引入作為參考。用下面的實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
參考實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)的小鼠心律失常(Arrythmia)體內(nèi)測(cè)定用鈣誘導(dǎo)的小鼠心律失常模型來(lái)對(duì)抗心律失常作用進(jìn)行試驗(yàn)。
簡(jiǎn)要地說(shuō)，可以用根據(jù)J.J.Lynch，R.G.等人JCardiovasc.Pharmacol.1981，3 49-60的模型的鈣誘導(dǎo)的心律失常體內(nèi)模型對(duì)化合物的抗心律失常作用進(jìn)行試驗(yàn)。用neurolept麻醉劑組合(Hypnorm(枸櫞酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮(fuanisone)10mg/ml)+咪達(dá)唑侖(5mg/ml))對(duì)小鼠(25-30g)進(jìn)行麻醉。將可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得的Hypnorm和咪達(dá)唑侖的溶液用蒸餾水以1∶1的比例進(jìn)行稀釋并且將一份進(jìn)行了稀釋的Hypnorm與一份進(jìn)行了稀釋的咪達(dá)唑侖進(jìn)行混合。
通過(guò)以0.05-0.075μl/10克的劑量給小鼠進(jìn)行皮下給藥來(lái)誘導(dǎo)麻醉。將i.v.套管插入到尾靜脈中。通過(guò)將不銹鋼ECG電極放在右前肢和左前肢上來(lái)連續(xù)記錄開(kāi)頭的II ECG信號(hào)。將接地電極放在右后肢上。通過(guò)Hugo Sachs Electronic model 689 ECG組件將該信號(hào)放大(x5.000-10.000)和過(guò)濾(0.1-150Hz)。通過(guò)12位數(shù)字采集板(DataTranslation model DT321)將類似的信號(hào)數(shù)字化并在1000Hz下用Windows NT的Notocord HEM 3.1軟件進(jìn)行取樣。在10-分鐘平衡期后，將藥物的試驗(yàn)樣品注射到尾靜脈中。對(duì)用基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，將其作為未進(jìn)行處理的動(dòng)物中對(duì)照水平的測(cè)量值。在所有實(shí)驗(yàn)中，注射體積為100μl。在將藥物或基質(zhì)進(jìn)行i.v.給藥后3分鐘開(kāi)始輸入CaCl2(30mg/ml，0.1ml/分鐘≈100mg/kg/分鐘(氯化鈣-2-水合物，Riedel-de Haёn，德國(guó)))。對(duì)從開(kāi)始CaCl2輸入至發(fā)生第一次心律失常時(shí)間的第2級(jí)AV-阻滯時(shí)的時(shí)滯進(jìn)行測(cè)量。將第2級(jí)AV-阻滯事件定義為特征為不伴有QRS復(fù)合體的P-波的AV傳導(dǎo)的間歇性失敗。
將反應(yīng)表示為相對(duì)于直至在用基質(zhì)進(jìn)行處理的小鼠中發(fā)生第2級(jí)AV-阻滯的時(shí)間。已經(jīng)對(duì)各試驗(yàn)物質(zhì)的最大作用進(jìn)行了概括。
用于檢測(cè)具有良好間隙連接改性活性的候選化合物的更特定的方法進(jìn)一步包括對(duì)可以在標(biāo)準(zhǔn)的小鼠心律失常體內(nèi)測(cè)定中將至所誘導(dǎo)的心房心室(AV)阻滯開(kāi)始的時(shí)間延長(zhǎng)至少約20％(得分至少為2)的候選化合物進(jìn)行選擇。更優(yōu)選的化合物將在該測(cè)定中至所誘導(dǎo)的AV阻滯(得分至少為3)開(kāi)始的時(shí)間延長(zhǎng)至少約60％。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例提供了表明化合物1在大鼠新生的心肌細(xì)胞中具有打開(kāi)間隙連接通道和關(guān)閉半通道的能力的功能性測(cè)定。因此，可通過(guò)半通道和間隙連接通道的酪氨酸磷酸化作用獲得對(duì)GJIC的區(qū)分調(diào)節(jié)。
實(shí)施例1-抗心律失?；衔镉糜诒景l(fā)明的化合物包括Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)和Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物2)。根據(jù)WO 01/62775中所述的標(biāo)準(zhǔn)固相合成來(lái)對(duì)化合物進(jìn)行合成。用于本發(fā)明化合物的另外的實(shí)例是反-白藜蘆醇和CAPE(咖啡酸苯乙酯)。已經(jīng)對(duì)制備該化合物的方法進(jìn)行了描述。見(jiàn)例如PCT/DKO1/00127(WO01/62775)和PCT/US02/05773(WO02/077017)申請(qǐng)。
實(shí)施例2-對(duì)由除去葡萄糖所誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激進(jìn)行的分析可以通過(guò)既對(duì)動(dòng)作電位的形成進(jìn)行干擾，又對(duì)其傳導(dǎo)進(jìn)行干擾來(lái)造成心律不齊。動(dòng)作電位從細(xì)胞到細(xì)胞之間的傳播是由細(xì)胞間的間隙連接所介導(dǎo)的。這些間隙連接包括通道，其是通過(guò)被稱為連接蛋白的特定蛋白所構(gòu)成的。有一些跡象線表明連接蛋白的表達(dá)降低和/或分布受到干擾對(duì)于正常脈沖的傳播而言是有害的，并且從而導(dǎo)致心律失常。一個(gè)實(shí)例是在局部缺血期間和局部缺血后看到了這種改變。在急性局部缺血期間，認(rèn)為細(xì)胞的解偶聯(lián)主要是由細(xì)胞內(nèi)酸化、細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加、細(xì)胞內(nèi)ATP降低和長(zhǎng)鏈酰基肉毒堿和脂肪酸[1，2]濃度升高所造成的。在局部缺血的急性期后，梗死區(qū)域及其邊界區(qū)域的體系結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這種改變與連接蛋白紊亂區(qū)域和電位折返回路的形成有關(guān)，認(rèn)為其可作為致心律失常底物[3]。體內(nèi)和體外研究已經(jīng)表明一組抗心律失常的肽可以延遲和抑制心律不齊的開(kāi)始，并且隨后的研究已經(jīng)表明這些肽可以增加細(xì)胞之間的電偶合。
A方法1.細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)而言之，將得自20只新生大鼠(1-2天的大鼠)的心臟無(wú)菌切除。將心室分離出來(lái)并將其切成4-6片，在具有胰蛋白酶和DNAse的Hanks緩沖鹽水中用一些步驟對(duì)其進(jìn)行消化。然后將該細(xì)胞進(jìn)行離心并將其重新混懸于具有5％FCS的MEM中。為了除去非-肌細(xì)胞，將該混懸液預(yù)先涂布在陪替氏培養(yǎng)皿中將其在37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后，將混懸液中的細(xì)胞接種到用膠原涂布的蓋玻片上。對(duì)接種密度進(jìn)行調(diào)整以產(chǎn)生融合的培養(yǎng)物。
2.電生理學(xué)將具有融合心肌細(xì)胞的蓋玻片安放在位于倒置顯微鏡(inverted microscope)載物臺(tái)上的開(kāi)放室中并通過(guò)重力驅(qū)動(dòng)以1ml/分鐘的速度在37℃用Dulbeccos磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)對(duì)其進(jìn)行澆蓋。該溶液(PBS)包含(以mM為單位)Na+152、K+4.2、Cl-141.5、PO43-9.5、Ca2+0.9、Mg2+0.5，pH 7.4。在Sutter FlamingBrown P-87微電極拔出器上從1.5mm玻璃毛細(xì)管(GC150F-15，HarvardApparatus)中拔出膜片鉗移液管并將其火拋光(fire polished)至4-6MW的電阻。將移液管填充上包含(以mM為單位)K+150、Na+15、Cl-5、葡萄糖酸鹽-150.2、EGTA 5、HEPES 5、Ca2+2mM、Mg2+1.6，pH7.2的細(xì)胞內(nèi)樣溶液。
該膜片鉗裝置包括同步的非連續(xù)放大器(SEC-05LX，NPIelectronics)，并且用INT-10接口(NPI electronics)和PC1200數(shù)字采集板(National Instruments)來(lái)將數(shù)據(jù)數(shù)字化。用該放大器的內(nèi)部濾器將電流和電壓信號(hào)低通濾過(guò)并在10kHz下將其數(shù)字化。
用PatchMan 5173纖維操作器(Eppendorf)使細(xì)胞接近電極。當(dāng)與細(xì)胞接觸時(shí)(被看成輸入電阻突然增加)，進(jìn)行抽吸直至確立Giga密封結(jié)構(gòu)。然后，進(jìn)行簡(jiǎn)短地抽吸脈沖以將移液管下的膜弄破。然后，將放大器放到零-電流鉗方式以對(duì)膜電位進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
在雙極鉑電級(jí)之間保留一些距離(＞＞1cm)以放置培養(yǎng)物。然后，在人工刺激和修補(bǔ)細(xì)胞中出現(xiàn)動(dòng)作電位之間的延遲是電導(dǎo)速率的量度器。
用具有0.1g/lBSA的對(duì)照溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行灌注直至在刺激-活化間隔(SAI)中確立了穩(wěn)定的基線。然后，將灌注液變成沒(méi)有葡萄糖的溶液，用其灌注15分鐘，隨后用化合物1(10-8M)對(duì)其激發(fā)20分鐘。平行地，在不加入化合物1的情況下用相似的時(shí)間刻度來(lái)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將日期表示為相對(duì)于從培養(yǎng)基中除去葡萄糖前的基線而言的變化百分比。
B.結(jié)果如圖2所示的那樣，通過(guò)除去葡萄糖所誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激在刺激-活化間隔中產(chǎn)生了輕微增加，這表明除去葡萄糖延遲了傳導(dǎo)速度。相反，用濃度為10nM的化合物1進(jìn)行澆蓋降低了刺激-活化間隔，即化合物1增加了原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中的傳導(dǎo)速度。這些數(shù)據(jù)表明化合物1增加了心肌細(xì)胞中細(xì)胞-至-細(xì)胞的偶合。
參考資料 Carmeliet，E.心臟離子電流和急性局部缺血從通道到心律不齊.Physiol Rev.，1999，79917-1017。
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Peters，N.S.和Wit，A.L.心肌體系結(jié)構(gòu)和心室心律失常形成.Circulation，1998，971746-1754。
實(shí)施例3-免疫沉淀法和磷酸化連接蛋白的分析本實(shí)施例中所用的化合物是用標(biāo)準(zhǔn)的固相Fmoc化學(xué)過(guò)程制備的。見(jiàn)前面的實(shí)施例。用質(zhì)譜來(lái)進(jìn)行鑒定，用RP-HPLC對(duì)純度進(jìn)行測(cè)定。原位結(jié)合和動(dòng)物研究表明下面的肽(化合物1)與受體在毫微摩爾范圍內(nèi)進(jìn)行結(jié)合。用1nM、10nM、50nM和100nM的化合物1進(jìn)行的初始研究將決定是否進(jìn)行用下面的肽化合物3(H-GAG-4-Hyp-PY-NH2)和化合物4(H-GNY-NH2)進(jìn)行的研究。這些研究還將決定是否進(jìn)行涉及特定的激酶抑制劑的研究。
將H9c2細(xì)胞以7,900個(gè)細(xì)胞/cm2(約～15,000個(gè)細(xì)胞/孔)的密度接種在24-多孔皿中并使其在添加有10％胎牛血清(FCS)和1000單位青霉素/100μg鏈霉素(pen/strep)的MEM中在5％的CO2大氣和100％的濕度下在37℃下生長(zhǎng)3天。
將進(jìn)行了標(biāo)記的細(xì)胞在Triton X-100溶解緩沖劑(～5*107個(gè)細(xì)胞/ml)中在4℃下培養(yǎng)1小時(shí)。將該溶胞產(chǎn)物在30分鐘20,000*g下離心30分鐘。通過(guò)給每200μl上清液加入10μl瓊脂糖來(lái)將上清液預(yù)澄清(precleared)。然后，將進(jìn)行了預(yù)澄清的上清液加入0.5-1μg磷酸酪氨酸或磷酸絲氨酸抗體(Sigma)并將其在軌道搖動(dòng)器中在4℃下培養(yǎng)1.5小時(shí)。然后，通過(guò)用50μl 1∶1蛋白G瓊脂糖的漿液培養(yǎng)1.5小時(shí)來(lái)獲得抗體-復(fù)合體。最后，用0.1％(w/v)Triton X-100，50mM Tris，pH7.4，300mM NaCl和5mM EDTA對(duì)該復(fù)合體進(jìn)行廣泛洗滌。
將該復(fù)合體裝載到12％SDS凝膠上并將其點(diǎn)到PVDF膜上。將該膜用0.1％吐溫20，50mM Tris，pH 7.4，300mM NaCl，5％干乳(TBST)阻滯2小時(shí)。隨后，將該膜用連接蛋白43特異抗體(Zymed)在室溫下培養(yǎng)1.5小時(shí)開(kāi)用ECL+(Amersham)使其生長(zhǎng)。
圖3A-B表示其中使用抗-磷酸酪氨酸抗體的免疫印跡。對(duì)與化合物1(3A-B)和化合物2(3B)濃度有函數(shù)關(guān)系的Cx43片段磷酸化進(jìn)行了描述。
圖4A-B表示其中使用抗-磷酸絲氨酸抗體(4A)或抗-磷酸酪氨酸(4B)抗體的免疫印跡。
實(shí)施例4化合物1肽對(duì)融合心肌細(xì)胞中半通道活性的影響1.細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單地說(shuō)，將得自20只新生大鼠(1-2天的大鼠)的心臟無(wú)菌切除。將心室分離出來(lái)并將其切成4-6片，在具有胰蛋白酶和DNAse的Hanks緩沖鹽水中用一些步驟對(duì)其進(jìn)行消化。然后將該細(xì)胞進(jìn)行離心并將其重新混懸于具有5％FCS的MEM中。為了除去非-肌細(xì)胞，將該混懸液預(yù)涂布在陪替氏培養(yǎng)皿中將其在37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后，將該細(xì)胞混懸液接種到膠原涂布的蓋玻片上。
2.染料-攝取將該具有心肌細(xì)胞的蓋玻片用包含(以mM為單位)Na+152，K+4.2，Cl-141.5，PO43-9.5，Ca2+0.9，Mg2+0.5，葡萄糖6，pH 7.4的對(duì)照溶液(PBS)或局部缺血模擬(ischmia mimicking)(損傷)溶液(作為對(duì)照，僅包含K+8.2，沒(méi)有葡萄糖，10mM脫氧-葡萄糖，pH6.5)培養(yǎng)30分鐘，兩種溶液都包含200μM鈣黃綠素。然后將該細(xì)胞用對(duì)照溶液洗滌10分鐘。
將該蓋玻片放到倒置顯微鏡載物臺(tái)上的開(kāi)放室中。選擇10個(gè)隨機(jī)區(qū)域，并在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下從各區(qū)域中選擇三個(gè)細(xì)胞。然后用480nm的光對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)，在510nm下對(duì)熒光發(fā)射進(jìn)行測(cè)量，其中該發(fā)射強(qiáng)度是染料攝取的量度器。
在下面兩個(gè)條件下對(duì)化合物1對(duì)染料攝取的作用進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)1在這一系列實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞用具有鈣黃綠素的對(duì)照溶液培養(yǎng)30分鐘，并用不含染料的溶液將其洗滌10分鐘。在成對(duì)的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，其中在30分鐘培養(yǎng)過(guò)程中加入肽。
實(shí)驗(yàn)2如實(shí)驗(yàn)1那樣，但是僅僅是用損傷溶液代替對(duì)照溶液進(jìn)行。
3.結(jié)果用鈣黃綠素在得自新生大鼠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行的攝取實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行代謝應(yīng)激(形式為低pH、細(xì)胞外K+增加和脫氧葡萄糖5-10mM)時(shí)，染料攝取比對(duì)照細(xì)胞高38％。當(dāng)將細(xì)胞與化合物1(10nM，在成對(duì)t-檢驗(yàn)中與只接觸脫氧葡萄糖的細(xì)胞相比P＜0.017，n＝6)共同進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，這種作用被顯著降低。這些結(jié)果表明，在代謝應(yīng)激后發(fā)現(xiàn)的通過(guò)連接蛋白半通道的膜滲透性增加可被化合物1抑制。很可能這種作用對(duì)于細(xì)胞功能和存活是有益的。此外，用培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行的磷酸化作用實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明化合物1介導(dǎo)了連接蛋白43的酪氨酸磷酸化作用。此外，與0、1、10、50和100nM化合物1接觸4小時(shí)的心肌細(xì)胞增加了連接蛋白43酪氨酸磷酸化作用。已經(jīng)報(bào)道了酪氨酸磷酸化作用介導(dǎo)了間隙連接細(xì)胞間通訊的紊亂并且可以容易地解釋在鈣黃綠素實(shí)驗(yàn)中所看到的膜滲透性降低。在一些實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)化合物1可以降低Ser-磷酸化作用。
圖5表示了10nM化合物1對(duì)局部缺血-誘導(dǎo)的所培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中的鈣黃綠素的攝取的影響。
實(shí)施例5-部位特異性連接蛋白磷酸化作用的ELISA測(cè)定已經(jīng)確立了ELISA夾層測(cè)定，其使得可以測(cè)量組織樣品以及位于多孔形式(24-96孔)中的細(xì)胞培養(yǎng)物中連接蛋白的部位特異性磷酸化作用。將這些孔用對(duì)抗所討論的連接蛋白類型的抗體(捕獲抗體)進(jìn)行涂布。然后，使細(xì)胞或組織提取物與用捕獲抗體-涂布的板在4℃下o/n進(jìn)行反應(yīng)。用直接作用于特異磷酸化作用部位的抗體對(duì)所捕獲的被磷酸化的連接蛋白進(jìn)行檢測(cè)或者使所捕獲的被磷酸化的連接蛋白與生物素、FITC、TRITC或過(guò)氧化物酶進(jìn)行軛合。
或者可以用作用于檢測(cè)抗體的IgG種類的放射性標(biāo)記的或酶軛合的抗體對(duì)與特定磷酸化作用部位相結(jié)合的抗體數(shù)量進(jìn)行測(cè)量。
已經(jīng)用作為捕獲抗體的小鼠抗Cx43、作為檢測(cè)抗體的兔抗-Tyr-P(酪氨酸磷酸化作用部位)和用于對(duì)所結(jié)合的抗-Tyr-P的數(shù)量進(jìn)行測(cè)量的用125I或HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的抗-兔IgG證明了該原理。
還用作為捕獲抗體的兔抗Cx43(5μ/ml；cat.no.710700，ZymedLab.Inc.，California，USA)、作為檢測(cè)抗體的單克隆小鼠抗-磷酸酪氨酸(50μg/ml；cat.no.P-3300，clone pt66，Sigma，MO，USA)和用于對(duì)被結(jié)合的抗-磷酸酪氨酸的數(shù)量進(jìn)行測(cè)量的用125I標(biāo)記的抗-小鼠完全抗體(綿羊抗-小鼠Ig cat.no.IM131，Amersham Biosciences，Wales，UK)或用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-小鼠完全抗體(驢抗-小鼠Ig；cat.no.715-035-151)證明了該原理。
圖6A表示優(yōu)選ELISA檢測(cè)形式的圖解形式。圖6B和6C表示本本實(shí)施例和討論提供了代謝應(yīng)激打開(kāi)心臟細(xì)胞中連接蛋白半通道以及這種打開(kāi)可以通過(guò)用化合物1進(jìn)行培養(yǎng)被挫敗的證據(jù)。此外，實(shí)施例2-5表明化合物1在代謝應(yīng)激過(guò)程中關(guān)閉半通道。與化合物1對(duì)半通道對(duì)鈣黃綠素?cái)z取的抑制作用，即關(guān)閉半通道的作用相一致，這些實(shí)施例還表明化合物1有助于調(diào)節(jié)連接蛋白43的酪氨酸磷酸化狀態(tài)。已知化合物1可以打開(kāi)間隙連接，參考WO01/62775并且已知連接蛋白脫磷酸化作用的抑制可以防止間隙連接通道的關(guān)閉。因此，認(rèn)為這里所提供的已經(jīng)表明具有化合物1的有益的間隙連接開(kāi)放或調(diào)節(jié)作用的化合物，即在WO 01/62775中所公開(kāi)的所有抗心律失常的肽和已知的肽如AAP、AAP10、HP5等等可作為半通道開(kāi)放或關(guān)閉調(diào)節(jié)劑而用于本發(fā)明。還認(rèn)為化合物1可以維持或增加Cx43的酪氨酸磷酸化作用，從而可以調(diào)節(jié)半通道功能。
實(shí)施例6-心肌細(xì)胞中的染料攝取。
1.方法.通過(guò)胰蛋白酶消化將心室肌細(xì)胞從新生大鼠中分離出來(lái)并將其接種到用膠原覆蓋的蓋玻片上。在4天后，肌細(xì)胞形成融合并同時(shí)將細(xì)胞的薄片進(jìn)行敲打。為了測(cè)量染料攝取，將細(xì)胞在室溫下在包含200μM鈣黃綠素的緩沖劑中培養(yǎng)30分鐘。然后將蓋玻片用對(duì)照緩沖劑仔細(xì)進(jìn)行洗滌，并將其放置在開(kāi)放浴的室中并用對(duì)照緩沖劑對(duì)其進(jìn)行澆蓋(RT)。用氙燈和單色儀在480nm光下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)。用冷卻CCD照相機(jī)(Sensicam)收集510nm下所發(fā)射的熒光圖象。用成像工作臺(tái)(Axon)來(lái)控制激發(fā)控制和圖象收集。
在光學(xué)顯微鏡下在圖象中在心肌細(xì)胞上確定出三個(gè)區(qū)域。然后對(duì)平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)進(jìn)行該操作直至在10副照片上測(cè)量了30個(gè)區(qū)域。用這些測(cè)量的均值作為給定實(shí)驗(yàn)條件的值，即n＝1。在各系列中，進(jìn)行一個(gè)對(duì)照培養(yǎng)并且所有的實(shí)驗(yàn)值都是相對(duì)于這一值被給出的。
溶液對(duì)照緩沖劑(以mM為單位)NaCl136，KCl 4，MgCl20.8，CaCl21.8 HEPES 5，MES 5，葡萄糖6，pH 7.3應(yīng)激緩沖劑(以mM為單位)NaCl 136，KCl 8，MgCl20.8，CaCl21.8 HEPES 5，MES 5，脫氧-葡萄糖10，pH 6.22.結(jié)果在對(duì)照條件下用鈣黃綠素進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)給出了一些熒光染色，其主要是定位微粒性質(zhì)(見(jiàn)圖7A-C，小組B)。在所培養(yǎng)的肌細(xì)胞上，常常發(fā)現(xiàn)立即被臺(tái)盼藍(lán)染色的卷起的細(xì)胞。這些細(xì)胞被鈣黃綠素嚴(yán)重染色，并且應(yīng)當(dāng)注意不在這些細(xì)胞上設(shè)置測(cè)量區(qū)域。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生代謝抑制時(shí)，染色方式發(fā)生變化，并且觀察到染料通過(guò)胞質(zhì)溶膠進(jìn)行擴(kuò)散(圖7C)。應(yīng)激期間的平均強(qiáng)度比對(duì)照高36.2±4.18％(n＝5，在成對(duì)t-檢驗(yàn)中P＜0.001)。
這證實(shí)了在心臟和其它細(xì)胞類型中的發(fā)現(xiàn)，即代謝抑制活化了熒光染料的攝取，其可能是通過(guò)連接蛋白半通道進(jìn)行的。我們假設(shè)肽的AAP族可以對(duì)心臟組織發(fā)揮積極作用的機(jī)理之一可能是中斷了半通道的活性，從而改善了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。為了對(duì)此進(jìn)行研究，使細(xì)胞在存在ZP123的情況下在0.1pM至10mM的濃度間進(jìn)行應(yīng)激。結(jié)果如圖8所示，其中各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示5次實(shí)驗(yàn)。正如可以看出來(lái)的那樣，ZP123劑量依賴性地降低了鈣黃綠素的攝取。使用S形函數(shù)，估計(jì)ED50為3.3±5.3pM，Hill系數(shù)為2.5±1.0。在化合物1的最大抑制期間的平均強(qiáng)度比對(duì)照高6.9±1.7％。
實(shí)施例7-心肌細(xì)胞中的體積測(cè)量1.方法通過(guò)胰蛋白酶消化將心室肌細(xì)胞從新生大鼠中分離出來(lái)并將其涂布到用膠原覆蓋的蓋玻片上。在4天后，肌細(xì)胞形成融合并同時(shí)將細(xì)胞的薄片進(jìn)行敲打。為了對(duì)細(xì)胞體積進(jìn)行測(cè)量，使細(xì)胞在37℃下用鈣黃綠素-AM(在對(duì)照緩沖劑中為5μM)負(fù)載15分鐘并將蓋玻片放置在開(kāi)放浴的室中。在室溫下進(jìn)行下面的試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用Leica激光同焦顯微鏡，每隔20秒進(jìn)行一次光學(xué)橫截。
用Metamorph(Universal Imaging)對(duì)該光學(xué)橫截進(jìn)行分析。將細(xì)胞區(qū)域確定為熒光強(qiáng)度高于閾值的像素區(qū)域以將背景誘導(dǎo)的波動(dòng)最小化。通過(guò)用各值除以對(duì)照情況下(代謝應(yīng)激前進(jìn)行的最后測(cè)量)的平均面積來(lái)將數(shù)據(jù)表示為相對(duì)體積。
溶液對(duì)照緩沖劑(以mM為單位)NaCl 136，KCl 4，MgCl20.8，CaCl21.8 HEPES 5，MES 5，葡萄糖6，pH 7.3應(yīng)激緩沖劑(以mM為單位)NaCl 136，KCl 8，MgCl20.8，CaCl21.8 HEPES 5，MES 5，脫氧-葡萄糖10，pH 6.22.結(jié)果在對(duì)照情況下，細(xì)胞一般傾向于隨著時(shí)間的流逝體積略微降低(圖9B表示得自5個(gè)試驗(yàn)的平均數(shù)據(jù))。當(dāng)用代謝抑制對(duì)細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)時(shí)，體積下降被逆轉(zhuǎn)至凈增加(圖9A中的實(shí)心方塊)。一般而言，相對(duì)體積為1.06±0.02(最后一個(gè)5分鐘應(yīng)激，n＝5)，而這一時(shí)期對(duì)照細(xì)胞的體積為0.94±0.04。
肌細(xì)胞中的染料攝取測(cè)量已經(jīng)表明化合物1抑制了連接蛋白半通道的開(kāi)放。認(rèn)為半通道可能有助于所觀察到的膨脹。為了對(duì)此進(jìn)行監(jiān)驗(yàn)，在應(yīng)激介質(zhì)和體積檢測(cè)中包含化合物1(0.1nM)。得自6個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)如圖9A所示(空心的方塊)并且正如可以看出的那樣，防止了應(yīng)激誘導(dǎo)的膨脹。在存在化合物1的情況下應(yīng)激過(guò)程中的平均相對(duì)體積為0.93±0.05。
當(dāng)用單側(cè)ANOVA對(duì)得自對(duì)照、應(yīng)激和應(yīng)激加化合物1的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)，檢測(cè)到顯著差異(見(jiàn)圖10)。Post.hoc.試驗(yàn)(LSD)表明應(yīng)激與對(duì)照(P＜0.05)和應(yīng)激加化合物1(P＜0.05)具有顯著差異，而對(duì)照與應(yīng)激加化合物1之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.76)。
實(shí)施例8-大鼠體內(nèi)心肌梗死后梗死大小的降低1.方法
將雄性Lewis大鼠(300-350g；M&B，LI.Skendsved，Denmark)用neurolept麻醉劑組合(Hypnorm(枸櫞酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml)+咪達(dá)唑侖(5mg/ml))進(jìn)行麻醉。將可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得的咪達(dá)唑侖的溶液用蒸餾水以1∶2的比例進(jìn)行稀釋。將三份進(jìn)行了稀釋的咪達(dá)唑侖與一份hypnorm進(jìn)行混合。通過(guò)每100克大鼠皮下給予0.2ml這種溶液來(lái)誘導(dǎo)麻醉。當(dāng)確定已經(jīng)建立了手術(shù)麻醉時(shí)，插入氣管內(nèi)導(dǎo)管并用被調(diào)節(jié)至可以將手術(shù)期間動(dòng)脈pH維持在7.3-7.5的Harvard嚙齒動(dòng)物通風(fēng)機(jī)對(duì)動(dòng)物人工通風(fēng)。
就在誘導(dǎo)心肌梗死前用插入到腹膜腔(i.p.)中的微型滲透泵(Alzetmodel 2ML4)來(lái)傳遞化合物1。將泵充滿基質(zhì)(等張的鹽水)或化合物1。為了確保在梗死時(shí)已經(jīng)獲得了治療的血漿濃度，在對(duì)LAD結(jié)扎前皮下給予化合物1的負(fù)載劑量。在皮下給予負(fù)載劑量時(shí)，在3分鐘后就達(dá)到了穩(wěn)態(tài)血漿水平。
在皮下給予負(fù)載劑量的化合物1后和在腹膜內(nèi)插入滲透微型泵后，進(jìn)行左側(cè)胸廓切開(kāi)術(shù)，用6-0號(hào)絲縫合線對(duì)左前下行動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎。將胸廓逐層關(guān)閉，并在胸膜腔內(nèi)誘導(dǎo)負(fù)壓以使肺展開(kāi)。將進(jìn)行偽操作的動(dòng)物用相同的操作進(jìn)行處理，只是不進(jìn)行LAD結(jié)扎。手術(shù)后，使動(dòng)物在具有50％氧氣的30℃下的進(jìn)行了加熱的柜子中進(jìn)行恢復(fù)直至下一個(gè)早晨。為了防止恢復(fù)期間的脫水，在手術(shù)結(jié)束后立即給大鼠皮下給予5ml 5％的葡萄糖并在4p.m時(shí)再給予5ml 5％葡萄糖。為了緩解手術(shù)后的疼痛，在心肌梗死后，將大鼠用丁丙諾啡(20μg/100g，一日兩次皮下給藥)和美洛昔康(0.1mg/100g，一日一次皮下給藥)處理三天。在這項(xiàng)研究中，對(duì)給予患有心肌梗死(MI)大鼠的輸入劑量進(jìn)行調(diào)節(jié)以產(chǎn)生在0[基質(zhì)＝等滲的鹽水]，1.7±0.4nM[劑量1]、5.7±0.4[劑量2]、或93.7±12.3nM[劑量3]下的血漿濃度。在固相萃取后用質(zhì)譜對(duì)化合物1的血漿濃度進(jìn)行測(cè)量。所用的劑量如下面表1所示
表1

在LAD結(jié)扎后3周，通過(guò)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥(50mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。將動(dòng)物放置到加熱毯上以將其體溫維持在37℃。進(jìn)行氣管切開(kāi)術(shù)，并用Harvard嚙齒動(dòng)物通風(fēng)機(jī)用給大鼠通氧氣。對(duì)通風(fēng)機(jī)進(jìn)行調(diào)節(jié)以將動(dòng)脈pH維持在7.35-7.45。將PE50導(dǎo)管放置到股靜脈和動(dòng)脈中以分別用于靜脈內(nèi)給藥和動(dòng)脈壓力測(cè)量。在插入股靜脈內(nèi)導(dǎo)管后，通過(guò)靜脈內(nèi)給予泮庫(kù)溴銨(pancuronium)，1mg/kg來(lái)使動(dòng)物麻痹。通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸入等滲鹽水(50μl/分鐘)傳遞的的戊巴比妥(2.5mg/kg/h)和泮庫(kù)溴銨(1mg/kg/h)來(lái)維持麻醉和呼吸麻痹。通過(guò)右頸動(dòng)脈將聚乙烯導(dǎo)管插入到左心室中以測(cè)定左心室的末端舒張壓。在記錄左心室末端舒張壓后(LVEDP)，通過(guò)從離心臟幾毫米處切斷靜脈和動(dòng)脈來(lái)將心臟從身體上取下。用等滲的鹽水仔細(xì)對(duì)心臟上的血液進(jìn)行洗滌，對(duì)其進(jìn)行稱重，并將其放置在4％的中性的緩沖的福爾馬林中。
在固定后，將緊挨著心臟的大血管切割下來(lái)。其后，用由距離為1.5mm的平行的刀刃所組成的集合體將心臟平行地切成厚度為1.5mm的片。該薄片與心臟的長(zhǎng)軸相垂直。
將這些薄片放置到兩個(gè)組織學(xué)囊中，使得第一個(gè)薄片被放置到被隨機(jī)編號(hào)的囊中的一個(gè)中，第二個(gè)被放到另一個(gè)中，第三個(gè)被放到第一個(gè)中，以此類推。在包埋后，將這些薄片切成4μm厚的切片，將其用蘇木精-曙紅和Masson-trichrome進(jìn)行染色。
用具有按照預(yù)定步驟移動(dòng)的載物臺(tái)的顯微鏡，對(duì)用Masson-trichrome染色的載玻片進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)擊中纖維組織(被Masson-trichrome染藍(lán))和正常組織的點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。將顯微鏡與視頻照相機(jī)相連并在屏幕上對(duì)圖象進(jìn)行顯示。所用的形態(tài)測(cè)定法系統(tǒng)是得自O(shè)lympus，丹麥的Cast2。將梗死大小計(jì)算為心臟中纖維組織的％。
2.結(jié)果如圖11所示的那樣，化合物1的兩個(gè)最高劑量降低了心臟重量-體重比例，表明該化合物降低了心肌梗死的肥大后果(即，改型)。
如圖12所示的那樣，相對(duì)于患有心肌梗死但是用基質(zhì)進(jìn)行治療的大鼠而言，用化合物1治療3周將患有心肌梗死大鼠的梗死大小降低了20-50％。Tyhis表明化合物1在心肌局部缺血期間具有細(xì)胞保護(hù)作用。與這里所描述的相一致，這些數(shù)據(jù)表明化合物1通過(guò)可能涉及預(yù)防細(xì)胞膨脹的機(jī)理降低了心肌梗死的大小。因此，預(yù)防細(xì)胞膨脹可以預(yù)防圍繞著心臟組織的壓迫，從而防止了圍繞著健康組織的微循環(huán)的壓迫。因此，在本申請(qǐng)中，我們斷言這種原理可以預(yù)防任何器官中任何局部缺血損害的后果，所說(shuō)器官優(yōu)選但是非限制性地是具有狹窄的纖維囊的器官(例如心臟、腎)或被骨所圍繞著的器官(例如，腦、脊髓、骨髓)。
如圖13所示的那樣，患有心肌梗死但是用化合物1的任何一種劑量治療了3周的大鼠在心臟功能方面得到了更好的改善，正如通過(guò)左心室舒張壓降低所證明的那樣，左心室的充血減少。這種數(shù)據(jù)表明化合物1防止了心肌梗死后心臟功能的損害。
這里所公開(kāi)的所有參考資料都在這里被引入作為參考。已經(jīng)參考其優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，在考慮本公開(kāi)物時(shí)，可以在本發(fā)明主旨和范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行改變和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種關(guān)閉與應(yīng)激相接觸之細(xì)胞、組織或器官中的半通道的方法，該方法包括使應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞、組織或器官與治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物進(jìn)行接觸，其中所說(shuō)的接觸足以關(guān)閉應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞、組織或器官中的半通道。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的方法進(jìn)一步包括對(duì)連接蛋白43(Cx43)的酪氨酸殘基磷酸化和關(guān)閉半通道。
3.一種用于打開(kāi)細(xì)胞、組織或器官中的半通道的方法，該方法包括使細(xì)胞、組織或器官與治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物相接觸，其中所說(shuō)的接觸足以打開(kāi)細(xì)胞、組織或器官中的半通道。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包含使連接蛋白43(Cx43)的絲氨酸殘基脫磷酸化和打開(kāi)半通道。
5.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中的組織或器官的應(yīng)激的方法，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自上述式I或II所示化合物的化合物，其中的接觸足以預(yù)防或治療組織或器官中的應(yīng)激狀態(tài)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括使連接蛋白43(Cx43)的酪氨酸殘基磷酸化和關(guān)閉該半通道。
7.一種用于增加細(xì)胞、組織或器官中的間隙連接細(xì)胞內(nèi)通訊(GJIC)的方法，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物，其中所說(shuō)的接觸足以增加細(xì)胞、組織或器官中的GJIC。
8.一種治療燒傷的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的式I或II的化合物。
9.一種治療血栓形成的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的可以阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的式I或II的化合物。
10.一種治療呼吸性和代謝性酸中毒的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的式I或II的化合物。
11.一種治療病灶性心律不齊的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的式I或II的化合物。
12.一種治療和預(yù)防由血液葡萄糖水平升高所導(dǎo)致的細(xì)胞和組織損害的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的式I或II的化合物。
13.一種治療慢性心房纖維性顫動(dòng)的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的阻滯連接蛋白半通道開(kāi)放的式I或II的化合物。
14.一種治療癲癇的方法，其包括給予需要進(jìn)行該類治療的患者治療有效量的促進(jìn)連接蛋白半通道開(kāi)放的式I或II的化合物。
15.一種篩選調(diào)節(jié)半通道功能的候選化合物的方法，該方法包括使細(xì)胞與至少一種選自抗心律失常肽和式I或II所示化合物的化合物進(jìn)行接觸，該接觸是在有益于調(diào)節(jié)連接蛋白43(Cx43)的磷酸化作用的條件下進(jìn)行的；并且對(duì)Cx43磷酸化作用中的變化進(jìn)行檢測(cè)，其中將磷酸化作用的變化看成是半通道調(diào)節(jié)化合物的標(biāo)識(shí)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所說(shuō)的試驗(yàn)步驟進(jìn)一步包括在免疫學(xué)或基于細(xì)胞分選的測(cè)定中對(duì)候選化合物進(jìn)行試驗(yàn)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所說(shuō)的免疫學(xué)測(cè)定包括使細(xì)胞與候選化合物在足以增加或降低Cx43的磷酸化作用的條件下進(jìn)行接觸，產(chǎn)生細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物；并對(duì)作為半通道調(diào)節(jié)化合物標(biāo)識(shí)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的增加或降低的Cx43磷酸化作用進(jìn)行檢測(cè)。
18.如權(quán)利要求16-17所述的方法，其中所說(shuō)的免疫學(xué)測(cè)定是ELISA測(cè)定。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所說(shuō)的ELISA方法進(jìn)一步包括a)用與連接蛋白特異性結(jié)合的第一抗體對(duì)固體支撐物進(jìn)行涂布，b)使細(xì)胞溶解產(chǎn)物與該固體支撐物在有益于第一抗體和連接蛋白之間形成結(jié)合復(fù)合體的條件下進(jìn)行接觸，c)使該第一抗體連接蛋白結(jié)合復(fù)合體與第二抗體進(jìn)行接觸，該接觸是在足以在第二抗體和第一抗體連接蛋白結(jié)合復(fù)合體中的任何被磷酸化的連接蛋白之間形成特定的結(jié)合復(fù)合體的情況下進(jìn)行的，d)使該第一抗體連接蛋白第二抗體結(jié)合復(fù)合體與可結(jié)合第二抗體的可檢測(cè)標(biāo)記的第三抗體進(jìn)行接觸；和e)檢測(cè)作為該化合物的另一個(gè)標(biāo)識(shí)的該固體支撐物上所存在的可檢測(cè)標(biāo)記的第三抗體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的第三抗體是用生物素、FITC、TRITC、放射性碘或過(guò)氧化物酶中的至少一種進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記的。
21.如權(quán)利要求19-20所述的方法，其中所說(shuō)的第二抗體是抗-磷酸酪氨酸抗體。
22.如權(quán)利要求19-21所述的方法，其中所說(shuō)的第二抗體是抗-磷酸絲氨酸抗體。
23.如權(quán)利要求19-22所述的方法，其中所說(shuō)的可檢測(cè)標(biāo)記的第三抗體是通過(guò)放射閃爍計(jì)數(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所說(shuō)的免疫學(xué)方法是放射免疫測(cè)定(RIA)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所說(shuō)的免疫學(xué)方法是RIA測(cè)定并且所說(shuō)的方法進(jìn)一步包括a)在產(chǎn)生細(xì)胞溶胞產(chǎn)物之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記，其中所說(shuō)的標(biāo)記是在有助于對(duì)磷酸化連接蛋白進(jìn)行標(biāo)記的條件下進(jìn)行的，b)使該細(xì)胞溶胞產(chǎn)物與可以與該連接蛋白形成特定的結(jié)合復(fù)合體的抗體進(jìn)行接觸，c)將該結(jié)合復(fù)合體與該可測(cè)標(biāo)記的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物分開(kāi)；和d)對(duì)作為該間隙連接調(diào)節(jié)化合物的另一個(gè)標(biāo)識(shí)的標(biāo)記的、磷酸化的連接蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所說(shuō)的抗體是抗-連接蛋白抗體。
27.如權(quán)利要求25-26所述的方法，其中所說(shuō)的檢測(cè)步驟進(jìn)一步包括進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡測(cè)定。
28.如權(quán)利要求25-27所述的方法，其中所說(shuō)的可檢測(cè)標(biāo)記是放射性磷。
29.如權(quán)利要求15-29所述的方法，其中所說(shuō)的方法是在高處理量或超高處理量的篩選形式下進(jìn)行的。
30.如權(quán)利要求1-30所述的方法，其中所說(shuō)的化合物促進(jìn)了Cx43細(xì)胞內(nèi)C-末端區(qū)域的磷酸化作用。
31.如權(quán)利要求1-30所述的方法，其中所說(shuō)的化合物促進(jìn)了Cx43C-末端區(qū)域的脫磷酸化作用。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所說(shuō)的磷酸化作用部位是酪氨酸殘基。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所說(shuō)的脫磷酸化作用部位是絲氨酸殘基。
34.一種篩選調(diào)節(jié)半通道功能的候選化合物的方法，該方法包括1)對(duì)細(xì)胞、組織或器官例如那些得自心臟或肌肉的物質(zhì)的群體進(jìn)行培養(yǎng)，2)對(duì)該細(xì)胞、組織或器官優(yōu)選地通過(guò)剝奪氧氣或代謝抑制如通過(guò)加入葡萄糖衍生物來(lái)對(duì)其施加應(yīng)激，3)加入式I或II所示的已知或候選的半通道調(diào)節(jié)化合物，4)加入可檢測(cè)的指示劑如熒光、化學(xué)發(fā)光、或磷光性化合物，如熒光染料如鈣黃綠素及相關(guān)化合物，5)檢測(cè)相對(duì)于適宜對(duì)照而言的細(xì)胞、組織或器官中的可檢測(cè)指示劑的攝取改變；和6)任選地對(duì)該作為調(diào)節(jié)半通道功能化合物的標(biāo)識(shí)的改變進(jìn)行測(cè)量。
35.一種篩選調(diào)節(jié)半通道通能的候選化合物的方法，該方法包括1)對(duì)細(xì)胞、組織或器官例如那些得自心臟或肌肉的物質(zhì)的群體進(jìn)行培養(yǎng)，2)用可檢測(cè)的指示劑如熒光、化學(xué)發(fā)光、或磷光性化合物如染料，如鈣黃綠素或相關(guān)化合物對(duì)細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行裝填，3)通過(guò)對(duì)得自可檢測(cè)指示劑的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和定量來(lái)對(duì)細(xì)胞、組織或器官的體積進(jìn)行估計(jì)，4)加入式I或II所示的已知的或候選的半通道調(diào)節(jié)化合物，5)對(duì)該細(xì)胞、組織或器官優(yōu)選地通過(guò)剝奪氧氣或代謝抑制如通過(guò)加入葡萄糖衍生物來(lái)對(duì)其施加應(yīng)激，6)檢測(cè)相對(duì)于適宜對(duì)照而言的細(xì)胞體積改變；和7)任選地對(duì)作為調(diào)節(jié)半通道功能并任選地調(diào)節(jié)間隙連接功能化合物的標(biāo)識(shí)的改變進(jìn)行測(cè)量。
36.一種對(duì)需要該類治療的哺乳動(dòng)物的組織或器官進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)的方法，該方法包括使用治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物。
37.如權(quán)利要求37所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括使所說(shuō)的哺乳動(dòng)物的組織或器官遭受局部缺血情況。
38.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所說(shuō)的被細(xì)胞保護(hù)的器官與纖維囊或骨有關(guān)。
39.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所說(shuō)的器官是心、腎、腦、脊髓或骨髓。
40.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所說(shuō)的心臟已經(jīng)出現(xiàn)了梗死且局部缺血與心肌細(xì)胞膨脹有關(guān)。
41.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所說(shuō)的化合物是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)或(Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2)化合物2。
42.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中再灌注性損傷的方法，該方法包括給予治療有效量的至少一種選自式I或II所示化合物的化合物。
43.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所說(shuō)的方法進(jìn)一步包括使哺乳動(dòng)物的心臟出現(xiàn)梗死情況并且確立冠狀動(dòng)脈灌注。
44.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所說(shuō)的方法進(jìn)一步包括給予溶栓劑或提供冠狀血管成形術(shù)以促進(jìn)冠狀動(dòng)脈灌注到梗死的心臟中。
45.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所說(shuō)的化合物是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)或(Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2)化合物2。
全文摘要
公開(kāi)了用于調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織或器官中的半通道功能的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于對(duì)該類化合物，特別是那些能調(diào)節(jié)連接蛋白磷酸化作用的化合物進(jìn)行檢測(cè)的有用篩選。還提供了用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物受不希望的半通道功能影響的情況如心律不齊的治療方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1638790SQ03804968
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月29日
發(fā)明者J·S·彼得森, S·尼夫, M·S·尼爾森, E·邁耶, E·斯坦內(nèi)斯, P·H·詹森, B·D·拉森, L·B·L·漢森 申請(qǐng)人:Wyeth公司