專利名稱：一種測定白酒中吡嗪類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種測定白酒中吡嗪類化合物的方法，具體涉及應(yīng)用頂空固相微萃取與氣相色譜-火焰熱離子檢測器聯(lián)用技術(shù)檢測白酒中吡嗪類化合物的方法，屬于酒風(fēng)味研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
存在于白酒中的含氮化合物主要是吡嗪類化合物，吡嗪是1，4位含氮的六元雜環(huán)化合物，它的衍生物廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中，由于它們具有極低的風(fēng)味閾值，對白酒風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，近年來，越來越受到人們的重視。
白酒中吡嗪類化合物含量甚微，大多是在幾個μg/L到幾百個μg/L，其定性定量檢測存在一定困難。Wobben等用減壓蒸餾法除去酒中大部分乙醇和水，而后用CH2Cl2萃取，經(jīng)GC-MS分離和鑒定出朗姆酒和威士忌酒中吡嗪類化合物；Liebich采用乙醚一戊烷混合溶劑抽提，再以10％HCl萃取分離，用GC-MS鑒定朗姆酒中七種吡嗪類化合物；山東大學(xué)陸懋蓀利用陽離子樹脂富集白酒中含氮化合物；余曉等人在Liebich方法基礎(chǔ)上，采用將酒樣調(diào)酸旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分水、乙醇和易揮發(fā)組分的方法，鑒定出29種吡嗪類化合物。然而，以上方法需大量有機(jī)溶劑，樣品用量大，且步驟過于繁瑣，預(yù)處理過程中被分析物損失較大。
固相微萃取(SPME)無需有機(jī)溶劑，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，且可與氣相、液相色譜及GC-MS聯(lián)用，目前已廣泛用于食品風(fēng)味成分分析，SPME與氣相色譜聯(lián)用已用于檢測葡萄酒中吡嗪類化合物。

發(fā)明內(nèi)容
(1)解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種利用頂空固相微萃取與氣相色譜-火焰熱離子檢測器聯(lián)用技術(shù)檢測白酒中吡嗪類化合物的方法，以對中國各種香型的白酒進(jìn)行吡嗪類物質(zhì)的定性定量分析。
(2)技術(shù)方案本發(fā)明的測定白酒中吡嗪類化合物的方法，是用重蒸餾的去離子水將待測酒樣稀釋到最終酒精含量為12％(v/v)，然后用頂空固相微萃取技術(shù)富集白酒中吡嗪類化合物，再用氣相色譜-火焰熱離子檢測器對白酒中吡嗪類化合物進(jìn)行定性定量分析。
頂空固相微萃取吸取已加內(nèi)標(biāo)的稀釋后的酒樣5mL放入15mL頂空瓶中，并加入2g NaCl，插入50μm/30μm CAR/DVB/PDMS萃取頭，旋緊瓶蓋，置于水浴中于50℃恒溫萃取40min。
氣相色譜-火焰熱離子檢測器檢測萃取完畢后將萃取頭取出，插入氣相色譜進(jìn)樣口250℃熱解吸3min，毛細(xì)管柱PEG20M，30m×0.32mm i.d.×0.5μm，進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250℃，載氣為He，流速3mL/min；分流比1∶1。程序升溫起始溫度50℃，保持2min，然后以2℃/min的升溫速率升溫到85℃，保留0.1min，再以5℃/min的升溫速率升溫到210℃，保持2min。
未知吡嗪類化合物的定性分析通過比對未知化合物和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間來確認(rèn)檢測出的吡嗪類化合物。
未知吡嗪類化合物的定量分析(1)分別配制單標(biāo)儲備液分別準(zhǔn)確稱取0.3～0.5g的9種吡嗪類化合物標(biāo)準(zhǔn)品，用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作為單標(biāo)儲備液I；分別準(zhǔn)確吸取1mL9種吡嗪類的單標(biāo)儲備液I，同樣用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作為單標(biāo)儲備液II；分別準(zhǔn)確吸取1mL單標(biāo)儲備液II配置成12％(v/v)乙醇溶液定容于25mL容量瓶中，作為單標(biāo)儲備液III；(2)配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液將9種單標(biāo)儲備液III各吸取0.5～2mL放入一個容量瓶中，用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)內(nèi)標(biāo)的配制吸取0.3mL內(nèi)標(biāo)物用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)儲備液I，吸取1mL內(nèi)標(biāo)儲備液I用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)儲備液II，再吸取1mL內(nèi)標(biāo)儲備液II用12％(v/v)乙醇配制定容于50mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)儲備液III；(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀釋定容至50mL，再從中吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀釋定容至50mL，重復(fù)逐步稀釋，共得到11個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中均加入500μL內(nèi)標(biāo)儲備液III，均用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，依次對每一濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行頂空固相微萃取準(zhǔn)確吸取5mL配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于15mL頂空瓶中，加入2g NaCl，旋緊瓶蓋，置于水浴中于50℃恒溫萃取40min。以吡嗪類化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，吡嗪類化合物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)酒樣測定將目標(biāo)酒樣稀釋到12％(v/v)，加入500μL內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行頂空固相微萃取，氣相色譜-火焰熱離子檢測器進(jìn)行定量分析，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定被測酒樣中吡嗪類化合物含量。
9種吡嗪類化合物在0～200μg/L或0～400μg/L檢測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。9種吡嗪類化合物檢測限均小于1μg/L，酒樣3次重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15％，9種吡嗪類化合物的回收率均大于80％。
主要試劑與材料吡嗪，2-甲基吡嗪，2，5-二甲基吡嗪，2，6-二甲基吡嗪，2，3-二甲基吡嗪，2，3，5-三甲基吡嗪和2，3，5，6-四甲基吡嗪，2-乙基吡嗪，2，3-二乙基吡嗪和2-乙?；拎さ荣徲诿绹鴖igma公司(純度＞98％)。NaCl(分析純)，茅臺酒，郎酒和古井貢酒為市售商品。
儀器GC2010-FTD(日本島津公司)；SPME手動進(jìn)樣手柄及50μm/30μmCAR/DVB/PDMS萃取頭，15mL具塞頂空瓶(美國Supelco公司)；具有磁力攪拌功能的電熱恒溫水浴鍋。
回收率測定將含有9種吡嗪類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到12％(v/v)乙醇水溶液、茅臺酒、郎酒及古井貢酒中測定加標(biāo)回收率，每個酒樣平行3次。
酒樣測定本發(fā)明選取了茅臺酒，郎酒，古井貢酒為目標(biāo)酒樣，將三種白酒稀釋到12％(v/v)，加入500μL內(nèi)標(biāo)，按上述方法測定其中吡嗪類化合物含量。表2列出了所測酒樣中吡嗪類化合物的含量，圖3為郎酒酒樣GC-FTD色譜圖。
(3)有益效果本發(fā)明采用頂空固相微萃取與氣相色譜-火焰熱離子檢測器相結(jié)合的方法，建立了快速檢測白酒中吡嗪類化合物的方法，采用快速簡單的頂空固相微萃取富集白酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并且提高了回收率；另外采用對含氮化合物選擇性強(qiáng)而對其他化合物無響應(yīng)的火焰熱離子檢測器，使該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，克服了以往方法中的諸多不足；該方法可用于各種香型白酒中含氮化合物的分析檢測。


圖1不同條件下的萃取效果。
圖2 9種吡嗪類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3郎酒的GC-FTD色譜圖。
1＝未知，2＝吡嗪(pyrazine)，3＝2-甲基吡嗪(2-MP)，4＝2，5-二甲基吡嗪(2，5-DMP)，5＝2，6-二甲基吡嗪(2，6-DMP)，6＝2-乙基吡嗪(2-EP)，7＝2，3-二甲基吡嗪(2，3-DMP)，8＝未知，9＝未知，10＝2，3，5-三甲基吡嗪(2，3，5-TMP)，11＝未知，12＝未知，13＝未知，14＝2，3，5，6-四甲基吡嗪(2，3，5，6-TTMP)，15＝未知，16＝未知，17＝未知，18＝內(nèi)標(biāo)，19、20、21、22、23、24、25、26、27＝未知。
具體實施例方式
實施例1固相微萃取條件的優(yōu)化萃取溫度對吸附采樣的影響具有雙面性一方面，溫度升高時較多的分析物會從基質(zhì)中逸出進(jìn)入液上空間，從而有利于頂空固相微萃??；另一方面，溫度升高也會降低萃取頭吸附分析組分的能力，使得吸附量下降。本發(fā)明比較了30℃，40℃，50℃和60℃的萃取效果，結(jié)果表明50℃時吸附效果最佳。
固相微萃取過程是被分析物在樣品基質(zhì)和萃取頭涂層間的一個富集平衡的過程，一旦達(dá)到平衡，被分析物在兩相間的濃度達(dá)到恒定。本發(fā)明比較了10min，30min，40min和50min的萃取效果，結(jié)果表明萃取時間為40min達(dá)到萃取平衡。
此外，提高酒體的離子強(qiáng)度可以提高萃取效率，本發(fā)明考察了NaCl加入量0g/mL、0.2g/mL、0.4g/mL、0.5g/mL，當(dāng)力入0.4g/mL時溶液已飽和，0.5g/mL已過飽和，總吸附量并無明顯提高。綜合所有優(yōu)化試驗的結(jié)果，最終將SPME條件定為50℃下加入0.4g/mL NaCl，攪拌吸附40min，結(jié)果見附圖1。
實施例2方法的評價以2-乙?；拎閮?nèi)標(biāo)，9種吡嗪化合物的線性相關(guān)系數(shù)R2的變化范圍在0.9908(2，3-二甲基吡嗪)到0.9999(2，3，5-三甲基吡嗪)之間，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好見附圖2。同時標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍包含了酒中含氮化合物的濃度范圍。9種吡嗪類化合物檢測限＜1μg/L，其中2，3-DEP檢測限為62.50ng/L。該方法的整體精確度較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大多數(shù)在10％以內(nèi)，能夠滿足分析的要求。本發(fā)明做了回收率的測定，結(jié)果表明該方法回收率均大于80％，見表1。
表1吡嗪化合物在白酒中的回收率(％，n＝3)

N.D.未檢測到實施例3實際酒樣的測定本發(fā)明選取了茅臺酒，郎酒，古井貢酒為目標(biāo)酒樣，將三種白酒稀釋到12％(v/v)，加入500μL內(nèi)標(biāo)，按上述方法測定其中吡嗪類化合物含量。附表2列出了所測酒樣中吡嗪類化合物的含量，附圖3為郎酒酒樣的GC-FTD色譜圖。
表2不同白酒中各種吡嗪類衍生物含量(Mean±Stdev，μg/L，n＝3)

N.D.未檢測到。
權(quán)利要求
1.一種測定白酒中吡嗪類化合物的方法，其特征是用重蒸餾的去離子水將待測酒樣稀釋到最終酒精含量為12％(v/v)，然后用頂空固相微萃取技術(shù)富集白酒中吡嗪類化合物，再用氣相色譜-火焰熱離子檢測器對白酒中吡嗪類化合物進(jìn)行定性定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是頂空固相微萃取吸取已加內(nèi)標(biāo)的稀釋后的酒樣5mL放入15mL頂空瓶中，并加入2gNaCl，插入50μm/30μmCAR/DVB/PDMS萃取頭，旋緊瓶蓋，置于水浴中于50℃恒溫攪拌萃取40min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是氣相色譜-火焰熱離子檢測器檢測萃取完畢后將萃取頭取出，插入氣相色譜進(jìn)樣口250℃熱解吸3min，毛細(xì)管柱PEG20M，30m×0.32mm i.d.×0.5μm，進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250℃，載氣為He，流速3mL/min；分流比1∶1；程序升溫起始溫度50℃，保持2min，然后以2℃/min的升溫速率升溫到85℃，保留0.1min，再以5℃/min的升溫速率升溫到210℃，保持2min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是未知吡嗪類化合物的定性分析通過比對未知化合物和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間來確認(rèn)檢測出的吡嗪類化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是未知吡嗪類化合物的定量分析(1)分別配制單標(biāo)儲備液分別準(zhǔn)確稱取0.3～0.5g的9種吡嗪類化合物標(biāo)準(zhǔn)品，用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作為單標(biāo)儲備液I；分別準(zhǔn)確吸取1mL9種吡嗪類的單標(biāo)儲備液I，同樣用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作為單標(biāo)儲備液II；分別準(zhǔn)確吸取1mL單標(biāo)儲備液II配置成12％(v/v)乙醇溶液定容于25mL容量瓶中，作為單標(biāo)儲備液III；(2)配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液將9種單標(biāo)儲備液III各吸取0.5～2mL放入一個容量瓶中，用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)內(nèi)標(biāo)的配制吸取0.3mL內(nèi)標(biāo)物用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)儲備液I，吸取1mL內(nèi)標(biāo)儲備液I用優(yōu)級純乙醇配制定容于25mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)儲備液II，再吸取1mL內(nèi)標(biāo)儲備液II用12％(v/v)乙醇配制定容于50mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)儲備液III；(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀釋定容至50mL，再從中吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀釋定容至50mL，重復(fù)逐步稀釋，共得到11個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中均加入500μL內(nèi)標(biāo)儲備液III，均用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，依次對每一濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行頂空固相微萃取準(zhǔn)確吸取5mL配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于15mL頂空瓶中，加入2gNaCl，旋緊瓶蓋，置于水浴中于50℃恒溫萃取40min；以吡嗪類化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，吡嗪類化合物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)酒樣測定將目標(biāo)酒樣稀釋到12％(v/v)，加入500μL內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行頂空固相微萃取，氣相色譜-火焰熱離子檢測器進(jìn)行定量分析，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定被測酒樣中吡嗪類化合物含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是9種吡嗪類化合物在0～200μg/L或0～400μg/L檢測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是9種吡嗪類化合物檢測限均小于1μg/L，酒樣3次重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15％，9種吡嗪類化合物的回收率均大于80％。
全文摘要
一種測定白酒中吡嗪類化合物的方法，屬于酒風(fēng)味研究領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用頂空固相微萃取與氣相色譜－火焰熱離子檢測器聯(lián)用技術(shù)檢測白酒中吡嗪類化合物。本方法用頂空固相微萃取無需繁瑣的預(yù)處理過程，快速簡單，并且提高了回收率，用氣相色譜－火焰熱離子檢測器聯(lián)用技術(shù)檢測白酒中吡嗪類化合物特異性強(qiáng)，9種吡嗪類化合物在所測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R
文檔編號G01N30/68GK101017159SQ20071001976
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日
發(fā)明者徐巖, 范文來 申請人:江南大學(xué)