專利名稱：：磺胺類藥物直接競爭酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種磺胺類藥物直接競爭酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具體地說是用于食品和飼料中磺胺類藥物殘留量的檢測，屬于酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測
技術領域：
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背景技術：
：因磺胺類藥物具有抗菌譜廣，能抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌，性質穩(wěn)定便于長期保存，價格比較便宜，又有長效、中效、短效等各種制劑的優(yōu)點，不僅廣泛用于人類，還廣泛用于獸醫(yī)臨床，在動物的防病、治病方面具有顯著的療效。它們的用藥方式可以是加藥詞料、水劑、丸劑或針劑。通常將磺胺類藥物用于家禽以預防球蟲病、霍亂和感染性鼻炎；在水產品養(yǎng)殖過程中用于控制疔瘡和腸敗血癥等；同時還以亞臨床治療劑量，作為飼料添加劑，用于防病和促進動物生長，以提高奶牛、生豬的抗病能力和增進其食欲，提高產奶量和產肉量。由于此類藥物在體內作用和代謝時間較長，若不按規(guī)定要求合理地使用與停藥，易引起在動物體內殘留，并通過奶、肉、蛋借食物鏈以低劑量傳遞，從而影響人類健康。因此，國內外對磺胺類藥物等殘留均有限量要求，其最大殘留限量不超過100|ig/kg，并且有逐步嚴格控制的趨勢。磺胺類藥物的檢測方法，有抑制微生物法、分光光度法、熒光法、薄層色譜法、氣相色譜法(GC)和液相色譜法(HPLC)，以及氣相色譜/質譜法(GC/MS)、液相色譜/質譜法(HPLC/MS)、免疫檢測法等。氣相色譜、高效液相色譜和氣質聯(lián)用等方法分離度好、特異性強、靈敏度高，可以同時測定多種藥物。但缺點是樣品的提取凈化等前處理步驟繁瑣，檢測的成本較高，對操作人員的要求也較高，不適宜大批量樣品的篩選檢測，很難推廣。微生物學方法缺乏靈敏度、特異性，準備工作繁瑣，檢測所需時間較長，在定性定量上都存在困難，不能滿足測定的要求。酶聯(lián)免疫法是一種快速、靈敏、特異和安全的檢測小分子藥物殘留的檢測技術，其規(guī)模化篩選特點更適用于常規(guī)化檢測需要，目前，磺胺類藥物殘留檢測試劑盒主要為接間競爭性酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，與本發(fā)明直接競爭性酶聯(lián)免疫檢測試劑盒不同。如專利CN1262839C為接間競爭性酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，是將人工抗原或二抗包被于酶標板上，檢測時再加抗體，而后加酶標二抗、顯色劑等。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，從而提供一種磺胺類藥物直接競爭酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其采用直接競爭酶聯(lián)免疫方法定性或定量地檢測食品和飼料中磺胺類藥物的殘留量；檢測時間短、平均回收率高、批內、批間誤差小，并具有簡便、快速、準確的特點。本發(fā)明的主要解決方案是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括制備能產生磺胺類藥物抗體的人工免疫抗原、酶標抗原、抗磺胺類藥物抗體。本發(fā)明將磺胺類藥物與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工免疫抗原；用人工免疫抗原免疫動物制備抗磺胺類藥物抗體；將磺胺類藥物與酶偶聯(lián)制備成酶標抗原。本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒還包括標準品溶液系列試劑、酶標抗原溶液試劑、底物溶液試劑、顯色劑溶液試劑、終止液試劑、酶標抗原稀釋液試劑、濃縮洗滌液試劑。本發(fā)明所述的載體蛋白可以是牛血清白蛋白、卵血清白蛋白等。本發(fā)明所述的抗磺胺類藥物抗體為用人工免疫抗原免疫動物制備多克隆或單克隆抗體；所述的多克隆抗體或單克隆抗體可為鼠、馬、羊、兔源的抗體，所述的磺胺類藥物多克隆抗體優(yōu)選為磺胺類藥物兔多克隆抗體，所述的磺胺類藥物單克隆抗體優(yōu)選為磺胺類藥物鼠單克隆抗體。本發(fā)明所述的包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板在制備過程中，所用的人工免疫原是采用重氮偶合法將磺胺類藥物與牛血清白蛋或卵血清白蛋白偶合得到的結合物(摩爾比l:51:20)。本發(fā)明所述的包被緩沖溶液是pH9.60.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，所用的封閉液是"/。5o/。牛血清白蛋白或卵血清白蛋白的0.01mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述的磺胺類藥物可以是磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺等。所述磺胺類藥物標準溶液的濃度范圍為1.0嗎/L625嗎/L。本發(fā)明所述的酶標抗原中的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶-磺胺類藥物標記物采用二步戊二醛法制備。本發(fā)明所述的顯色劑由底物溶液和顯色液組成，底物溶液為50|ig/mL200(ig/mL過氧化氫或過氧化脲溶液，顯色液為50嗎/mL200嗎/mL鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺溶液。本發(fā)明所述的終止液為l2mol/L硫酸溶液。本發(fā)明所述的酶標抗原稀釋液含0.5%2%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液中含0.15mol/L的氯化鈉。本發(fā)明所述的濃縮洗滌液為含有0.5%1%吐溫20的0.1mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明使用時將標準品或樣品和酶標抗原加入包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板中，與固相載體上的抗體競爭性結合，洗滌分離游離抗原和酶標抗原，結合在固相載體上的酶標記物，與酶底物和顯色劑反應，結合的酶標記物將無色的顯色劑轉化為藍色的產物。加入反應終止液后使顏色由藍轉變?yōu)辄S色。在450nm處檢測吸光度，吸收光強度與樣品中磺胺類藥物濃度成反比?？赏ㄟ^標準曲線計算磺胺類藥物的濃度，或通過與標準品顏色比較，判斷樣品中磺胺類藥物濃度限量。本發(fā)明與已有技術相比具有以下優(yōu)點本發(fā)明主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫方法定性或定量地檢測食品和詞料中磺胺類藥物的殘留量；其檢測限大于2)ig/kg，檢測時間僅需2小時；平均回收率70%20%，批內誤差小于10%，批間誤差小于20%;并具有簡便、快速、準確的特點，可直接用于食品和飼料中磺胺類藥物殘留量的檢測。圖1是本發(fā)明磺胺類藥物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的結構示意圖。圖2是本發(fā)明包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板及支架的示意圖。具體實施方式下面本發(fā)明將結合附圖中的實施例作進一步描述本發(fā)明磺胺類藥物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒由標準品溶液系列試劑瓶1、酶標抗原溶液試劑瓶2、底物溶液試劑瓶3、顯色劑溶液試劑瓶4、終止液試劑瓶5、酶標抗原稀釋液試劑瓶6、濃縮洗滌液試劑瓶7、包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板8及反應板支架9、盒體10所組成。上述試劑瓶、包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板和反應板支架均裝在盒體內。實施例一一、免疫抗原、抗體及酶標抗原的制備1、免疫抗原的制備本發(fā)明所述的人工免疫抗原為采用重氮偶合法制備的磺胺類藥物與載體蛋白結合物，其磺胺類藥物采用磺胺二甲嘧啶。稱取20mg100mg磺胺二甲嘧啶(SMZ)，加入0.5mol/L硫酸，4匸避光攪拌過夜，置冰浴中，逐滴加入1.9%亞硝酸鈉溶液，避光反應約20分鐘，加18(^L氨基磺酸銨溶液，終止反應為重氮化磺胺二甲嘧啶液。載體蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。稱取30mg600mg牛血清白蛋白，以0.2mol/LpH10碳酸鹽緩沖液6mL溶解，然后加入上述重氮化磺胺二甲嘧啶液，調反應液pH值為9-10，于4。C避光攪拌18小時。將反應液于4。C蒸餾水中透析72小時，期間換蒸餾水5次。或過萄聚糖凝膠G50(SephadexG50)柱提純，以0.05mol/LpH8.0碳酸鹽緩沖溶液洗脫。收集透析純化液或第1峰的柱洗脫液(棕色液體)，分裝保存于-2(TC作免疫原用。2、磺胺二甲嘧啶多克隆抗體的制備將上述合成的磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白結合物(SMZ-BSA)作免疫抗原，采用皮內或皮下多點注射方式，接種lkg1.5kg雄性新西蘭兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫時，在免疫原中加等量福氏完全佐劑混勻制成乳劑，以后免疫均加等量福氏不完全佐劑；自第二次免疫開始，每次免疫后8~10天采血測試抗血清效價。觀察抗血清效價增長情況，達滿意效價時將兔宰殺，取全血分離血清?？寡褰涍^3次硫酸銨沉淀后，再用層析柱分離純化，對磷酸鹽緩沖溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室溫，加入等量的0.01moL/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液，充分混勻，加入20mL飽和硫酸銨溶液(以濃氨水調至pH7.8)，搖勻，4。C靜止l小時后，以5000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液。沉淀物用20mL0.01moL/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液溶解，然后加入lOmL飽和硫酸銨溶液(pH7.8)，搖勻，4。C靜止30分鐘后，以5000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液。重復鹽析兩次。最終以2mL0.01moL/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，裝入透析袋，對2000mL0.01moL/LpH7.2磷酸鹽緩沖溶液透析12小時。將上述透析液，加入到約25克濕重的纖維素DEAE-52(取纖維素DEAE-52干粉10克，用500mL0.01moL/LpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液浸泡過夜，抽濾)中，4'C平衡1小時，每10分鐘攪拌一次，傾入布氏漏斗中，用pH8.0的0.2moL/L磷酸鹽緩沖溶液洗濾。收集濾液，再對0.01moL/LpH7.4磷酸鹽緩沖溶液透析12小時，最后加入適量甘油-2(TC保存。3、單克隆抗體的制備用磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白結合物作免疫原，免疫BALB/c小白鼠，免疫劑量40pg/只，含福氏完全佐劑的免疫原首次免疫，以后每隔四周，用含福氏不完全佐劑的免疫原加強免疫，最后一次免疫后10天，采血，取脾細胞。取免疫小白鼠的脾細胞與小白鼠的骨髓瘤細胞雜交融合，制備雜交瘤細胞。采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌磺胺類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株。單克隆抗體的生產與純化，小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，采集腹水，經硫酸銨鹽析純化，分裝待用。4、酶標抗原的制備酶標抗原中的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶-磺胺類藥物標記物采用二步戊二醛法制備戊二醛活化辣根過氧化物酶(HRP):稱取10mg50mg辣根過氧化物酶溶于0.5mL2mL1.25%戊二醛溶液中，室溫避光攪拌反應1020小時，然后將反應液于4。C對0.1mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖溶液透析4872小時，期間換液4次?；前范奏奏?辣根過氧化物酶結合物(SMZ-HRP)的制備稱取2mg20mg磺胺二甲嘧啶溶于lmLO.lmol/LpH6.8磷酸鹽緩沖溶液內，然后加入上述經戊二醛活化的辣根過氧化物酶，再加O.lmLlmol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液，于4。C避光攪拌反應19小時，再加O.lmL0.2mol/LL-賴氨酸溶液。上葡聚糖凝膠G75(sephadexG75)柱層析，收集在402nm和242nm波長處有最大吸收峰的洗脫液，合并收集液，在4"C，對0.1mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖溶液透析50小時，期間換液4次，最后加等量甘油保存于-2(TC備用。二、試劑盒的制備1、試劑盒如圖1所示由標準品溶液系列試劑瓶1、酶標抗原溶液試劑瓶2、底物溶液試劑瓶3、顯色劑溶液試劑瓶4、終止液試劑瓶5、酶標抗原稀釋液試劑瓶6、濃縮洗滌液試劑瓶7、包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板8及反應板支架9、盒體10所組成。將含上述試劑的試劑瓶、包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板及反應板支架裝入盒內，組成磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。2、試劑的配制(1)、標準溶液的配制準確稱取標準磺胺二甲嘧啶lmg(精確到0.00001g)，配成4mg/mL母液，再用磷酸鹽緩沖溶液稀釋成20嗎/mL中間液，最終稀釋成所需的濃度(1.0嗎/L625嗎/L)，灌裝。為試劑l。(2)、酶標抗原溶液辣根過氧化物酶-磺胺二甲嘧啶溶液原液，灌裝。為試劑2。(3)、底物溶液先用O.lmol/LpH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0.3%過氧化氫貯備液，每lmL緩沖液中加入14pL貯備液。灌裝。為試劑3。(4)、顯色溶液四甲基聯(lián)苯胺先用丙酮配制10mg/mL溶液，用O.lmol/LpH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0.2mg/L溶液。灌裝。為試劑4。(5)、終止液2mol/L硫酸溶液。灌裝。為試劑5。(6)、酶標抗原稀釋液含1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液0.01mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液中含0.15mol/L的氯化鈉。灌裝。為試劑6。(7)、濃縮洗滌液含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液0.1mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液中含1.5mol/L的氯化鈉。灌裝。為試劑7。(8)、包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板取0.55嗎/L抗磺胺二甲嘧啶抗體溶液150pL~20(^L，加入到反應板小孔中，搖勻，置4°C冰箱中過夜。倒出孔內液體，用含0.15mol/L的氯化鈉的0.01mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液洗滌，重復35次，將反應板倒置在吸水紙上拍打，吸干。在己包被抗體的反應板小孔中加200pL含1%牛血清白蛋白的0.01mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液封閉液，37"C恒溫培育1小時，用洗滌液洗滌，重復3次，用吸水紙吸干，封裝。上述所述的包被抗體的反應板有24孔或48孔或96孑L，并采用鋁膜真空密封。三、樣品中磺胺二甲嘧啶殘留的檢測1、樣品的前處理(1)、乳制品牛奶取適量牛奶，置4t:，以3000轉/分速度離心IO分鐘，移棄上層相脂肪層，下層用蒸餾水按l:4稀釋后測定(稀釋倍數(shù)n=5)。奶粉稱取奶粉lg，溶解于19mL蒸餾水中，置4"C，以3000轉/分速度離心10分鐘，移棄上相脂肪層，取下層溶液待測量(稀釋倍數(shù)n=20)。(2)、蜂蜜稱取蜂蜜2g，加4mL蒸餾水，10mL乙酸乙酯，振蕩10分鐘，取上相乙酸乙酯層5mL，低溫水浴揮干，殘留物加lmL蒸餾水溶解(稀釋倍數(shù)n=l)。(3)、肌肉組織和臟器取試樣勻漿，稱2g勻漿樣品，加20mL超聲提取，(標記好刻度)超聲波提取15分鐘。若溶劑揮發(fā)，用三氯甲垸補至刻度，混均，過濾。取濾液10mL，減壓或6(TC7(TC水浴，揮干溶劑。用5mL水溶解，待測(稀釋倍數(shù)n=5)。若組織樣品脂肪含量很高，可在加水溶解后，再加正己烷5mL，振搖，轉移至離心管，置4。C，以3000轉/分速度離心IO分鐘，棄正己垸相，下層待測定。(4)、飼料稱取詞料2g，加20mL乙酸乙酯，振蕩10分鐘，靜置，取上清液10mL，蒸干，加2mL蒸餾水溶解，待測(稀釋倍數(shù)n=2)。2、檢測方法(1)、準備分析前將所有試劑平衡至室溫；按要求將有關試劑稀釋至使用濃度；分析后立即將所有試劑放回4。C8。C冰箱；在所有培育中，避光，蓋上微孔板蓋。(2)、試劑配制酶標抗原(試劑2)的稀釋使用前取酶標抗原250pL用酶標抗原稀釋劑(試劑6)稀釋成工作濃度。濃縮洗滌液(試劑7)的稀釋使用前用蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋10倍。(3)定位根據(jù)需要設定限量法(見表l)和定量法(見表2)。取足夠數(shù)量的反應板微孔置于反應板支架上，記錄標準品孔和試樣孔的位置。限量法以控制標準孔號中的濃度為5pg/L為例。表1限量法微孔定位<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(4)、反應在每孔中依次加入試劑，加入50pL標準溶液或試樣提取液至相應微孔中；再加入50pL酶標抗原溶液到每個微孔中。搖勻，將反應板放在塑料袋內，置暗處，25"C37。C反應1小時。將微孔中液體傾倒到水池內，倒置微孔支架，在干凈紙巾上輕拍，除去所有殘留的液體，加洗滌液約250pL到每個微孔中洗板，再排空液體，重復洗滌4次。(5)、顯色測定每孔分別加入底物溶液和顯色劑溶液各50iiL，充分搖勻，置暗處，25'C37。C反應15分鐘。加50)iL終止液到每孔中，搖勻。在450nm波長處，以空氣為空白調零，測定吸收值。在60分鐘內讀數(shù)。3、結果計算和表述(1)、限量法若試樣孔的吸收值小于標準孔的吸收值，即AW<A^，超過限量值，為陽性。若試樣孔的吸收值大于標準孔的吸收值，即A^〉A，則小于所設限量值，為陰性。限量值為100pg/L或100叱/kg。若樣品有其它限量要求時，可通過調整試樣稀釋倍數(shù)或控制標準孔的濃度進行控制，三者的關系式為限量值=控制標準孔的濃度\稀釋倍數(shù)。(2)、定量法標準曲線的繪制，所測標準品的吸收值對應磺胺二甲嘧啶濃度Oig/L)的半對數(shù)坐標作標準曲線圖，曲線在一定范圍內應當成線性。根據(jù)試樣的吸收值，通過標準曲線，查得相對應濃度。按式(l)計算試樣中的磺胺二甲嘧啶含量。試樣中的磺胺二甲嘧啶含量X，單位為微克每千克(|ig/kg),按下式計算；X=Cn.......................................(1)式中C——從標準曲線上查得相對應提取液中磺胺二甲嘧啶濃度，單位為微克每升(嗎/L);n——試樣稀釋倍數(shù)。計算結果表示到小數(shù)點后一位有效數(shù)字。抗原改用磺胺標準品，抗體改用抗磺胺抗體溶液，酶標抗原改用辣根過氧化物酶-磺胺，反應板改用抗磺胺抗體包被，其余試劑瓶的配制同實施例一，即為磺胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。實施例三抗原改用磺胺甲嘧啶標準品，抗體改用抗磺胺甲嘧啶抗體溶液，酶標抗原改用辣根過氧化物酶-磺胺甲嘧啶，反應板改用抗磺胺甲嘧啶抗體包被，其余試劑瓶的配制同實施例一，即為磺胺甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。權利要求1、一種檢測磺胺類藥物直接競爭酶聯(lián)免疫試劑盒，包括標準品溶液系列試劑、酶標抗原溶液試劑、底物溶液試劑、顯色劑溶液試劑、終止液試劑、酶標抗原稀釋液試劑、包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板、濃縮洗滌液試劑，其特征是所述的包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板在制備過程中，所用的人工免疫原是采用重氮偶合法將抗磺胺類藥物抗體與牛血清白蛋或卵血清白蛋白偶合得到的結合物，所用的抗磺胺類藥物抗體是免疫原免疫動物得到的多克隆抗體或單克隆抗體；所述的包被緩沖溶液是pH9.60.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，所用的封閉液是1％～5％的牛血清白蛋白或卵血清白蛋白；所述的酶標抗原溶液中的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶；所述的磺胺類藥物標準溶液的濃度范圍為1.0μg/L～625μg/L；所述的顯色劑由底物溶液和顯色液組成，底物溶液為過氧化氫或過氧化脲溶液，顯色液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺溶液；所述的終止液為1～2mol/L硫酸溶液；所述的酶標抗原稀釋液含0.5％～2％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液中含0.15mol/L的氯化鈉；所述的濃縮洗滌液為含有0.5％～1％吐溫20的0.1mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液。2、根據(jù)權利要求1所述的檢測磺胺類藥物直接競爭酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征所述的抗磺胺類藥物為磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺。全文摘要本發(fā)明涉及一種磺胺類藥物直接競爭酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，屬于酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測
技術領域：
。包括制備能產生磺胺類藥物抗體的人工免疫抗原、酶標抗原、抗磺胺類藥物抗體、標準溶液試劑、底物溶液試劑、顯色劑溶液試劑、終止液試劑、酶標抗原稀釋液試劑、包被抗磺胺類藥物抗體的多孔聚苯乙烯微量反應板及濃縮洗滌液試劑。本發(fā)明的主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫方法定性或定量地檢測食品和飼料中磺胺類藥物的殘留量；其檢測限大于2μg/kg，檢測時間僅需2小時；平均回收率70％-120％，批內誤差小于10％，批間誤差小于20％；并具有簡便、快速、準確的特點，可直接用于食品和飼料中磺胺類藥物殘留量的檢測。文檔編號G01N33/544GK101113981SQ20071002082公開日2008年1月30日申請日期2007年4月6日優(yōu)先權日2007年4月6日發(fā)明者丁貴平,宓曉黎,朱金連,平李,李利東,袁建興,陸茂林申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司