專利名稱：毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，該裝置將毛細管電泳-柱上 激光誘導熒光檢測和熒光偏振檢測技術結合為一體，不僅具有高效分離和高靈敏檢測的優(yōu)點， 還為研究分子間的相互作用提供了熒光偏振的信息。
背景技術：
毛細管電泳是現(xiàn)今一種高效快速的分析分離手段，并在化學、生物、環(huán)境、醫(yī)藥等多個 領域都有廣泛的應用包括有機和無機小分子的檢測、多肽和蛋白質(zhì)的分離、DNA序列和手 性分離等方面。而激光誘導熒光檢測方法(LIF)是一種高靈敏的檢測方法，其檢測靈敏度甚 至可以達到單分子的水平。二者結合產(chǎn)生的分析儀器毛細管電泳一激光誘導熒光檢測分析儀 器(CE-LIF)是目前靈敏度較高、發(fā)展較快的分離檢測技術之一。并且具有高靈敏度、高分 辨率、高速度、樣品用量少、成本低和易于自動化等優(yōu)點。
熒光偏振是指當熒光分子受到平面偏振光激發(fā)時，熒光分子發(fā)射偏振光。當熒光標記物 分子質(zhì)量相對較小時，在溶液中旋轉運動較快，該分子受到偏振光激發(fā)時產(chǎn)生的熒光發(fā)射幾 乎是消偏振的；當其與另一個大分子物質(zhì)結合后，其體積發(fā)射了很大的變化，熒光體的旋轉 運動受到抑制，熒光偏振會顯著增大。因此，熒光偏振的測定利用了熒光物質(zhì)分子在溶液中 旋轉速度于分子大小呈反比的特點，是一種特別適用于研究分子間相互作用(如蛋白質(zhì)-蛋白 質(zhì)作用、蛋白質(zhì)-DNA鍵合、抗原-抗體免疫反應等)的技術。
本發(fā)明將毛細管電泳-柱上激光誘導熒光檢測與熒光偏振檢測技術結合，不僅具有高效分 離和高靈敏檢測的優(yōu)點，還可同時得到熒光偏振的信息，為研究生物大分子之間的相互作用 提供了一種新的分析方法和儀器平臺。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，該裝置集合了高效、快速 分離的毛細管電泳和高靈敏的激光誘導熒光檢測的優(yōu)點，熒光偏振還可為研究生物大分子(蛋 白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、抗原-抗體)之間的相互作用提供了一種新的分析方法和儀器本發(fā)明提出的是一種毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，主要是由毛細管電泳 分離單元、熒光激發(fā)單元、光路調(diào)整與校準單元、熒光偏振檢測單元、信號轉換與記錄單元 和數(shù)據(jù)處理單元，六部分所組成。裝置中關鍵器件主要包括偏振激光光源、光路調(diào)節(jié)透鏡、 緩沖液瓶、Pt電極、石英毛細管、高壓電源、針孔、熒光偏振分光光學器件、濾光片、熒光 探測元件和信號轉換器(見附圖1)。其基本工作原理為石英毛細管和Pt電極分別插入兩端 的緩沖液瓶中，并由高壓電源提供電泳分離所需的高電壓。偏振激光經(jīng)光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)聚焦后， 照射到石英毛細管的檢測窗口上激發(fā)毛細管內(nèi)的熒光物質(zhì)。激發(fā)的熒光經(jīng)光學透鏡聚焦進入 檢測系統(tǒng)，偏振熒光被偏振片分為垂直偏振光和水平偏振光，分別經(jīng)過濾光片后，熒光信號 被兩個熒光探測元件收集，經(jīng)過信號轉換器記錄在計算機中，進行數(shù)據(jù)分析和處理。
該裝置中，采用線性偏振的激光光源，使受激發(fā)的熒光體所發(fā)出的熒光將保留偏振特性。 由熒光體所發(fā)出的熒光經(jīng)熒光偏振分光光學器件分離為兩束光，分別為垂直偏振光和水平偏 振光(見附圖l)。兩束偏振光經(jīng)兩個熒光檢測元件，分別進行記錄，并由此得到熒光物質(zhì)的 熒光偏振信息。裝置中使用的熒光探測元件，可以是光電倍增管，也可以是電荷耦合數(shù)字成 像器件。
該裝置中，檢測窗口可以是通過去除毛細管表面涂層的柱上檢測窗口，也可以在毛細管 柱后連接石英鞘流池。激光光源經(jīng)過光路調(diào)節(jié)透鏡(2)，使激發(fā)光聚焦到毛細管檢測窗上， 光斑直徑小于20 ^un，從而有效地降低了光散射，提高儀器的靈敏度。激發(fā)光與熒光檢測系 統(tǒng)呈90°角垂直排列，有效的避免了激發(fā)光散射對弱熒光的檢測所造成的干擾，顯著提高檢 測的靈敏度。熒光檢測單元的光學透鏡(7)距離毛細管檢測窗口小于0.5 mm，可有效地避 免環(huán)境中的雜散光進入檢測系統(tǒng)，減小對熒光檢測干擾。
該裝置中，所述高壓電源可以提供正、負高電壓。靠近檢測窗口處電極接地，實驗較為 安全。通過改變電源輸出的電壓極性，可實現(xiàn)毛細管電泳的正、負分離模式。
本發(fā)明將毛細管電泳-柱上激光誘導熒光檢測與熒光偏振技術相結合，使之不僅具有高效、 快速分離和高靈敏檢測的優(yōu)點，還為研究生物大分子之間的相互作用提供了熒光偏振的信息。
圖1為毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置結構示意圖； 圖2為DNA高靈敏檢測的毛細管電泳圖3為DNA加合物熒光探針與抗體相互作用的毛細管電泳熒光偏振圖； 圖4為凝血酶與凝血酶適配體相互作用的毛細管電泳熒光偏振圖。本發(fā)明所涉及的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置基本結構如圖1所示。圖中 1為偏振激光光源，可以是氬離子激光器、He-Ne激光器、染料激光器、半導體激光器，也 可是其他光源，根據(jù)需要選用；2為光路調(diào)節(jié)透鏡；3為緩沖液瓶；4為Pt電極；5為石英毛
細管；6為高壓電源；7為光學透鏡；8為針孔；9為熒光偏振分光光學器件；IO為濾光片；
11為熒光探測元件，可以是光電倍增管(PMT)，也可以是電荷耦合數(shù)字成像器件(CCD);
12為信號轉換器；13為計算機。
其工作原理石英毛細管(5)和Pt電極(4)分別插入兩端的緩沖液瓶(3)中，并由高 壓電源(6)提供電泳分離所需的高電壓，由此構成毛細管電泳分離單元。高強度激光(1) 經(jīng)由光路調(diào)節(jié)透鏡(2)聚焦到石英毛細管的檢測窗口，激光光斑直徑小于20Mm，由此構成 熒光激發(fā)單元。該部分中，激發(fā)光源與熒光檢測系統(tǒng)呈90度角分布，可有效的避免激發(fā)光散 射對熒光檢測的干擾。熒光分子在高電壓的驅(qū)動下，經(jīng)過毛細管檢測窗口被激光所激發(fā)，所
發(fā)出的熒光可被熒光檢測單元接收，該部分包括光學透鏡(7);針孔(8);熒光偏振分光光 學器件(9);濾光片(10);熒光探測元件(11)。其中，光學透鏡(7)距離毛細管檢測窗口
小于0.5mm，可有效的避免環(huán)境中的雜散光進入檢測系統(tǒng)，干擾弱熒光的檢測。熒光信號被 熒光探測元件(11)檢測后，經(jīng)過信號轉換器(12)記錄在計算機(13)中。
在該裝置中，采用線性偏振的激光光源，受激發(fā)的熒光分子所發(fā)出的熒光將保留偏振特 性。該熒光的偏振響應大小與熒光分子的體積有關當熒光標記物分子質(zhì)量相對較小時，在 溶液中旋轉運動較快，該分子受到偏振光激發(fā)時產(chǎn)生的熒光發(fā)射幾乎是消偏振的；當其與另 一個大分子物質(zhì)結合后，其體積發(fā)射了很大的變化，熒光體的旋轉運動受到抑制，熒光偏振 會顯著增大。該熒光經(jīng)光學透鏡(7)聚焦進入檢測系統(tǒng)，經(jīng)熒光偏振分光光學器件(9)分 為兩束光，分別為垂直偏振光(/v)和水平偏振光(/》，由二者熒光強度的比值可計算出熒 光的偏振(fP)響應的大小。
兩束偏振光分別經(jīng)過濾光片(10)后，熒光信號分別被兩個熒光探測元件(11)檢測，并經(jīng) 過信號轉換器(12)記錄在計算機(13)中，進行數(shù)據(jù)分析和處理。實施例1:
圖2是本發(fā)明用于DNA高靈敏檢測的毛細管電泳圖。實驗條件內(nèi)徑50微米的聚丙烯 酰胺涂層毛細管，總長40cm，有效長度33cm。 Tris-甘氨酸緩沖液(Tris30mM，甘氨酸160 mM， pH=8.5)，分離電壓為20kV。如圖所示，dsDNA為雙鏈小牛胸腺DNA。
應用本發(fā)明裝置在5分鐘內(nèi)可檢測出22 x 10—15 mol/L的熒光標記的小牛胸腺DNA，體現(xiàn) 了本裝置高效、快速分離和高靈敏檢測的優(yōu)點。
實施例2:
圖3是本發(fā)明用于研究DNA加合物熒光探針與抗體相互作用的毛細管電泳熒光偏振圖。 實驗條件內(nèi)徑25微米的熔融石英毛細管，總長30cm，有效長度24cm。 Tris-甘氨酸緩沖 液(Tris25mM，甘氨酸192mM， pH=8.3)，分離電壓為15kV。應用本發(fā)明裝置，可以在 高靈敏檢測的同時，得到不同峰的熒光偏振值，為研究DNA加合物熒光探針與抗體相互作 用提供了有利的數(shù)據(jù)。如圖所示，三個峰的熒光偏振值分別為0.006， 0.109， 0.131。根據(jù)三 個峰熒光偏振的不同，可以方便的確定上述三個峰分別為peakl為TMR熒光內(nèi)標，peak2 為DNA加合物熒光探針，peak 3為DNA加合物熒光探針與抗體的復合物。
實施例3:
圖4是本發(fā)明用于研究凝血酶與凝血酶適配體(aptamer)相互作用的毛細管電泳熒光偏 振圖。實驗條件內(nèi)徑25微米的熔融石英毛細管，總長30cm，有效長度24cm。 Tris-甘氨 酸緩沖液(Tris25mM，甘氨酸192mM， pH=8.3)，分離電壓為20kV。應用本發(fā)明裝置， 可以在高靈敏檢測凝血酶的同時，得到不同峰的熒光偏振值，為研究凝血酶與凝血酶適配體 相互作用提供了有利的數(shù)據(jù)。如圖所示，兩個峰的熒光偏振值分別為0.304和0.196。根據(jù)兩 個峰熒光偏振的不同，可以方便的確定上述兩個峰分別為peak l為凝血酶與凝血酶適配體 復合物，peak2為熒光標記的凝血酶適配體。
權利要求
1、毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，主要由毛細管電泳分離單元、熒光激發(fā)單元、光路調(diào)整與校準單元、熒光偏振檢測單元、信號轉換與記錄單元和數(shù)據(jù)處理單元六部分所組成。其中關鍵器件主要有偏振激光光源、光路調(diào)節(jié)透鏡、緩沖液瓶、Pt電極、石英毛細管、高壓電源、針孔、熒光偏振分光光學器件、濾光片、熒光探測元件和信號轉換器。其基本工作原理為石英毛細管和Pt電極分別插入兩端的緩沖液瓶中，并由高壓電源提供電泳分離所需的高電壓，構成毛細管電泳分離單元。熒光物質(zhì)經(jīng)毛細管電泳分離到達檢測窗口時，被熒光激發(fā)單元發(fā)出的高強度激光所激發(fā)。發(fā)射熒光經(jīng)光學透鏡進入熒光偏振檢測系統(tǒng)，偏振熒光被熒光偏振分光光學器件分為垂直偏振光和水平偏振光，兩束偏振光分別經(jīng)過濾光片被兩個熒光探測元件收集，經(jīng)過信號轉換系統(tǒng)記錄在計算機中，進行數(shù)據(jù)分析和處理。
2、 根據(jù)權利要求1所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于該 裝置將毛細管電泳-柱上激光誘導熒光檢測與熒光偏振技術相結合，使之不僅具有高效、快速 分離和高靈敏檢測的優(yōu)點，同時還提供了熒光偏振的信息，為研究生物大分子之間的相互作 用提供了一種新的分析方法和儀器平臺。
3、 根據(jù)權利要求1所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于激 發(fā)光源采用線性偏振的激光光源，使受激發(fā)的熒光體所發(fā)出的熒光將保留偏振特性。
4、 根據(jù)權利要求l所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于偏 振熒光經(jīng)熒光偏振分光光學器件分離為兩束光，分別是垂直偏振光和水平偏振光，兩束偏振 光分別經(jīng)由兩個熒光檢測元件，進行采集和記錄，進而得到熒光物質(zhì)的熒光偏振信息。
5、 根據(jù)權利要求l所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于高 壓電源可以提供正、負高電壓，通過改變電源輸出的電壓極性，可實現(xiàn)毛細管電泳的正、負 分離模式。
6、 根據(jù)權利要求l所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于檢 測窗口可以通過去除毛細管表面涂層的柱上檢測窗口 ，也可以在毛細管柱后連接石英鞘流池。
7、 根據(jù)權利要求l所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于激光光源經(jīng)過光路調(diào)節(jié)透鏡，使激發(fā)光聚焦到毛細管檢測窗上，光斑直徑小于20 pm，從而有效地降低了光散射，提高儀器的靈敏度。
8、 根據(jù)權利要求1所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于激光與熒光檢測系統(tǒng)呈90。角垂直排列，有效地避免了激發(fā)光散射所造成的干擾，從而顯著地提高了檢測的靈敏度。
9、 根據(jù)權利要求1所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于熒光檢測單元的光學透鏡到毛細管檢測窗口的小于0.5 mm，可有效地避免環(huán)境中的雜散光進入 檢測系統(tǒng)，減小對熒光檢測干擾。
10、 根據(jù)權利要求1所述的毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，其特征在于 熒光探測元件，可以是光電倍增管，也可以是電荷耦合數(shù)字成像器件。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛細管電泳-柱上激光誘導熒光偏振檢測裝置，主要包括毛細管電泳分離單元、熒光激發(fā)單元、光路調(diào)整與校準單元、熒光偏振檢測單元、信號轉換與記錄單元和數(shù)據(jù)處理單元。裝置中，激發(fā)光采用線性偏振激光光源，使受激發(fā)的熒光體所發(fā)出的熒光保留偏振特性。所激發(fā)的熒光經(jīng)偏振分光光學器件分為垂直偏振光和水平偏振光，兩部分偏振光分別被兩個熒光偏振檢測元件收集，經(jīng)過信號轉換器記錄在計算機中。兩束偏振光的相對大小可計算出熒光偏振響應的大小，熒光偏振可用于研究生物大分子間的相互作用。因此，該裝置不僅具有高效、快速分離和高靈敏檢測等優(yōu)點，還為生物大分子間相互作用的研究提供了一種新的儀器平臺。
文檔編號G01N21/64GK101587075SQ20091008821
公開日2009年11月25日 申請日期2009年7月13日 優(yōu)先權日2009年7月13日
發(fā)明者宋茂勇, 尹俊發(fā), 濤 李, 汪海林, 王智鑫 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心