專利名稱：用指紋圖譜技術(shù)檢測中國勁酒質(zhì)量的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種中藥保健酒質(zhì)量檢測的方法，具體涉及用高效液相-氣相色譜指紋圖譜技術(shù)檢測由多種中藥原料制備的中國勁酒質(zhì)量的方法。
(二)現(xiàn)有技術(shù)中國勁酒是湖北勁牌公司生產(chǎn)的具有補氣、補腎、滋陰作用的保健酒，主要由黃芪、肉蓯蓉、仙茅、淫羊藿、枸杞、山藥、當歸、丁香、肉桂等幾種中藥材制備而成。在產(chǎn)品質(zhì)量控制方面，2000年以前，主要控制指標是顏色、固形物、酒精度、口感，2000年以后，在原有基礎上增加了淫羊藿苷、總黃酮、總皂甙、生物堿等定性或定量指標。但作為一個中藥復方保健酒，其保健功能作用機理及功能因子非常復雜，不可能通過控制幾個指標來完全控制產(chǎn)品質(zhì)量，而必須對它的物質(zhì)群整體予以控制。所以除了微觀分析外，還需要用某種宏觀分析方法，從整體上有效的來表征產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。中藥指紋圖譜系指某種或某產(chǎn)地的中藥材或中成藥經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段得到的能夠標示該中藥材或中成藥特征的色譜、光譜等圖譜。作為中藥質(zhì)量控制方法，國內(nèi)外對指紋圖譜的研究方興未艾。在國際上，圖譜作為中成藥、草藥提取物等含有混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法，已經(jīng)成為醫(yī)藥界共識。美國FDA(美國食品藥物管理局)對植物藥的質(zhì)量檢測要求必須制訂指紋圖譜的檢測標準，所以在申報IND(Investigational New Drug)的CMC(Chemistry，Manufacture and Control)資料時，植物物質(zhì)(Botanical DrugSubstance)和植物藥產(chǎn)品(Botanical Drug product)的質(zhì)量控制要采用指紋圖譜。歐共體對草藥的質(zhì)量控制也采用了指紋圖譜技術(shù)。日本把地道藥材飲片配方煎煮得到的煎汁作為標準提取物，標準提取物的指紋圖譜即為標準指紋圖譜，以此對生產(chǎn)的原料、配方和工藝作嚴格控制，使成品指紋圖譜與標準指紋圖譜一致。此外，法國、德國、英國、印度以及WHO等都采用指紋圖譜技術(shù)進行植物藥(草藥)的質(zhì)量評價。國家藥監(jiān)局于2000年下發(fā)《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術(shù)要求》，要求對中藥注射劑推行指紋圖譜質(zhì)控辦法。而其他中成藥制劑采用中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)作為質(zhì)量檢測標準也是中藥發(fā)展的必然趨勢。因此，采用指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)，在中藥及相關產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制、產(chǎn)品創(chuàng)優(yōu)以及生產(chǎn)過程控制等方面將發(fā)揮重要作用。
(三)技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的就是利用中藥指紋圖譜的整體性、特征性和可量化性，提出一種能從宏觀上、整體上檢測中國勁酒質(zhì)量的方法。同時，也為我國保健酒產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供示范。
本發(fā)明包括下述步驟第一步，建立中國勁酒對照指紋圖譜1.中國勁酒的制備取下述重量份的中藥原料黃芪10-15、肉蓯蓉10-15、仙茅10-15、淫羊藿10-15、枸杞10-15、山藥10-15、當歸10-15、丁香3-5、肉桂3-5以總藥材量50倍的30-50°小曲白酒滲漉12-15天得滲漉液，取滲漉液70-75份，分別加入40％糖漿20份、純凈水5-10份、焦糖色適量，調(diào)配，過濾，置常溫下陳釀3-6個月，過濾除雜，濾膜精濾，灌裝，即得；2.中國勁酒液相部分對照品溶液的制備a.乙醚部位取中國勁酒100ml，以大孔吸附色譜柱去糖，用水飽和乙醚萃取3次，每次20ml，合并萃取液，蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，濾膜過濾，即得；b.5％異戊醇的乙酸乙酯部位將乙醚部位供試品溶液用水飽和的5％異戊醇的乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并萃取液，蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，濾膜過濾，即得；3.中國勁酒氣相部分對照品溶液的制備直接取中國勁酒5ml于10ml頂空進樣瓶中，加蓋密封，即得；4.標準品溶液的制備a.液相部分取阿魏酸標準品適量，用50％甲醇制成1mg/ml的溶液；取淫羊藿苷標準品適量，用50％甲醇制成1mg/ml的溶液；b.氣相部分用玻璃毛細管蘸取乙酸龍腦酯、丁香酚標準品適量于頂空進樣瓶中，密封，即得；5.色譜條件a.液相部分色譜柱乙醚部位Hypersil C18柱，5％異戊醇的乙酸乙酯部位Aichrombond AQ C18，流動相乙醚部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫；5％異戊醇的乙酸乙酯部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫；流速0.8ml/分鐘檢測波長280nm柱溫30℃b.氣相部分色譜柱Agilent HP-5載氣為N2進樣器G1888A頂空自動進樣器；
6.對照品檢測a.液相部分乙醚部位分別精密吸取中國勁酒液相部分乙醚部位對照品溶液與標準品溶液各4μl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，即得中國勁酒乙醚部位對照指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；5％異戊醇的乙酸乙酯部位分別精密吸取中國勁酒液相部分5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照品溶液與標準品溶液各4μl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，即得5％戊醇的乙酸乙酯部位對照異指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；b.氣相部分分別將氣相部分對照品溶液和標準品溶液按頂空進樣器自動進樣進行分析測定，即得氣相部分對照指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；所述中國勁酒對照指紋圖譜中，液相部分乙醚部位的對照指紋圖譜中共有特征峰10個，其中7號峰為阿魏酸，5％戊醇的乙酸乙酯部位對照指紋圖譜中共有特征峰9個，其中11號峰為淫羊藿苷，與標準品指紋圖譜一致；所述氣相部分對照指紋圖譜中共有特征峰8個，其中7號峰為乙酸龍腦酯，8號峰為丁香酚，與標準品指紋圖譜一致；所述中國勁酒液相部分乙醚部位和5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照品溶液制備的具體方法是，取中國勁酒100ml，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，上樣于裝有AB-8的大孔吸附層析柱上(12mm×300mm)，用水洗脫至無糖反應，(即Molish反應為陰性)，后用80ml95％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干。加入20ml水，超聲使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。先用水飽和乙醚萃取3次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，搖勻，用0.45μ微孔濾膜過濾，即得乙醚部位對照品溶液；再將此溶液用水飽和的5％異戊醇的乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并萃取液，減壓蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，搖勻，用0.45μ微孔濾膜過濾，即得5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照品溶液；所述液相部分乙醚部位以乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，其洗脫梯度為在保留時間為0min、45min、80min、90min、105min時，乙腈與0.01％磷酸水溶液的體積比分別為8∶92，30∶70，50∶50，80∶20，80∶20；5％異戊醇的乙酸乙酯部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，其洗脫梯度為在保留時間為0min、50min、80min、100min、110min時，乙腈與0.01％磷酸水溶液的體積比分別為15∶85，30∶70，55∶45，100∶0，100∶0；所述計算機輔助相似性評價系統(tǒng)系指藥典委員會推薦的由湖南中南大學中藥現(xiàn)代化研究中心開發(fā)的計算機輔助相似性評價系統(tǒng)；中國勁酒對照指紋圖譜的建立，使產(chǎn)品的質(zhì)量控制有了非常明確、直觀、易于操作的標準，使用時只需將檢測結(jié)果與之進行比較即可。
第二步，建立中國勁酒指紋圖譜共有模式圖譜按中國勁酒的制備方法、中國勁酒液相部分和氣相部分對照品溶液的制備方法、標準品溶液的制備方法制備10個批次的中國勁酒和標準品、供試品溶液，并逐一按相同方法檢測，分別得到各批次中國勁酒乙醚部位指紋圖譜、5％異戊醇的乙酸乙酯部位指紋圖譜、氣相部分指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；分別輸入計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，即可得出中國勁酒乙醚部位、5％異戊醇的乙酸乙酯部位及氣相部分的指紋圖譜共有模式圖譜；建立共有模式圖譜的作用一是可以將檢測結(jié)果輸入計算機計算供試品與共有模式圖譜之間的相關系數(shù)，從理論上考察供試品與共有模式圖譜之間的相似度，從而達到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的；二是方便多個批次的產(chǎn)品之間進行比較，以考察生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，產(chǎn)品的穩(wěn)定性，以確保為消費者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。
第三步，供試品檢測1.供試品溶液的制備以上述相同方法分別制備液相部分乙醚部位和5％異戊醇的乙酸乙酯供試品溶液及氣相部分供試品溶液；2.以上述相同方法分別制備液相部分和氣相部分標準品溶液；3.以上述相同方法測定待測的標準品和供試品；4.結(jié)果分析判定乙醚部位供試品指紋圖譜中應檢出與對照指紋圖譜相同的10個特征峰，其中7號峰為阿魏酸，應與標準品指紋圖譜一致；5％異戊醇的乙酸乙酯部位供試品指紋圖譜中應檢出與對照指紋圖譜相同的9個特征峰；其中11號峰為淫羊藿苷，應與標準品指紋圖譜一致；兩個部分的指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)應大于0.9000；氣相部分供試品指紋圖譜中應檢出與對照指紋圖譜相同的8個特征峰；其中7號峰為乙酸龍腦酯，8號峰為丁香酚，應與標準品指紋圖譜一致；其指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)應大于0.9000；本發(fā)明的原理是基于中國勁酒中含有大量非揮發(fā)性成分和部分原料中含有揮發(fā)性成分，而且非揮發(fā)性成分在紫外區(qū)有較強的吸收，由于中國勁酒是由多位藥材制備而成，化學成分復雜，根據(jù)其主要化學成分的性質(zhì)，將成品分離成乙醚部位和5％異戊醇的乙酸乙酯部位，分別采用液相和氣相色譜對非揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分進行檢測；在研究過程中還分別對提取方法、檢測方法、色譜條件與系統(tǒng)適應性、精密性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等進行考察，根據(jù)10批以上中試產(chǎn)品的檢測結(jié)果，建立了產(chǎn)品對照指紋圖譜和共有模式圖譜；并確定供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜之間的相關系數(shù)為0.9000；因此，從色譜的整體面貌特征上能把握中國勁酒的質(zhì)量情況。
下面是對本方法進行考察的部分結(jié)果(1)重現(xiàn)性試驗取同一樣品溶液，按供試品制備方法及檢測方法操作6次，計算相似度，結(jié)果表明，中國勁酒乙醚部位和5％異戊醇的乙酸乙酯部位的液相指紋圖譜和氣相部分指紋圖譜6次檢測結(jié)果的相似度均大于0.9000，方法重現(xiàn)性較好；(2)十批樣品指紋圖譜相似度考察對隨機收集的10個批次中國勁酒指紋圖譜進行相似度考察，計算結(jié)果顯示，10個批次的相似度均大于0.9000，提示本方法不僅能從整體上控制勁酒產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，還能對生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品的穩(wěn)定性進行有效的監(jiān)控；(3)市售同類產(chǎn)品比較用本方法對市售8種同類產(chǎn)品進行檢測，比較各產(chǎn)品指紋圖譜，可以明顯的看出這8種保健酒的乙醚部位和5％異戊醇的乙酸乙酯部位的液相指紋圖譜與本公司生產(chǎn)的中國勁酒均有很大的差異，說明本發(fā)明的檢測方法具有較好的專屬性和特征性；不僅能控制產(chǎn)品質(zhì)量，還能對本公司產(chǎn)品進行有效識別；四

圖1是中國勁酒乙醚部位對照指紋圖譜圖2是中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照指紋圖譜圖3是中國勁酒成品氣相部分對照指紋圖譜圖4是中國勁酒乙醚部位共有模式圖譜圖5是中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位共有模式圖譜圖6是中國勁酒氣相部分共有模式圖譜圖7是批號為20041220中國勁酒乙醚部位指紋圖譜圖8是批號為20041220中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位指紋圖譜
圖9是批號為20041220中國勁酒氣相部分指紋圖譜圖10是批號為20050425中國勁酒乙醚部位指紋圖譜圖11是批號為20050425中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位指紋圖譜圖12是批號為20050425中國勁酒氣相部分指紋圖譜圖13是批號為20050723中國勁酒乙醚部位指紋圖譜圖14是批號為20050723中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位指紋圖譜圖15是批號為20050723中國勁酒氣相部分指紋圖譜圖16是20041220、20050425、20050723三個批號中國勁酒乙醚部位指紋圖譜相似度評價結(jié)果17是20041220、20050425、20050723三個批號中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位指紋圖譜相似度評價結(jié)果18是20041220、20050425、20050723三個批號中國勁酒氣相部分指紋圖譜相似度評價結(jié)果19是阿魏酸標準品指紋圖譜圖20是淫羊藿苷標準品指紋圖譜圖21是乙酸龍腦酯標準品指紋圖譜圖22是丁香酚標準品指紋圖譜具體實施例方式實施例1批號為20041220中國勁酒的質(zhì)量檢測1、樣品來源 勁牌公司倉庫2、樣品批號 200412203、標準品溶液的制備a.液相部分取阿魏酸標準品適量，用50％甲醇制成1mg/ml的溶液；取淫羊藿苷標準品適量，用50％甲醇制成1mg/ml的溶液；b.氣相部分用玻璃毛細管蘸取乙酸龍腦酯、丁香酚標準品適量于頂空進樣瓶中，密封，即得；4、供試品溶液的制備取批號為20041220的中國勁酒100ml，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，上樣于裝有AB-8的大孔吸附層析柱上(12mm×300mm)，用水洗脫至無糖反應，(即Molish反應為陰性)，后用80ml 95％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干。加入20ml水，超聲使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。先用水飽和乙醚萃取3次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，搖勻，用0.45μ微孔濾膜過濾，即得乙醚部位供試品溶液；再將此溶液用水飽和的5％異戊醇的乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并萃取液，減壓蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，搖勻，用0.45μ微孔濾膜過濾，即得5％異戊醇的乙酸乙酯部位供試品溶液；5、主要儀器與試藥a.儀器色譜儀 瓦里安公司儀器(230泵330檢測器7725i手動進樣器AT-830柱溫箱)及Agilent6890日本EYELA1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀b.試藥乙醚 天津產(chǎn) 分析純異戊醇 天津產(chǎn) 分析純乙酸乙酯 北京產(chǎn) 分析純乙腈USAJ.T.Baker色譜純磷酸 北京產(chǎn) 分析純水樂百氏純凈水一次蒸餾N2高純氮氣，純度99.999％中國勁酒樣品 湖北勁牌公司生產(chǎn)
6.色譜條件a.液相部分色譜柱乙醚部位Hypersil BDS C18，4.6×250mm，5μm5％異戊醇的乙酸乙酯部位Aichrombond AQ C18，4.6×250mm，5um流動相乙醚部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，在保留時間為0min、45min、80min、90min、105min時，乙腈與0.01％磷酸水溶液的體積比分別為8∶92，30∶70，50∶50，80∶20，80∶20；5％異戊醇的乙酸乙酯部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，在保留時間為0min、50min、80min、100min、110min時，乙腈與0.01％磷酸水溶液的體積比分別為15∶85，30∶70，55∶45，100∶0，100∶0；流速0.8ml/分鐘檢測波長280nm柱溫30℃b.氣相部分色譜柱Agilent HP-5，30m×320m×0.25μm進樣口溫度230℃FID檢測器溫度260℃升溫程序初始60℃，保持12min，6℃/min升至210℃，保持3min載氣為N2，流速1.0ml/min，恒流方式，分流比5∶1進樣器G1888A頂空自動進樣器，頂空瓶溫度85℃，進樣閥溫度100℃，傳輸線溫度115℃，頂空瓶平衡時間15min，頂空瓶充壓時間0.5min，定量環(huán)填充時間0.2min，定量環(huán)平衡時間0.5min，進樣時間1.0min；7、檢測
a.液相部分乙醚部位分別精密吸取乙醚部位供試品溶液及標準品溶液各4μl注入液相色譜儀，照《中國藥典》2000版一部附錄高效液相色譜法測定，得乙醚部位指紋圖譜及標準品指紋圖譜5％異戊醇的乙酸乙酯部位分別精密吸取5％異戊醇的乙酸乙酯部位供試品及標準品溶液各4μ1，注入液相色譜儀，照《中國藥典》2000版一部附錄高效液相色譜法測定，得5％異戊醇的乙酸乙酯部位指紋圖譜及標準品指紋圖譜；b.氣相部分直接取上述批號的中國勁酒于頂空進樣瓶中，加蓋密封；按頂空進樣器自動進樣進行分析測定，得氣相部分指紋圖譜及標準品指紋圖譜；8、結(jié)果分析判定a.所得批號為20041220中國勁酒乙醚部位供試品指紋圖譜中檢出了與相照指紋圖譜相同的10個特征峰；其中7號峰為阿魏酸，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9899，大于0.9000，符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
b.所得批號為20041220中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的9個特征峰；其中11號峰為淫羊藿苷，與標準品指紋圖譜一致，供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)應為0.9617，大于0.9000；符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
c.所得批號為20041220中國勁酒氣相部分供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的8個特征峰；其中7號峰為乙酸龍腦脂，8號峰為丁香酚，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9746，大于0.9000；符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
實施例2批號為20050425中國勁酒的質(zhì)量檢測1、樣品來源 勁牌公司倉庫2、樣品批號 200504253、標準品溶液的制備 同實施例14、供試品溶液的制備 同實施例15、主要儀器與試藥同實施例16、色譜條件 同實施例17、檢測 按實施例1相同步驟和方法分別對標準品溶液、本批號供試品溶液的液相部分和氣相部分進行檢測，分別得到相應的標準品、乙醚部位、5％異戊醇的乙酸乙酯部位、氣相部分指紋圖譜；8、結(jié)果分析判定a.所得批號為20050425中國勁酒乙醚部位供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的10個特征峰；其中7號峰為阿魏酸，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9890，大于0.9000，符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
b.所得批號為20050425中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的9個特征峰；其中11號峰為淫洋藿苷，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9837，大于0.9000；符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
c.所得批號為20050425中國勁酒氣相部分供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的8個特征峰；其中7號峰為乙酸龍腦脂，8號峰為丁香酚，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9953，大于0.9000；符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
實施例3批號為20050723中國勁酒的質(zhì)量檢測1、樣品來源 勁牌公司倉庫2、樣品批號 200507233、標準品溶液的制備 同實施例14、供試品溶液的制備 同實施例15、主要儀器與試藥同實施例16、色譜條件 同實施例17、檢測 按實施例1相同步驟和方法分別對標準品溶液、本批號供試品溶液的液相部分和氣相部分進行檢測，分別得到相應的標準品、乙醚部位、5％異戊醇的乙酸乙酯部位、氣相部分指紋圖譜；8、結(jié)果分析判定a.所得批號為20050723中國勁酒乙醚部位供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的10個特征峰；其中7號峰為阿魏酸，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9972，大于0.9000，符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
b.所得批號為20050723中國勁酒5％異戊醇的乙酸乙酯部位供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的9個特征峰；其中11號峰為淫洋藿苷，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9427，大于0.9000；符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
c.所得批號為20050723中國勁酒氣相部分供試品指紋圖譜中檢出了與對照指紋圖譜相同的8個特征峰；其中7號峰為乙酸龍腦脂，8號峰為丁香酚，與標準品指紋圖譜一致；供試品指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)為0.9930，大于0.9000；符合本公司制定的相關質(zhì)量標準規(guī)定。
實施例4三批中國勁酒(批號20041220、20050425、20050723)指紋圖譜相似度評價將實施例1、實施例2、實施例3所測得的20041220、20050425、20050723三個批號的各部位指紋圖譜分別輸入計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，其相關系數(shù)分別為乙醚部位0.9899 0.9890 0.9972，5％異戊醇的乙酸乙酯部位0.9617 0.9837 0.9427氣相部分0.9746 0.9953 0.9930，均大于0.9000，說明三個批次之間質(zhì)量差異不大，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.用指紋圖譜技術(shù)檢測中國勁酒質(zhì)量的方法，包括以下步驟第一步，建立中國勁酒對照指紋圖譜(1)中國勁酒的制備取下述重量份的中藥原料黃芪10-15、肉蓯蓉10-15、仙茅10-15、淫羊藿10-15、枸杞10-15、山藥10-15、當歸10-15、丁香3-5、肉桂3-5，以總藥材量50倍的30-50°小曲白酒滲漉12-15天得滲漉液，取滲漉液70-75份，分別加入40％糖漿20份、純凈水5-10份、焦糖色適量，調(diào)配，過濾，置常溫下陳釀3-6個月，過濾除雜，濾膜精濾，灌裝，即得；(2)中國勁酒液相部分對照品溶液的制備a.乙醚部位取中國勁酒100ml，以大孔吸附色譜柱去糖，用水飽和乙醚萃取3次，每次20ml，合并萃取液，蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，濾膜過濾，即得；b.5％異戊醇的乙酸乙酯部位將乙醚部位對照品溶液用水飽和的5％異戊醇的乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并萃取液，蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，濾膜過濾，即得；(3)中國勁酒氣相部分對照品溶液的制備直接取中國勁酒5ml于10ml頂空進樣瓶中，加蓋密封，即得；(4)標準品溶液的制備a.液相部分取阿魏酸標準品適量，用50％甲醇制成1mg/ml的溶液；取淫羊藿苷標準品適量，用50％甲醇制成1mg/ml的溶液；b.氣相部分用玻璃毛細管蘸取乙酸龍腦酯、丁香酚標準品適量于頂空進樣瓶中，密封，即得；(5)色譜條件a.液相部分色譜柱乙醚部位Hypersil C18柱，5％異戊醇的乙酸乙酯部位Aichrombond AQ C18，流動相乙醚部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫；5％異戊醇的乙酸乙酯部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫；流速0.8ml/分鐘檢測波長280nm柱溫30℃b.氣相部分色譜柱Agilent HP-5載氣為N2進樣器G1888A頂空自動進樣器；(6)對照品檢測a.液相部分乙醚部位分別精密吸取中國勁酒液相部分乙醚部位對照品溶液與標準品溶液各4μl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，即得中國勁酒乙醚部位對照指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；5％異戊醇的乙酸乙酯部位分別精密吸取中國勁酒液相部分5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照品溶液與標準品溶液各4μl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，即得5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；b.氣相部分分別將氣相部分對照品溶液和標準品溶液按頂空進樣器自動進樣進行分析測定，即得氣相部分對照指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；第二步，建立中國勁酒指紋圖譜共有模式圖譜按中國勁酒的制備方法、中國勁酒液相部分和氣相部分對照品溶液的制備方法、標準品溶液的制備方法分別制備10個批次的中國勁酒和待測的標準品、供試品溶液，并逐一按相同方法檢測，分別得到各批次中國勁酒乙醚部位指紋圖譜、5％異戊醇的乙酸乙酯部位指紋圖譜、氣相部分指紋圖譜和相應的標準品指紋圖譜；分別輸入計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，即可得出中國勁酒乙醚部位、5％異戊醇的乙酸乙酯部位及氣相部分的指紋圖譜共有模式圖譜；第三步，供試品檢測1.供試品溶液的制備以上述相同方法分別制備液相部分乙醚部位和5％異戊醇的乙酸乙酯供試品溶液及氣相部分供試品溶液；2.以上述相同方法分別制備液相部分和氣相部分標準品溶液；3.以上述相同方法測定待測的標準品和供試品；4、結(jié)果分析判定乙醚部位供試品指紋圖譜中應檢出與對照指紋圖譜相同的10個特征峰，其中7號峰為阿魏酸，應與標準品指紋圖譜一致；5％異戊醇的乙酸乙酯部位供試品指紋圖譜中應檢出與對照指紋圖譜相同的9個特征峰；其中11號峰為淫洋藿苷，應與標準品指紋圖譜一致；兩個部分的指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)應大于0.9000；氣相部分供試品指紋圖譜中應檢出與對照指紋圖譜相同的8個特征峰；其中7號峰為乙酸龍腦脂，8號峰為丁香酚，應與標準品指紋圖譜一致；其指紋圖譜與相應的共有模式圖譜經(jīng)計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行計算，相關系數(shù)應大于0.9000；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用指紋圖譜技術(shù)檢測中國勁酒質(zhì)量的方法，其特征在于所述中國勁酒液相部分乙醚部位和5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照品溶液制備的具體方法是，取中國勁酒100ml，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，上樣于裝有AB-8的大孔吸附層析柱上(12mm×300mm)，用水洗脫至無糖反應，(即M0lish反應為陰性)，后用80ml95％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干。加入20ml水，超聲使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。先用水飽和乙醚萃取3次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，搖勻，用0.45微孔濾膜過濾，即得乙醚部位對照品溶液；再將此溶液用水飽和的5％異戊醇的乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并萃取液，減壓蒸干，用四氫呋喃定容至2ml，搖勻，用0.45微孔濾膜過濾，即得5％異戊醇的乙酸乙酯部位對照品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用指紋圖譜技術(shù)檢測中國勁酒質(zhì)量的方法，其特征在于所述液相部分乙醚部位以乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，其洗脫梯度為在保留時間為0min、45min、80min、90min、105min時，乙腈與0.01％磷酸水溶液的體積比分別為8∶92，30∶70，50∶50，80∶20，80∶20；5％異戊醇的乙酸乙酯部位乙腈-0.01％磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，其洗脫梯度為在保留時間為0min、50min、80min、100min、110min時，乙腈與0.01％磷酸水溶液的體積比分別為15∶85，30∶70，55∶45，100∶0，100∶0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用指紋圖譜技術(shù)檢測中國勁酒質(zhì)量的方法，其特征在于所述計算機輔助相似性評價系統(tǒng)系指藥典委員會推薦的由湖南中南大學中藥現(xiàn)代化研究中心開發(fā)的計算機輔助相似性評價系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用指紋圖譜技術(shù)檢測中國勁酒質(zhì)量的方法，該方法包括下述步驟第一步，建立中國勁酒對照指紋圖譜；第二步，建立中國勁酒指紋圖譜共有模式圖譜；第三步，供試品檢測；將所測得的供試品圖譜與對照指紋圖譜進行比較，并輸入計算機輔助相似性評價系統(tǒng)進行相似度計算，得出相關系數(shù)，便可作出檢測結(jié)論；本方法具有以下特點(1)可以從整體上、宏觀上控制中國勁酒的質(zhì)量；(2)明確、直觀，具有較好的專屬性和特征性，重現(xiàn)性好；可操作性強；(3)可用于生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的考察；(4)可用于鑒別中國勁酒的真?zhèn)危?5)為我國保健酒行業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)控提供示范。
文檔編號G01N1/28GK1991361SQ200510120579
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者劉勝華, 李波, 李先芝, 屠鵬飛, 鮑忠 申請人:勁牌有限公司