專利名稱：鋰診斷/測(cè)定試劑盒及鋰濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鋰診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鋰濃度的 方法，屬于醫(yī)學(xué)/工業(yè)/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)40年代，Cade首次用鋰鹽治療躁狂癥成功，總有效率約70%， 鋰鹽對(duì)躁狂和抑郁的復(fù)發(fā)有預(yù)防作用，也用于治療分裂情感性精神病。另 外，鋰鹽可使雙相障礙維持治療階段的自殺行為減少86%，而當(dāng)停用鋰鹽 后，自殺危險(xiǎn)性會(huì)增加7.5倍。當(dāng)血鋰濃度達(dá)到或超過(guò)1.5mmol/L，會(huì)出 現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，血鋰濃度3.0mmd / L以上可危及生命。
近幾年，臨床實(shí)驗(yàn)室多數(shù)方法學(xué)都有了新的發(fā)展，但鋰的測(cè)定方法基本 維持火焰原子發(fā)射法、火焰原子吸收法及離子選擇電極法。原子吸收的 方法是將稀釋的標(biāo)本吸入乙炔火焰中，利用空心陰極元素?zé)艄庠窗l(fā)出被測(cè) 元素的特征輻射光，為火焰原子化器產(chǎn)生的樣品蒸汽中的待測(cè)元素基態(tài)原 子所吸收。鋰在波長(zhǎng)670.8 nm處的被吸光的特征輻射光的大小與標(biāo)本中的 鋰濃度成正比。但目前國(guó)內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)操作 規(guī)程，也很難在精神病醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室中査找到其使用情況。
自然界中無(wú)游離鋰，因此實(shí)際指鋰離子或鋰鹽，而碳酸鋰是最重要的鋰 化物。碳酸鋰被用于陶瓷釉料的生產(chǎn)、特種玻璃、鋁的熔煉和鋼鐵鑄造粉 末。氫氧化鋰和氯化鋰應(yīng)用在潤(rùn)滑劑、空調(diào)和干燥系統(tǒng)中。丁基鋰、鋰金 屬、特種無(wú)機(jī)物和特種有機(jī)物，被用于制藥、合成橡膠等領(lǐng)域。鋰是一種稀有金屬，鋰電池就以它為主要原料，航空航天工業(yè)也離不開(kāi)鋰。金屬鋰與 鋰合金在核能發(fā)電、輕質(zhì)高比強(qiáng)合金、輕金屬焊接等諸多領(lǐng)域都有著廣闊 的開(kāi)發(fā)利用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定鋰 濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的鋰診斷/測(cè)定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行 鋰濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明鋰濃度測(cè)定方法原理如下
肌醇-l-磷酸+水肌醇-1-磷酸酶/1\4￡2+/0+肌醇+磷酸根 磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶 丙酮酸
+輔酶八+輔酶
這種方法應(yīng)用能被鋰抑制活性的肌醇-l-磷酸酶(inositol-l-phosphase; EC 3丄3.25)酶(偶)聯(lián)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpymvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/速率比色法。肌醇-l-磷酸酶(需要鎂離子 激活其活性，鋰離子能抑制鎂離子的激活作用)酶解肌醇-l-磷酸反應(yīng)產(chǎn)生 磷酸根，再通過(guò)(偶)聯(lián)合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶的作 用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/ 速度，比較對(duì)照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，可以測(cè)算鋰的濃 度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鋰診斷/測(cè)定試劑盒較
為理想
緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
肌醇-l-磷酸酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
丙酮酸脫氫酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
乙酰輔酶A 氯化鎂可以用其它鎂鹽取代；如硫酸鎂等'
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 10000U/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 10 mmol/L
本發(fā)明的鋰診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔 酶A。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙 酸、乙酰輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、 丙酮酸脫氫酶。
還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙
酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙
酸、乙酰輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶。 還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙 酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定鋰濃度的方法，其還原型輔酶
可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
本實(shí)施例的鋰診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 肌醇-l-磷酸酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸脫氫酶 氯化鎂 肌醇-l-磷酸 草酰乙酸
乙酰輔酶A
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥,
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L
10000U/L
10000 U/L
10000U/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L
10 mmol/L
制成干粉試劑；使用
前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)對(duì)照及鋰樣品 與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約 l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
分別加入對(duì)照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，比較對(duì)照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測(cè)算出鋰的濃度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的鋰診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
乙酰輔酶A
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 10 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
肌醇-l-磷酸酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 10000U/L
丙酮酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)對(duì)照及鋰樣品 與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
10分別加入對(duì)照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置
于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，比較對(duì)照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測(cè)算出鋰的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的鋰診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
乙酰輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸脫氫酶
穩(wěn)定劑
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 0,6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 10 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L 10000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
500 mmol/L
肌醇-l-磷酸酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用測(cè)定鋰濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10
分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被 測(cè)對(duì)照及鋰樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 分別加入對(duì)照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置 于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，比較對(duì)照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測(cè)算出鋰的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測(cè)定方法均能達(dá)到 本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0015; 吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測(cè)有效(RX).99)線形范圍可 達(dá)0.45mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±7%;試劑測(cè) 試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達(dá)0.0988 ± 0.049 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足 以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鋰濃度測(cè)定方法，其方法原理如下肌醇-1-磷酸+水 <u>肌醇-1-磷酸酶/Mg</u><u>2+</u><u>/Li</u><u>+</u> 肌醇+磷酸根磷酸根+草酰乙酸 <u>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u> 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶 <u>丙酮酸脫氫酶</u> 丙酮酸 +輔酶A+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，比較對(duì)照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，測(cè)算出鋰的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2.
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A 組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A 組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌 醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶組成。還原 型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸 脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A 組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌 醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、肌醇-l-磷酸酶組成。還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鋰診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鋰濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/工業(yè)/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-1-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A、肌醇-1-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)分別將對(duì)照及鋰樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度/速度，比較對(duì)照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測(cè)算出鋰的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101464314SQ20071019210
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司