分泌cav-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2c1、由該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株分泌CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及由 該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒（Canlnadenovll.us，CAV)是迄今為止在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因復(fù)制機(jī)理等生物 學(xué)特性方面研宄得最為詳盡的病毒之一。腺病毒衣殼由三個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成：纖突、六鄰 體和五鄰體，其感染性強(qiáng)，形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，并且科研用途廣泛。目前，犬腺病毒已知血清型是 1型和2型，雖然兩者之間具有免疫交叉保護(hù)作用，但它們在病原性嗜性方面均不相同。這 兩種血清型腺病毒基因組的同源性在57-70%之間。犬腺病毒感染是犬的病毒性傳染病，主 要引起犬的肝炎、呼吸道病變及眼睛疾患等，還可引起狼、狐、哺乳動(dòng)物腦炎。近年來，國內(nèi) 外已證實(shí)存在兩種相互有關(guān)但各具特點(diǎn)的腺病毒：病毒1型（CAV-1)是犬傳染性肝炎和狐 貍腦炎的病原，且能導(dǎo)致眼睛損傷，而2型（CAV-2)則能引起犬的傳染性喉氣管炎、幼犬肺 炎和腸道癥狀。CAV-2感染病理變化常表現(xiàn)在呼吸道，表現(xiàn)肺膨脹不全，充血，并伴不同程度 的肝變、支氣管淋巴結(jié)充血，組織學(xué)檢查可見中度肺炎病變，支氣管上皮、隔細(xì)胞、鼻甲上皮 有核內(nèi)包涵體。
[0003] 單克隆抗體技術(shù)自問世的30多年來發(fā)展迅猛，目前已被成功地用于分子生物學(xué)、 免疫學(xué)等許多領(lǐng)域的研宄。在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，單克隆抗體對(duì)于疾病檢測治療發(fā)揮了重要作用。 膠體金免疫層析試紙條是快速、準(zhǔn)確、特異和靈敏的診斷方法，只需少量樣品，且樣品不需 處理，很短的時(shí)間里就能對(duì)是否染病做出準(zhǔn)確判斷，利于養(yǎng)殖單位早隔離、早治療，符合基 層養(yǎng)殖單位對(duì)于疾病快速診斷的要求。目前針對(duì)CAV-2的單克隆抗體及其診斷膠體金試紙 條的研制還沒有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供一株分泌CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C1。
[0005] 一株分泌CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C1，保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國微生物研宄所，保 藏編號(hào)為CGMCCNo. 10878,保藏日期為2015年5月27日。
[0006] 本發(fā)明的目的之二是提供一株上述雜交瘤細(xì)胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒單克隆 抗體。
[0007] 本發(fā)明的目的之三是提供上述雜交瘤細(xì)胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒單克隆抗體 在制備檢測CAV-2病原試劑中的應(yīng)用，具體表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：
[0008] 1、與雜交瘤細(xì)胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒單克隆抗體用于檢測CAV-2病原的免 疫膠體金試紙條的制備；
[0009] 2、與雜交瘤細(xì)胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒單克隆抗體用于檢測CAV-2病原夾心 ELISA方法的建立。
[0010] 雜交瘤細(xì)胞株7D7,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址 在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國微生物研宄所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10877,保藏 日期為2015年5月27日。
[0011] 本發(fā)明將實(shí)驗(yàn)室保存的CAV-2病毒接種于MDCK細(xì)胞上進(jìn)行增殖，當(dāng)80%的細(xì)胞出 現(xiàn)病變時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融三次，超聲30min，12000r/min離心lOmin，去除細(xì)胞碎片及較 大的雜質(zhì)。取上清，4°C，超速28000r/min離心2. 5h，取沉淀，用PBS重懸，12000r/min離心 lOmln，取其上清過非連續(xù)蔗糖密度梯度（60 % -40 % -30 % )，28000r/min離心2. 5h，取其 白色部分，加入大量PBS脫糖，28000r/min離心2. 5h，取其沉淀，用1. 5mlPBS重懸，最終獲 得CAV-2純化的病毒。
[0012] ELISA方法檢測結(jié)果表明：純化的CAV-2病毒能與CAV-2陽性抗體發(fā)生特異性反 應(yīng)，表明其具有良好的抗原性。
[0013] 取適量純化的病毒與弗氏佐劑1 : 1混合乳化，免疫6周齡BALB/C小鼠，按常規(guī) 方法取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，用純化的病毒作為檢測抗原，建立間接EL1SA方 法對(duì)有融合孔的細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測篩選陽性細(xì)胞克隆株，最終得到兩株單一的分泌特異 性抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆株，分別命名為2C1，7D7。
[0014]間接免疫熒光結(jié)果表明：2C1雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體能特異性識(shí)別CAV-2病毒而與MDCK細(xì)胞不反應(yīng)。
[0015] 本發(fā)明制備的2C1和另一雜交瘤細(xì)胞株7D7分泌的兩個(gè)單克隆抗體的疊加實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明：這兩個(gè)單克隆抗體為針對(duì)CAV-2病毒不同抗原表位的單抗。
[0016] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下：
[0017] 1、本發(fā)明所制備的單克隆抗體能很好的和CAV-2反應(yīng)，可用于臨床分離毒株的鑒 定。
[0018] 2、本發(fā)明所制備的2C1單克隆抗體和7D7單克隆抗體是識(shí)別CAV-2的兩個(gè)不同抗 原決定簇的單抗，因此說明本發(fā)明的單克隆抗體能用于檢測CAV-2病原膠體金的制備和夾 心ELISA方法的建立。
[0019] 保藏信息
[0020] 一、分泌抗CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C1
[0021] 分類命名：分泌抗CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0022] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；
[0023] 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國微生物研宄所；
[0024]保藏編號(hào)：CGMCCNo.10878 ;
[0025] 保藏日期：2015年5月27日。
[0026] 二、分泌抗CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株7D7
[0027] 分類命名：分泌抗CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0028] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；
[0029] 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國微生物研宄所；
[0030]保藏編號(hào)：CGMCCNo.10877 ;
[0031] 保藏日期：2015年5月27日。
【附圖說明】
[0032] 圖1為CAV-2特異性目的片段，1 :分子量標(biāo)準(zhǔn)DL1000 ;2, 3,4 :不同濃度CAV-2病 毒PCR產(chǎn)物；3 :陰性對(duì)照；
[0033] 圖2為CAV-2特異性目的片段PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分析；
[0034] 圖3為純化后CAV-2病毒蛋白活性的鑒定；
[0035] 圖4為抗CAV-2單克隆抗體間接免疫熒光的鑒定，a:2C1單抗，b:7D7單抗，c:陽 性鼠血清對(duì)照，d:sp2/0上清對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對(duì)本 發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0037] 本發(fā)明提供了一種識(shí)別不同抗原表位抗CAV-2單克隆抗體的制備方法，具體內(nèi)容 如下：
[0038] 1材料和方法
[0039] 1. 1材料、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑
[0040] 實(shí)驗(yàn)用BALB/c小鼠由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研宄所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；弗氏佐 劑、選擇試劑HAT、HT、融合劑PEG購于Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、培養(yǎng)基RPM11640購于 Gibco公司；抗生素購自大連寶生物工程有限公司。CAV-2由哈爾濱獸醫(yī)研宄所疫病診斷中 心保存。
[0041] 1. 2CAV-2的培養(yǎng)和基因組DNA的提取
[0042] 將病毒接種在MDCK細(xì)胞上，用含10 %牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待90 %細(xì)胞發(fā) 生病變后收獲病毒，將病毒培養(yǎng)物按病毒DNA提取試劑盒說明書上的方法制備基因組DNA 模板。
[0043] 1.3PCR鑒定
[0044] 利用DNSTAR生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)CAV-2的引物，上游引物為： 5'-CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC-3'，下游引物為：5' -CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT-3'。 以病毒DNA為模板，用高保真Taq酶（PyrobestDNA聚合酶，MB1公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶的位置，同時(shí)將PCR產(chǎn)物送出測序。
[0045] 1. 4CAV-2 的純化
[0046] 將鑒定為CAV-2的病毒接種于MDCK細(xì)胞上進(jìn)行增殖，當(dāng)80 %的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收