專利名稱：納米粒子強(qiáng)化的熒光偏振分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療、環(huán)境、食品的檢測(cè)分析領(lǐng)域，尤其涉及一種納米粒子強(qiáng)化 的熒光偏振分析方法。
背景技術(shù)：
熒光偏振原理于1920建立，以此發(fā)展出來的熒光偏振技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子 間的相互作用的研究，包括DNA-蛋白、蛋白-蛋白、抗原-抗體結(jié)合。熒光偏 振檢測(cè)技術(shù)是一種熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，它把熒光物質(zhì)標(biāo)記在特定物質(zhì)分子，使 原本微弱的反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化成較強(qiáng)的熒光信號(hào)，同時(shí)在光路的合適位置分別加上 起偏器和檢偏器就可測(cè)出待測(cè)物的偏振熒光強(qiáng)度。在分析分子結(jié)合的方法中， 熒光偏振法是一個(gè)獨(dú)特的方法，由于該方法不需分離游離和結(jié)合的示蹤物，所 有測(cè)定都在溶液中進(jìn)行，可以達(dá)到真正的平衡，具有快速、操作簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確等 特點(diǎn)。檢測(cè)靈敏度是最基本的檢測(cè)性能指標(biāo)之一，高檢測(cè)靈敏度也就意味著高 準(zhǔn)確度，決定著其最終是否可以被廣泛使用。
中國專利授權(quán)第ZL 988012847號(hào)發(fā)明專利提供了一種分析樣品中檢測(cè)對(duì)象 的熒光偏振法。所述熒光偏振法包括以下步驟(a)提供蛋白與熒光染料共價(jià)結(jié) 合的熒光標(biāo)記蛋白，其中所述蛋白能夠特異結(jié)合所述檢測(cè)對(duì)象；(b)使所述熒光 標(biāo)記蛋白和所述檢測(cè)對(duì)象結(jié)合；和(c)檢測(cè)在所述熒光標(biāo)記蛋白中由于它與所述 檢測(cè)對(duì)象結(jié)合而產(chǎn)生的熒光偏振度的變化。
但是上述專利明確指出其適宜于檢測(cè)高分子量物質(zhì)，故現(xiàn)有的熒光偏振分 析方法在測(cè)定小分子間相互作用時(shí)存在靈敏度不高的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度更高、特異性更強(qiáng)和使用范圍更廣的熒 光偏振分析方法，本方法中待測(cè)樣品通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分子識(shí)別元件，經(jīng)分子 識(shí)別，然后與分子識(shí)別元件發(fā)生特異性結(jié)合，其生物或化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)通 過納米粒子將熒光偏振信號(hào)放大，以此達(dá)到高靈敏度檢測(cè)的目的。本發(fā)明所述 的技術(shù)方案如下所述。
一種納米粒子強(qiáng)化的熒光偏振分析方法，其包含如下步驟
(1) 提供一種納米粒子，組裝第一識(shí)別元件到所述納米粒子上得到納米粒 子標(biāo)記的第一識(shí)別元件；
(2) 提供一種指示染料，將所述指示染料標(biāo)記到第二識(shí)別元件上得到指示 染料標(biāo)記的第二識(shí)別元件；
(3) 提供含有待測(cè)靶標(biāo)分子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將所述納米粒子標(biāo)記的第一識(shí)別 元件及所述指示染料標(biāo)記的第二識(shí)別元件置入所述含有待測(cè)靶標(biāo)分子的標(biāo)準(zhǔn)溶 液中，在第一識(shí)別元件和第二識(shí)別元件共同作用下引發(fā)特異性識(shí)別反應(yīng)，引起 溶液體系的熒光偏振強(qiáng)度發(fā)生變化，然后根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)靶標(biāo)分子的 濃度和相應(yīng)的熒光偏振強(qiáng)度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；
(4) 提供含有待測(cè)靶標(biāo)分子的樣本溶液，將所述納米粒子標(biāo)記的第一識(shí)別 元件及所述指示染料標(biāo)記的第二識(shí)別元件置入所述含有待測(cè)靶標(biāo)分子的樣本溶 液中，在第一識(shí)別元件和第二識(shí)別元件共同作用下引發(fā)特異性識(shí)別反應(yīng)，弓l起 溶液體系的熒光偏振強(qiáng)度發(fā)生變化，然后根據(jù)所述樣本溶液中待測(cè)靶標(biāo)分子的 熒光偏振強(qiáng)度推測(cè)出待測(cè)靶標(biāo)分子的濃度。
其中，所述納米粒子是分散性好，均一度高的納米顆粒，該納米顆粒的粒 徑尺寸范圍是l-100nm，所述納米粒子包括金屬納米粒子、半導(dǎo)體納米粒子或復(fù) 合型納米粒子，所述金屬納米粒子包括納米金、納米銀等，所述半導(dǎo)體納米粒子包括硫化鋅、硫化鎘或硫化鉛等，所述復(fù)合型納米粒子是指高分子材料制成 的納米粒子。
其中，所述第一識(shí)別元件是通過物理吸附、靜電吸附、特異性識(shí)別或共價(jià) 鍵耦合等方式組裝到所述納米粒子表面上的。所述第一識(shí)別元件和第二識(shí)別元 件為糖、核酸、酶、脂、多肽、抗原、抗體或蛋白質(zhì)等生物分子中的一種，所 述第一識(shí)別元件和第二識(shí)別元件可以相同，也可以不同。
其中，所述生物分子組裝在納米粒子上不會(huì)改變其生物活性。
其中，所述指示染料是異硫氰酸熒光素FITC、紅色熒光素Cy3或藍(lán)色熒光 素Cy5中的一種。
其中，所述的靶標(biāo)分子為化學(xué)小分子或糖、核酸，多肽、酶、脂、抗原、 抗體或蛋白質(zhì)等生物分子或汞、鉛、鎘等金屬離子。
本發(fā)明選用納米粒子強(qiáng)化熒光偏振檢測(cè)信號(hào)是因?yàn)榧{米粒子具有大的比 表面積、量子尺寸效應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)活性和生物共容性等特性，能夠通過物理吸 附、靜電吸附、特異性識(shí)別和共價(jià)鍵耦合等方式固定不同性質(zhì)的識(shí)別元件。因 為熒光偏振技術(shù)對(duì)研究小分子間的相互作用的精度和靈敏度不高，所以熒光偏 振技術(shù)應(yīng)用范圍不廣。但是通過引入納米粒子，即使是研究小分子間的相互作 用，也可以得到很好檢測(cè)靈敏度。這是由于納米粒子龐大的表面積和生物共容 性的性質(zhì)，可以極大地提高識(shí)別元件的固載量，并有效地增大識(shí)別元件和熒光 素標(biāo)記的識(shí)別元件與耙標(biāo)分子復(fù)合體的體積，從而達(dá)到對(duì)檢測(cè)信號(hào)的放大，從 而顯著提高了檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定度，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏迅速的特點(diǎn)。因?yàn)?根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，其識(shí)別元件可以是不同的生物元件，具有很廣的適用性。
本發(fā)明所提供的納米粒子強(qiáng)化的熒光偏振分析方法，與傳統(tǒng)的熒光偏振方 法比較，本方法具有靈敏度更高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢出限更低，適用范圍更廣， 實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，干擾因素少和線性范圍較寬的特點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的分析技術(shù)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中檢測(cè)流程的示意圖； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中檢測(cè)流程的示意圖。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)依據(jù)附圖并結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。 實(shí)施例1 河水中汞離子的測(cè)定
請(qǐng)參考圖1所示，首先采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備分散性好，均一度 高的含納米金粒子1的溶液，然后將巰基修飾核酸探針2 (序列為 5，-SH-(CH2)6-A1(rGCTTCTGTTCTCTAC-3，)通過形成S-Au共價(jià)鍵，組裝到納 米金粒子1的表面形成納米金粒子標(biāo)記的巰基修飾核酸探針3。并制備異硫氰酸 熒光素修飾的核酸探針4 (序列為5，-FAM-(CH2)6-GTTGT GTTCA GTTGC )， 制備過程中用到異硫氰酸熒光素5。
取含汞離子6的河水樣本10份，每份5-10毫升，分別采用0.22微米纖維 素酯膜進(jìn)行過濾。接下來的檢驗(yàn)過程中為了減小誤差，采用同一塊酶標(biāo)板對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)汞溶液和水樣同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。將標(biāo)準(zhǔn)汞溶液和水樣分別加入已含有納米金粒 子標(biāo)記的巰基修飾核酸探針3及異硫氰酸熒光素修飾的核酸探針4的0.1M NaNO"pH 7.2)溶液的酶標(biāo)板中，混勻，低速離心，室溫反應(yīng)10-15分鐘，然后 進(jìn)行熒光偏振檢測(cè)。如果采用96孔板，反應(yīng)總體積為200微升，如果采用384 孔板，反應(yīng)總體積為20微升。沒有汞離子6存在的情況下，核酸探針之間因?yàn)?序列不互補(bǔ)，而不能形成雜交雙聚體，溶液體系的熒光偏振強(qiáng)度不會(huì)發(fā)生改變。 在有汞離子6存在的情況下，因?yàn)楹怂崽结樃髯院幸欢〝?shù)量的胸腺嘧啶核(T)，能夠特異性結(jié)合汞離子，形成T-Hg2+-T復(fù)合體7，從而探針之間形成雜 交雙聚體，引起溶液體系的熒光偏振強(qiáng)度發(fā)生改變。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)汞溶液制作汞離 子熒光偏振強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后比對(duì)樣本的熒光偏振強(qiáng)度，可以計(jì)算出河 水樣本中的汞離子濃度。
實(shí)施例2 核酸分子的測(cè)定
首先采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備分散性好、均一度高的含納米金粒子 10的溶液，然后將巰基修飾核酸探針11 (序列為5'-SH-(CH2)6-A10-ATGATCACCATAAG -3')通過Au-S共價(jià)鍵組裝到納米金粒子10的表面形成納 米金粒子標(biāo)記的巰基修飾核酸探針12。并制備異硫氰酸熒光素修飾的核酸探針 13 (序列為3"-FAM-(CH2)6-TCAGCAGCGGCAGCA)，制備過程中用到異硫氰 酸熒光素14。
將含核酸分子15的待檢測(cè)樣本加入到含有納米金粒子標(biāo)記的巰基修飾核酸 探針12和異硫氰酸熒光素修飾的核酸探針13的混合溶液中，該混合溶液中還 含有25mMTris《l(pH7.2)，0.3MNaCl，室溫反應(yīng)10-15分鐘，然后進(jìn)行熒光偏 振檢測(cè)。當(dāng)待測(cè)樣本中不含有靶標(biāo)核酸分子15，則不能形成雜交雙聚體，溶液 體系的熒光偏振強(qiáng)度不會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)溶液系統(tǒng)中含有靶標(biāo)核酸分子15 (該靶 標(biāo)核酸分子15的序列為5， -TGCTGCCGCTGCTGAGAGTACGCAAGCGT CTTATGGTGATCAT-3，)時(shí)，它能使納米金粒子標(biāo)記的巰基修飾核酸探針12 和異硫氰酸熒光素修飾的核酸探針13發(fā)生雜交反應(yīng)，形成雜交雙聚體，引起溶 液體系的熒光偏振強(qiáng)度發(fā)生改變。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液制作核酸分子熒光偏振強(qiáng) 度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后比對(duì)樣本的熒光偏振強(qiáng)度，可以計(jì)算出河水樣本中的核 酸分子濃度。
權(quán)利要求
1、一種納米粒子強(qiáng)化的熒光偏振分析方法，其包含如下步驟(1)提供一種納米粒子，組裝第一識(shí)別元件到所述納米粒子上得到納米粒子標(biāo)記的第一識(shí)別元件；(2)提供一種指示染料，將所述指示染料標(biāo)記到第二識(shí)別元件上得到指示染料標(biāo)記的第二識(shí)別元件；(3)提供含有待測(cè)靶標(biāo)分子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將所述納米粒子標(biāo)記的第一識(shí)別元件及所述指示染料標(biāo)記的第二識(shí)別元件置入所述含有待測(cè)靶標(biāo)分子的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，在第一識(shí)別元件和第二識(shí)別元件共同作用下引發(fā)特異性識(shí)別反應(yīng)，引起溶液體系的熒光偏振強(qiáng)度發(fā)生變化，然后根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)靶標(biāo)分子的濃度和相應(yīng)的熒光偏振強(qiáng)度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；(4)提供含有待測(cè)靶標(biāo)分子的樣本溶液，將所述納米粒子標(biāo)記的第一識(shí)別元件及所述指示染料標(biāo)記的第二識(shí)別元件置入所述含有待測(cè)靶標(biāo)分子的樣本溶液中引發(fā)特異性識(shí)別反應(yīng)，引起溶液體系的熒光偏振強(qiáng)度發(fā)生變化，然后根據(jù)所述樣本溶液中待測(cè)靶標(biāo)分子的熒光偏振強(qiáng)度推測(cè)出待測(cè)靶標(biāo)分子的濃度。
2、 如權(quán)利要求1所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述納米粒子是分散性好，均一度高的納米顆粒，該納米顆粒的尺寸范圍是l-100nm。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述納米粒子包括金屬納米粒子、半導(dǎo)體納米粒子或復(fù)合型納米粒子。
4、 如權(quán)利要求3所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述金屬納米粒子包括納米金、納米銀，所述半導(dǎo)體納米粒子包括硫化鋅、硫化鎘或硫化鉛，所述復(fù)合型納米粒子是由高分子材料制成的納米粒子。
5、 如權(quán)利要求1所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述第一識(shí)別元件是通過物理吸附、靜電吸附、特異性識(shí)別或共價(jià)鍵耦合方式組裝到所述納米粒子表面上的。
6、 如權(quán)利要求1、 2、 4、 5任意一項(xiàng)所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述第一識(shí)別元件和第二識(shí)別元件為糖、核酸、酶、脂、多肽、抗原、抗體或蛋白質(zhì)等生物分子中的一種。
7、 如權(quán)利要求6所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述第一識(shí)別元件和第二識(shí)別元件相同，或者第一識(shí)別元件和第二識(shí)別不相同。
8、 如權(quán)利要求6所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述生物分子組裝在納米粒子上不會(huì)改變其生物活性。
9、 如權(quán)利要求1、 2、 4、 5、 7、 8任意一項(xiàng)所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述指示染料是異硫氰酸熒光素FITC、紅色熒光素Cy3或藍(lán)色熒光素Cy5中的一種。
10、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 5、 7、 8任意一項(xiàng)所述的熒光偏振分析方法，其特征在于，所述的耙標(biāo)分子為化學(xué)小分子或糖、核酸，多肽、酶、脂、抗原、抗體或蛋白質(zhì)等生物分子或汞、鉛、鎘等金屬離子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種靈敏度更高、特異性更強(qiáng)和使用范圍更廣的熒光偏振分析方法，本方法中待測(cè)樣品通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分子識(shí)別元件，經(jīng)分子識(shí)別，然后與分子識(shí)別元件發(fā)生特異性結(jié)合，其生物或化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)通過納米粒子將熒光偏振信號(hào)放大，以此達(dá)到高靈敏度檢測(cè)的目的。本發(fā)明所提供的納米粒子強(qiáng)化的熒光偏振分析方法，與傳統(tǒng)的熒光偏振方法比較，本方法具有靈敏度更高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢出限更低，適用范圍更廣，實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，干擾因素少和線性范圍較寬的特點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的分析技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101639444SQ20081004116
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者葉邦策, 尹斌成 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)