專利名稱：膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙的制備和應(yīng)用背景技術(shù)膠體金免疫檢測試紙作為一種新的免疫學(xué)方法，發(fā)展極其迅速，在醫(yī)學(xué)檢測中得到了日益廣泛的應(yīng)用。它具有操作使用安全、簡便、快速、適于單人份檢測等優(yōu)點。在某些項目中，在膠體金表明固定某一檢測目標(biāo)的特異性抗體作為標(biāo)記物的膠體金免疫檢測試紙，已經(jīng)逐漸取代了傳統(tǒng)的放射性免疫檢測和酶聯(lián)免疫檢測。中國專利申請?zhí)?4239768.1以表面吸附人絨毛膜促性腺激素抗體的膠體金為標(biāo)記物，制備了用于早孕檢測的膠體金免疫檢測試紙；中國專利申請?zhí)?9203566.X以表面吸附乙肝抗體的膠體金為標(biāo)記物，制備了用于乙肝表面抗原檢測地膠體金免疫檢測試紙；中國專利申請?zhí)?1135100.4以表面吸附有特異性艾滋病多肽抗體的膠體金為標(biāo)記物，制備了用于艾滋病病毒的檢測的膠體金免疫檢測試紙。
但膠體金免疫檢測試紙在運用上具有以下缺點單純依靠顯色深淺來判斷結(jié)果的膠體金快速免疫檢測試紙，只能作定性或半定量檢測而不能做定量檢測；由于方法學(xué)的限制，只使用膠體金為標(biāo)記物的快速免疫檢測試紙，其靈敏度較低；對于某些抗原含量較低的樣品，由于膠體金免疫檢測試紙受靈敏度限制，會造成假陰性，因而檢出率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙的制備方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種膠體金和半導(dǎo)體納米熒光粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙的應(yīng)用。
由于半導(dǎo)體納米熒光粒子的激發(fā)譜在吸收閥值以上幾乎是連續(xù)的，譜峰較寬，利于多波長激發(fā)；高強(qiáng)度的熒光發(fā)射，譜峰窄，峰形對稱；發(fā)射波長隨著粒徑的增大而有規(guī)律的紅移，只需改變粒徑即可獲得多色發(fā)光；納米晶的發(fā)光穩(wěn)定性好，不容易被光分解和漂白。因此，有關(guān)半導(dǎo)體納米粒子作為新一代熒光生物標(biāo)記物研究已經(jīng)逐漸開展。當(dāng)膠體金與半導(dǎo)體納米粒子接近時，膠體金能有效淬滅CdTe半導(dǎo)體納米粒子的熒光。這種淬滅作用極其靈敏，而且是定量的。
檢測試紙條的制作步驟如下(1)膠體金的制備，膠體金通過用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備得到，膠體金表面帶有負(fù)電荷，粒徑為13-60nm；(2)膠體金與目標(biāo)抗原的一種抗體形成免疫復(fù)合物(I)，膠體金與目標(biāo)抗原的一種抗體混合攪拌，帶正電荷的抗體通過靜電作用吸附在膠體金上；(3)免疫復(fù)合物(I)的固定與干燥，將所述的免疫復(fù)合物(I)用百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到醋酸纖維素膜或硝酸纖維素膜上，形成膠體金墊，于36℃-37℃干燥待用；(4)半導(dǎo)體熒光納米粒子的制備，半導(dǎo)體熒光納米粒子為CdTe水溶性納米粒子，其粒徑為2-10nm；CdTe納米粒子用鎘鹽-硫醇(MSH)復(fù)合物與離子型碲源NaHTe在100℃加熱回流制得，控制回流時間，得到發(fā)光顏色不同的納米粒子水溶膠；回流5分鐘至2小時，得到綠色發(fā)光；回流3小時至8小時，得到黃色發(fā)光；回流9小時至14小時，得到橙色發(fā)光；回流15-20小時，得到紅橙色發(fā)光；回流21-24小時，得到紅色發(fā)光；(5)半導(dǎo)體熒光納米粒子與目標(biāo)抗原的另一種抗體形成免疫復(fù)合物(II)，半導(dǎo)體熒光納米粒子與目標(biāo)抗原的另一種抗體混合攪拌；(6)免疫復(fù)合物(II)的固定，將所述的免疫復(fù)合物(II)用百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到醋酸纖維素膜或硝酸纖維素上形成檢測帶；(7)將抗抗體(二抗)噴到膜上形成對照帶，用中性蛋白封閉對照帶，在36℃-37℃下干燥待用。


附圖1是膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙的示意圖。
圖中(1)樣品墊；(2)金墊，免疫復(fù)合物(I)固定于此；(3)層析方向；(4)檢測帶，免疫復(fù)合物(II)固定于此；(5)對照帶，固定有二抗。
在實際檢測應(yīng)用中，被測樣品滴在樣品墊上。當(dāng)免疫復(fù)合物(I)與樣品中目標(biāo)抗原結(jié)合后，層析至膜的檢測帶時，被免疫復(fù)合物(II)捕獲，通過肉眼對檢測帶進(jìn)行初步定性或半定量檢測。又由于膠體金對半導(dǎo)體熒光納米粒子具有熒光淬滅作用，通過熒光信號的變化對該檢測帶進(jìn)行定量檢測。在檢測靈敏度要求較低的分析樣時，先根據(jù)肉眼判斷，并根據(jù)需要對試紙條作定量檢測。同時只改變半導(dǎo)體熒光納米粒子的粒徑，即獲得多色發(fā)光，實現(xiàn)用不同粒徑的半導(dǎo)體熒光納米粒子標(biāo)記物進(jìn)行多項指標(biāo)檢測。
本發(fā)明將傳統(tǒng)的膠體金標(biāo)記和半導(dǎo)體熒光納米粒子標(biāo)記技術(shù)同時應(yīng)用于免疫檢測試紙的制備中。制備的檢測試紙，具有高靈敏度和高檢測率的特點。該檢測試紙能用于一項多檢的快速檢測；能檢測全血、血清、血漿、尿液等樣本；能用于乙肝表面抗原、人絨毛膜促性腺激素、艾滋病病毒的檢測。
具體實施例方式
如下實施例1直徑為13nm的膠體金與乙肝表面抗原(HBSAg)的一種單克隆抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物(I)，將免疫復(fù)合物(I)用百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到醋酸纖維素膜上，形成膠體金墊，于36℃干燥；直徑為2nm的CdTe納米晶與乙肝表面抗原的另一種單克隆抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物(II)，將免疫復(fù)合物(II)用百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到醋酸纖維素膜上形成檢測帶；將抗抗體(二抗)噴到膜上形成對照帶，以中性蛋白封閉后，在36℃下干燥待用，制得本發(fā)明所述膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙。
實施例2膠體金的直徑為30nm，CdTe的直徑為7nm，干燥溫度為37℃，試紙材料為硝酸纖維膜，其它制備條件與實施例1相同，制得本發(fā)明所述膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙。
實施例3膠體金的直徑40nm，CdTe的直徑為5nm，所用抗體為人絨毛膜促性腺激素(HCG)的兩種單克隆抗體，其它制備條件與實施例1相同，制得本發(fā)明所述膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙。
實施例4膠體金的直徑為60nm，CdTe的直徑為10nm，所用抗體為艾滋病病毒(HIV)的兩種單克隆抗體，干燥溫度為37℃，其它制備條件與實施例1相同，制得本發(fā)明所述膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙。
實施例5膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙對檢測靈敏度要求較低的HCG分析樣檢測示意圖，如附圖2所示。先根據(jù)肉眼判斷陰陽性，檢測帶和對照帶同時顯紅紫色，表明為陽性，再對結(jié)果為陽性的試紙用熒光信號作進(jìn)一步定量檢測。
實施例6膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙對初步篩選結(jié)果為陰性的HIV分析樣檢測示意圖，如附圖3所示，檢測帶不顯色，對照帶顯紅紫色。用熒光信號對檢測帶做進(jìn)一步檢測，檢出含量較低的抗原。如果檢測帶不顯示金的紅紫色，熒光信號也沒有淬滅，表明樣品為陰性。
實施例7一項多檢的膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速檢測試紙示意圖，如附圖4所示。圖中(4)為固定有發(fā)綠色光的CdTe納米晶和檢測指標(biāo)HIV所對應(yīng)的抗體組成的免疫復(fù)合物(I)；(5)為固定有發(fā)黃色光的CdTe納米晶和檢測指標(biāo)HCG所對應(yīng)的抗體組成的免疫復(fù)合物(II)；(6)為固定有發(fā)橙色光的CdTe納米晶和檢測指標(biāo)HBsAg對應(yīng)的免疫抗體所組成的免疫復(fù)合物(III)；(7)為對照帶；其它區(qū)域與附圖1相同。若(4)顯紅紫色，則可確診檢測樣中指標(biāo)HIV為陽性。對(4)處的熒光信號檢測，對樣品中指標(biāo)HIV定量檢測。若(5)顯紅紫色，則可確診檢測樣中指標(biāo)HCG為陽性。若(6)顯紅紫色，則可確診檢測樣中指標(biāo)HBsAg為陽性。若同時有多條檢測帶顯色，可根據(jù)上面的原則判斷樣品中多個指標(biāo)為陽性，并利用熒光信號進(jìn)行定量檢測。
權(quán)利要求
1.一種膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫試紙的制備，步驟如下(1)膠體金的制備，膠體金通過用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備得到，膠體金表面帶有負(fù)電荷，粒徑為13-60nm；(2)膠體金與目標(biāo)抗原的一種抗體形成免疫復(fù)合物(I)，膠體金與目標(biāo)抗原的一種抗體混合攪拌，帶正電荷的抗體通過靜電作用吸附在膠體金上；(3)免疫復(fù)合物(I)的固定與干燥，將所述的免疫復(fù)合物(I)用百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到醋酸纖維素膜或硝酸纖維素膜上，形成膠體金墊，于36℃-37℃干燥待用；(4)半導(dǎo)體熒光納米粒子的制備，半導(dǎo)體熒光納米粒子為CdTe水溶性納米粒子，其粒徑為2-10nm；CdTe納米粒子用鎘鹽-硫醇(MSH)復(fù)合物與離子型碲源NaHTe在100℃加熱回流制得，控制回流時間，得到發(fā)光顏色不同的納米粒子水溶膠；回流5分鐘至2小時，得到綠色發(fā)光；回流3小時至8小時，得到黃色發(fā)光；回流9小時至14小時，得到橙色發(fā)光；回流15-20小時，得到紅橙色發(fā)光；回流21-24小時，得到紅色發(fā)光；(5)半導(dǎo)體熒光納米粒子與目標(biāo)抗原的另一種抗體形成免疫復(fù)合物(II)，半導(dǎo)體熒光納米粒子與目標(biāo)抗原的另一種抗體混合攪拌；(6)免疫復(fù)合物(II)的固定，將所述的免疫復(fù)合物(II)用百德(Bio-Dot)儀的噴頭噴到醋酸纖維素膜或硝酸纖維素上形成檢測帶；(7)將抗抗體(二抗)噴到膜上形成對照帶，用中性蛋白封閉對照帶，在36℃-37℃下干燥待用。
2.權(quán)利要求1制備的膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫試紙用于乙肝表面抗原，人絨毛膜促性腺激素和艾滋病病毒的免疫檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膠體金和半導(dǎo)體熒光納米粒子雙標(biāo)記快速免疫檢測試紙的制備和應(yīng)用。本發(fā)明在傳統(tǒng)的膠體金免疫檢測的基礎(chǔ)上，又將半導(dǎo)體熒光納米粒子與目標(biāo)抗原的一種抗體形成的復(fù)合物固定在檢測帶上。既通過肉眼對檢測帶進(jìn)行初步定性或半定量檢測，又由于膠體金對熒光納米粒子具有熒光淬滅作用，通過熒光信號的變化對該檢測帶進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明將膠體金免疫技術(shù)和熒光納米標(biāo)記技術(shù)同時運用到快速檢測試紙上，既能進(jìn)行定性檢測同時又能做定量測定，并且實現(xiàn)一項多檢，省時省力，節(jié)約成本。
文檔編號G01N21/64GK1563951SQ20041001073
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者李景虹, 李軍, 李迪 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所