專利名稱：一種檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
磺胺喹噁啉(Sulfaquinoxaline SQX)屬磺胺類抗生素兼有抗球蟲作用，廣泛用于養(yǎng)禽業(yè)，其口服后吸收迅速，但排泄緩慢，殘留在組織器官及雞蛋中時(shí)間長(zhǎng)，人食用后，對(duì)人體產(chǎn)生耐藥性等副作用。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定動(dòng)物組織、奶的最高殘留限量(MRL)值為100μg/kg。日本等國(guó)規(guī)定肉雞中不得檢出。因此，為保證產(chǎn)品的安全及對(duì)外貿(mào)易暢通，加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物性食品中磺胺喹噁啉的殘留檢測(cè)是非常必要的。
檢測(cè)磺胺喹噁啉殘留量的化學(xué)方法主要有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高壓液相色譜法(HPLC)、氣—質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC-MS)、液—質(zhì)聯(lián)機(jī)(HPLC/MS)、毛細(xì)管電泳(CE)等、由于復(fù)雜的一起設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)磺胺喹噁啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺喹噁啉特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)磺胺喹噁啉半抗原；當(dāng)所述包被原為磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)磺胺喹噁啉半抗原。
所述磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將磺胺喹噁啉半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或水溶性碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述磺胺喹噁啉半抗原是將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)得到的。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選堿性磷酸酯酶；堿性磷酸酯酶標(biāo)記抗抗體可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法如戊二醛法或過碘酸鈉法將酶交聯(lián)在抗抗體上；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的磺胺喹噁啉半抗原可采用活性酯法或水溶性碳化二亞胺法將堿性磷酸酯酶與磺胺喹噁啉半抗原偶聯(lián)得到。所述磺胺喹噁啉半抗原是將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)得到的。酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；所述酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液為含有0.05％甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)溶液。
所述磺胺喹噁啉特異性抗體可為磺胺喹噁啉單克隆抗體或磺胺喹噁啉多克隆抗體；它們均是用磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述磺胺喹噁啉單克隆抗體為磺胺喹噁啉鼠單克隆抗體，所述磺胺喹噁啉多克隆抗體優(yōu)選為磺胺喹噁啉兔多克隆抗體。所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體，優(yōu)選為羊抗兔抗抗體。抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體工作液所用的抗體稀釋液為含有0.5％BSA的磷酸鹽緩沖液。
所述磺胺喹噁啉單克隆抗體優(yōu)選為磺胺喹噁啉的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1CGMCC No.1615分泌的單克隆抗體。
所述磺胺喹噁啉的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1 CGMCC No.1615已于2006年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。
以上抗體均可以用磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白常用載體蛋白；所述磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將磺胺喹噁啉半抗原和載體蛋白用水溶性碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為六個(gè)濃度梯度含有磺胺喹噁啉藥物的溶液，所用的磺胺喹噁啉藥物稀釋液為含0.1-0.5％N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)的去離子水。
所述濃縮洗滌液為pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫-80，0.1％的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
所述當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮復(fù)溶液為pH值為7.2，0.02mol/L含0.1-0.5％N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH值為6.4，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液；所述封閉液是含有3-10％的牛血清，1％酪蛋白的pH值為7.2，0.02mol/L磷酸緩沖溶液；所述終止液為1～2mol/L的氫氧化鈉、鹽酸或氫氧化鈉溶液。
所用的包被磺胺喹噁啉抗原或抗抗體的載體的物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等，載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
本發(fā)明提供的檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法，是利用所述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)磺胺喹噁啉。
所述檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法還可包括樣品的前處理，所述方法還包括對(duì)樣品的前處理本發(fā)明所提供的檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織時(shí)，將樣品勻漿，稱取3±0.1g勻漿物，加入9ml乙腈—水溶液(乙腈和水的體積比是85∶15)混合均勻，3000rpm離心，取4ml上清液，加入2mol/L氯化鈉溶液2ml和7ml乙酸乙酯，混合均勻，3000rpm離心5-10分鐘，取上層液，用氮?dú)獯蹈?，加入正己?ml振蕩均勻，再用稀釋1倍的上述濃縮復(fù)溶液1ml混合2min，3000rpm離心5-10分鐘，除去上層液，取下層液進(jìn)行分析；當(dāng)樣品為尿樣時(shí)，用3ml稀釋1倍的上述濃縮復(fù)溶液與1ml經(jīng)離心得到尿樣上清液體混合均勻，即可進(jìn)行分析；當(dāng)樣品為血清血漿時(shí)，3000rpm離心5min，取上層液即可進(jìn)行分析；蜂蜜取2ml蜂蜜，加入4ml重蒸餾水，再加乙酸乙酯振蕩均勻，3000rpm離心10分鐘。取1ml上層液用氮?dú)獯蹈?，殘留物用稀?倍的上述濃縮復(fù)溶液1ml溶解，即可進(jìn)行分析。
2)利用上述檢測(cè)磺胺喹噁啉的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織、血清血漿、尿樣、蜂蜜等樣品中磺胺喹噁啉殘留量。
本發(fā)明的檢測(cè)磺胺喹噁啉的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織等樣品中磺胺喹噁啉的含量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品。
磺胺喹噁啉是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)方法合成磺胺喹噁啉半抗原，給磺胺喹噁啉接出了一個(gè)含苯環(huán)的間隔臂，這樣突出了磺胺喹噁啉分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——喹噁啉。同時(shí)也增加了半抗原的抗原性。再將磺胺喹噁啉采用水溶性碳化二亞胺法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對(duì)免疫不利，半抗原與OVA、HSA和MSA的結(jié)合摩爾比分別為9∶1；7∶1和13∶1。
本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織、血清、尿樣、蜂蜜、牛奶及飼料等樣品中磺胺喹噁啉的殘留量。本發(fā)明的檢測(cè)原理是當(dāng)微孔條上預(yù)包被磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和磺胺喹噁啉抗體工作液后，樣本中殘留的磺胺喹噁啉和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺喹噁啉的抗體，加入酶標(biāo)記二抗進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止；當(dāng)微孔條上包被抗抗體時(shí)，加入磺胺喹噁啉抗體工作液后，再加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和酶標(biāo)抗原，樣品殘留的磺胺喹噁啉和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺喹噁啉抗體，顯色；顯色終止后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)，樣本吸光度值與其殘留物磺胺喹噁啉的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物磺胺喹噁啉的含量。也可根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品溶液顏色的深淺，與系列濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)液顏色比較判斷樣品中磺胺喹噁啉的濃度范圍。
本發(fā)明的檢測(cè)磺胺喹噁啉的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織、飼料及尿液等樣品中磺胺喹噁啉的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；采用高特異性的磺胺喹噁啉單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利，檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。


圖1為以磺胺喹噁啉抗原為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)曲線2為以磺胺喹噁啉抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、以磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測(cè)方法。
以磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有磺胺喹噁啉與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體稀釋成蛋白濃度為0.5μg/L。酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液為含有0.05％甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)溶液。
(3)磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液用pH值為7.2，0.01mol/L含0.1-0.5％N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液將磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L，3ml/瓶。
(4)顯色液4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，8ml/瓶，1瓶。
(5)磺胺喹噁啉鼠單克隆抗體工作液用抗體稀釋液將磺胺喹噁啉的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1CGMCC No.1615分泌的單克隆抗體稀釋成蛋白濃度為0.3μg/L的抗體，8ml/瓶，1瓶。抗體工作液所用的抗體稀釋液為含有0.5％BSA的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫-80，0.1％的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。50ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液為pH值為7.2，0.02mol/L含0.1-0.5％N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的2倍。
(9)包被緩沖液pH6.4，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液。
(10)封閉液封閉液含有3-10％的牛血清，1％酪蛋白的pH值為7.2，0.02mol/L磷酸緩沖溶液。
其中，磺胺喹噁啉與載體蛋白偶聯(lián)物、磺胺喹噁啉特異性抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、磺胺喹噁啉半抗原的合成方法磺胺喹噁啉半抗原的制備原理將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)合成磺胺喹噁啉半抗原，給磺胺喹噁啉接出了一個(gè)含苯環(huán)的間隔臂，這樣突出了磺胺喹噁啉分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——喹噁啉。同時(shí)也增加了半抗原的抗原性。
其半抗原的制備的過程為將磺胺喹噁啉1g和對(duì)羧基苯甲醛1g通過縮合反應(yīng)合成磺胺喹噁啉半抗原。
2、包被原將磺胺喹噁啉半抗原和人血清白蛋白(HSA)水溶性碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
包被原的具體制備方法如下取磺胺喹噁啉半抗原300mg和人血清白蛋白(HSA)500mg混合溶于50ml水，加入EDC 100μl室溫?cái)嚢柽^夜即可。
3、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將磺胺喹噁啉半抗原與人血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.03μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，并4℃環(huán)境過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、磺胺喹噁啉鼠單克隆抗體的制備1、免疫原的合成將磺胺喹噁啉半抗原和卵清蛋白(OVA)載體蛋白采用水溶性碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
具體方法如下取磺胺喹噁啉半抗原300mg和人血清白蛋白(HSA)500mg混合溶于50ml水，加入EDC 100μl室溫?cái)嚢柽^夜即可。
通常免疫原的純度要求較高，免疫原的純度越高，制備的抗體特異性越強(qiáng)，至少要達(dá)到90％以上，上述所合成的免疫原采用紫外吸收法測(cè)定其純度為94.3％。
2、磺胺喹噁啉鼠單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以磺胺喹噁啉半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為100μg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化 取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株—磺胺喹噁啉的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1 CGMCC No.1615。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射磺胺喹噁啉的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1 CGMCC No.1615 5×106個(gè)/只，7～10天后采集腹水。經(jīng)辛酸—飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
三、酶標(biāo)抗體的制備羊抗鼠抗抗體的制備采用無病原體山羊做為免疫動(dòng)物，將鼠源性抗體按照免疫劑量為150～300μg/只進(jìn)行免疫，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測(cè)定抗血清效價(jià)(包被原為非免疫用鼠源抗體)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的羊抗鼠抗抗體。
酶標(biāo)記抗抗體的制備將羊抗鼠抗抗體與堿性磷酸酯酶進(jìn)行偶聯(lián)，采用的方法優(yōu)選戊二醛法，用堿性磷酸酯酶以2∶1的比例與抗抗體偶聯(lián)時(shí)，有60％～70％的酶與8％的抗抗體偶聯(lián)，酶標(biāo)記物的產(chǎn)量比使用辣根過氧化物酶高。
酶標(biāo)羊抗鼠抗抗體具體步驟如下1)稱取堿性磷酸酯酶25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以聚己二醇濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
3)取羊抗鼠抗抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
4)用1M pH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3h。
5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2h。
6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h。
7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中。
8)將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的磺胺喹噁啉的方法如下一、樣品前處理a.動(dòng)物組織取肌肉用勻漿機(jī)10000r/min勻漿1min，稱取3±0.1g勻漿物置離心管中，加入9ml乙腈—水溶液(乙腈和水的體積比是85∶15)混合，劇烈振蕩10min。于15℃，3000g以上速度離心10min。取4ml上清液，加入2M氯化鈉溶液2ml和7ml乙酸乙酯，混合振蕩10min，15℃，3000g速度離心5min。將上層液移另到離心管中用氮?dú)獯蹈?。加入正己?ml振蕩1min，再用稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液1ml混合2min。15℃，3000g，離心5min，除去上層液。取下層相50μl進(jìn)行分析。
b.尿樣取1ml尿液到離心管中，3000rpm離心10-15分鐘直至清亮，移取1ml尿液到離心管中，再加入3ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液混合。取50μl進(jìn)行分析。
c.血清血漿3000g離心5分鐘，取上層液50μl進(jìn)行分析。
d.蜂蜜取2ml蜂蜜，加入4ml重蒸餾水，再加乙酸乙酯振蕩10min，離心10分鐘。取1ml上層液用氮?dú)獯蹈?，殘留物用稀?倍的濃縮復(fù)溶液溶解，取50μl進(jìn)行分析。
二、檢測(cè)方法向磺胺喹噁啉偶聯(lián)抗原包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，再加入磺胺喹噁啉鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μl稀釋了19倍的濃縮洗滌液(含1.0％吐溫80、1‰的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M pH7.4))，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入酶標(biāo)記抗抗體100μl用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。每孔加入底物4-硝基酚磷酸鹽50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液(2mol/L氫氧化鈉)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
三、結(jié)果分析所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以磺胺喹噁啉濃度的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中磺胺喹噁啉的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液中磺胺喹噁啉的濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個(gè)檢測(cè)過程只需1.5小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為1μg/L。
實(shí)施例2、以羊抗兔抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法以羊抗兔抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的磺胺喹噁啉半抗原工作液將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的磺胺喹噁啉半抗原稀釋成蛋白濃度為0.5μg/L。酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液為含有0.05％甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)溶液。
(3)磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液磺胺喹噁啉系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L，3ml/瓶。
(4)顯色液4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，8ml/瓶，1瓶。
(5)磺胺喹噁啉兔多克隆抗體工作液用抗體稀釋液將兔多克隆抗體稀釋成蛋白濃度為0.3μg/L的抗體，8ml/瓶，1瓶?？贵w工作液所用的抗體稀釋液為含有0.5％BSA的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫-80，1‰的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，50ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液pH值為7.2，0.02mol/L含0.1-0.5％N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液，40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的2倍。
(9)包被緩沖液pH6.4，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液。
(10)封閉液封閉液封閉液含有3-10％的牛血清，1％酪蛋白的pH值為7.2，0.02mol/L磷酸緩沖溶液。
其中，羊抗兔抗抗體包被原、磺胺喹噁啉特異性抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的磺胺喹噁啉半抗原的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、包被原的制備以兔源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
2、包被有羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板制備方法酶標(biāo)板的材料為聚氯乙稀，用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.03μg/ml，酶標(biāo)板每孔加入100μl，37℃溫育2h，并4℃環(huán)境過夜，傾去包被液，用稀釋了19倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、磺胺喹噁啉兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以磺胺喹噁啉半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
三、酶標(biāo)半抗原的制備酶標(biāo)記半抗原的制備磺胺喹噁啉半抗原的制備同實(shí)施例1中的磺胺喹噁啉半抗原制備方法。
酶標(biāo)記半抗原的制備方法將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛合成磺胺喹噁啉半抗原，將磺胺喹噁啉半抗原與堿性磷酸酯酶采用碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)記磺胺喹噁啉抗原。
具體方法為取磺胺喹噁啉半抗原300mg和堿性磷酸酯酶500mg混合溶于50ml水，加入EDC 100μl室溫?cái)嚢柽^夜即可。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的磺胺喹噁啉的方法如下樣品前處理的具體步驟同實(shí)施例1中的樣品前處理步驟檢測(cè)方法向羊抗兔抗抗體包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，再加入磺胺喹噁啉兔多克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μl稀釋19倍的濃縮洗滌液(pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫-80，0.1％的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液)，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的磺胺喹噁啉半抗原工作液100μl用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟。加入底物4-硝基酚磷酸鹽50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液(2mol/L氫氧化鈉)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
結(jié)果分析的方法同實(shí)施例1中的結(jié)果分析方法，該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖2所示。結(jié)果分析表明，制備的試劑盒整個(gè)檢測(cè)過程只需1.5小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為1μg/L。
實(shí)施例3、試劑盒精密度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)1、試劑盒精密度試驗(yàn)(1)標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，每批試劑盒抽取10個(gè)試劑盒，再?gòu)拿總€(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定9μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在5.1％～11.9％之間。
表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例2中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在2.9％～14.6％之間。
表2標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

(2)樣本可重復(fù)性試驗(yàn)每個(gè)樣本按10μg/kg濃度添加磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品，分別取實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表3-表7所示，結(jié)果表明雞肉樣本變異系數(shù)均低于15％，雞肝樣本的變異系數(shù)均低于16％，血清樣本的變異系數(shù)均小于15％，蜂蜜樣本的變異系數(shù)均小于20％，尿液樣本的變異系數(shù)均小于20％。
表3雞肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表4雞肝樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表5血清樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表6蜂蜜樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表7尿液樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


實(shí)施例2中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果結(jié)果如表8-表12所示，結(jié)果表明雞肉樣本變異系數(shù)均低于20％，雞肝樣本的變異系數(shù)均低于20％，血清樣本的變異系數(shù)均小于25％，蜂蜜樣本的變異系數(shù)均小于30％，尿液樣本的變異系數(shù)均小于15％。
表8雞肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表9雞肝樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表10血清樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表11蜂蜜樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表12尿液樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

2、試劑盒的準(zhǔn)確度測(cè)定取兩個(gè)濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為10μg/kg(L)和20μg/kg(L)，分別利用實(shí)施例1或?qū)嵤├?的試劑盒按照實(shí)施例1或?qū)嵤├?的方法檢測(cè)磺胺喹噁啉，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果如表13所示，表明雞肉樣品添加準(zhǔn)確度在82.6％-96.5％之間，雞肝樣品添加準(zhǔn)確度在75.3％-94.5％之間，血清樣品添加準(zhǔn)確度在69.7％-89.3％之間，尿液樣品添加準(zhǔn)確度在62.4％-95.6％之間。
表13實(shí)施例1的試劑盒的準(zhǔn)確度


實(shí)施例2的試劑盒測(cè)定結(jié)果如表14所示，表明雞肉樣品添加準(zhǔn)確度在73.5％-94.8％之間，雞肝樣品添加準(zhǔn)確度在72.9％-92.5％之間，血清樣品添加準(zhǔn)確度在56.4％-94.7％之間，尿液樣品添加準(zhǔn)確度在84.5％-100.5％之間。
表13實(shí)施例2試劑盒的準(zhǔn)確度

3、試劑盒保存期試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒分別保存在2-8℃，6個(gè)月后，測(cè)定試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、磺胺喹噁啉添加實(shí)際測(cè)定值，結(jié)果表明實(shí)施例1的試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度，實(shí)施例2的試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度，均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將上述試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)磺胺喹噁啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺喹噁啉特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或磺胺喹噁啉抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)磺胺喹噁啉抗抗體或酶標(biāo)磺胺喹噁啉半抗原；當(dāng)所述包被原為磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)磺胺喹噁啉抗抗體；當(dāng)所述包被原為磺胺喹噁啉抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)磺胺喹噁啉半抗原；所述磺胺喹噁啉半抗原是將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液、包被緩沖液和封閉液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述磺胺喹噁啉特異性抗體為磺胺喹噁啉單克隆抗體或磺胺喹噁啉多克隆抗體；它們均是用磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述磺胺喹噁啉半抗原是將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)得到的；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體；所述磺胺喹噁啉單克隆抗體為磺胺喹噁啉的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1 CGMCC No.1615分泌的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫-80，0.1％的疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為1～2mol/L的氫氧化鈉、鹽酸或氫氧化鈉溶液；所述封閉液含有3-10％的牛血清，1％酪蛋白的pH值為7.2，0.02mol/L磷酸緩沖溶液；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為4-硝基酚磷酸鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮復(fù)溶液為pH7.2、0.02mol/L含0.1-0.5％N‘N-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH值為6.4、0.1mol/L的檸檬酸緩沖液。
10.一種檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織時(shí)，將樣品勻漿，稱取3±0.1g勻漿物，加入9ml體積比為85∶15的乙腈-水溶液混合均勻，3000rpm離心，取4ml上清液，加入2mol/L氯化鈉溶液2ml和7ml乙酸乙酯，混合均勻，3000rpm離心5-10分鐘，取上層液，用氮?dú)獯蹈?，加入正己?ml振蕩均勻，再用稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液1ml混合2min，3000rpm離心5-10分鐘，除去上層液，取下層液進(jìn)行分析；當(dāng)樣品為尿樣時(shí)，用3ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液與1ml經(jīng)離心得到的尿樣上清液體混合均勻，即可進(jìn)行分析；當(dāng)樣品為血清血漿時(shí)，3000rpm離心5min，取上層液即可進(jìn)行分析；蜂蜜取2ml蜂蜜，加入4ml重蒸餾水，再加乙酸乙酯振蕩均勻，3000rpm離心10分鐘，取1ml上層液用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉孟♂?倍的濃縮復(fù)溶液溶解，即可進(jìn)行分析；2)利用權(quán)利要求1-9中任一所述的檢測(cè)磺胺喹噁啉的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)磺胺喹噁啉的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該檢測(cè)磺胺喹噁啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺喹噁啉特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或磺胺喹噁啉抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)磺胺喹噁啉抗抗體或酶標(biāo)磺胺喹噁啉半抗原；當(dāng)所述包被原為磺胺喹噁啉半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)磺胺喹噁啉抗抗體；當(dāng)所述包被原為磺胺喹噁啉抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)磺胺喹噁啉半抗原。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本篩查的檢測(cè)動(dòng)物組織、血清血漿、尿樣、蜂蜜中磺胺喹噁啉藥物殘留量。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1811437SQ20061000725
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 萬宇平, 史為民, 李建成, 馮才偉, 吳小平 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)