專(zhuān)利名稱(chēng)：熒光偏振hERG試驗(yàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心血管安全試驗(yàn)領(lǐng)域，特別涉及用于篩選測(cè)試化合物引起受試者心 臟中毒的能力的試驗(yàn)、方法和試劑盒。本文公開(kāi)的試驗(yàn)、方法和試劑盒基于新型熒光示 蹤化合物與hERG K+通道的相互作用，該相互作用通過(guò)膜制劑進(jìn)行利用，所述膜制劑來(lái) 自設(shè)計(jì)具有高水平hERG K+通道表達(dá)的細(xì)胞系。本文公開(kāi)的試驗(yàn)、方法和試劑盒可用于 確認(rèn)對(duì)人類(lèi)心臟復(fù)極具有不利影響(特別是延長(zhǎng)心電圖的Q-T間期的傾向)的化合物。
背景技術(shù)：
人類(lèi)ether-a-go-go相關(guān)基因(hERG)編碼深刻影響人類(lèi)心室復(fù)極的快速延遲 內(nèi)向整流鉀通道(1&)(參見(jiàn) Curran，M.E. ； Splawski, I. ； Timothy, K.W. ； Vincent, G.M. ； Green, E.D. ； Keating, Μ.T., A molecular basis for cardiac arrhythmia HERG mutations cause long QT syndrome.Cell 1995, 80, (5), 795—803; Sanguinetti, M.C.; Jiang, C. ； Curran, M.E. ； Keating, M.T., A mechanistic link between an inherited and an acquired cardiac arrhythmia HERG encodes the IKr potassium channel.Cell 1995, 81, (2)，299-307 ； Trudeau, M.C. ； Warmke, J.W. ； Ganetzky, B. ； Robertson, G.A., HERG, a human inward rectifier in the voltage-gated potassium channel family.Sciencel995, 269, (5220), 92-5 ；以及 Warmke, J.W. ； Ganetzky, B., A family of potassium channel genes related to eag in Drosophila and mammals.Proc Natl Acad Sci U S A1994, 91, (8), 3438-42)。流經(jīng)心室肌中的通道的1&復(fù)極電流的阻滯可導(dǎo)致Q-T間期的延長(zhǎng)，所述Q-T 間期的延長(zhǎng)為稱(chēng)作尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速(torsades de pointes)以及可能的致命性心律 失常的特征心電案(參見(jiàn) Sanguinetti，M.C. ； Tristani-Firouzi, M.，hERG potassium channels and cardiac arrhythmia.Nature 2006, 440, (7083), 463-9 ； 以及 Haverkamp, W. ； Breithardt, G. ； Camm, A.J. ； Janse, M.J. ； Rosen, M.R. ； Antzelevitch, C.， Escande，D. ； Franz, Μ. ； Malik, Μ. ； Moss, Α. ； Shah, R., The potential for QT prolongation and pro arrhythmia by non-antiarrhythmic drags clinical and regulatory implications.Report on a policy conference of the European Society of Cardiology.Eur Heart J 2000，21，(15)，1216-31)。該通道(本文稱(chēng)作hERGK+通道)結(jié)合各種不同類(lèi)型的 化學(xué)結(jié)構(gòu)的混雜性質(zhì)(參見(jiàn) Cavalli，Α. ； Poluzzi, Ε. ； De Ponti, F. ； Recanatini，M.; Toward a pharmacophore for drugs inducing the long QTsyndrome insights from a CoMFA study of HERG K (+) channel blockers.J Med Chem2002，45，(18)，3844-53)以及來(lái)自該
9相互作用的潛在致命后果已使得國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(International Congress of Harmonization)和 美國(guó)食品和藥物管理局推薦所有新的候選藥物均進(jìn)行在使用人類(lèi)hERG蛋白質(zhì)(天然形式 或以重組形式表達(dá))的功能膜片鉗試驗(yàn)中的測(cè)試(參見(jiàn)Bode，G. ； Olejniczak, K., ICH topic the draft ICH S7Bstep 2 note for guidance on safety pharmacology studies for human pharmaceuticals.Fundam Clin Pharmacol 2002, 16，(2)，105-18)。盡管自動(dòng)化的高通量 膜片鉗方法在近期得以發(fā)展，但這種體系需要專(zhuān)業(yè)操作者、活細(xì)胞和相當(dāng)大的資本投資 (參見(jiàn) Bridgland-Taylor, M.H. ； Hargreaves, A.C. ； Easter, Α.; Orme, Α.; Henthorn, D.C. ； Ding, Μ. ； Davis, A.M. ； Small, B.G. ； Heapy, C.G. ； Abi-Gerges, N.； Persson, F. ； Jacobson, I. ； Sullivan, Μ. ； Albertson, N. ； Hammond, T.G. ； Sullivan, Ε. ； Valentin, J.P. ； Pollard, C.E., Optimisation and validation of a medium-throughput electrophysiology-based hERG assay using IonWorks HT.J Pharmacol Toxicol Methods 2006, 54, (2)，189-99 ； 以及 Dubin, Α.Ε. ； Nasser, N. ； Rohrbacher, J. ； Hermans, A.N. ； Marrannes, R. ； Grantham, C. ； Van Rossem, K. ； Cik, Μ. ； Chaplan, S.R.； Gallacher, D.; Xu, J. ； Guia, Α.; Byrne, N.G. ; Mathes, C.， Identifying modulators of hERG channel activity using the PatchXpress planar patch clamp.J Biomol Screen 2005, 10，(2)，168-81)。此外，由于膜片鉗測(cè)試較昂貴，并且由于許多化學(xué)上不同的構(gòu) 架(scaffolds)阻塞hERG K+通道，在早期藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中用于減輕潛在的心臟傾向性 (liability)的策略通常利用結(jié)合試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)化合物在功能膜片鉗試驗(yàn)中阻滯hERG電流的 能力(參見(jiàn) Whitebread， S.; Hamon, J.; Bojanic, D.; Urban, L., Keynote review in vitro safety pharmacology profiling an essential tool for successful drag development. Drag Discov Today 2005，10，(21)，1421-33;以及 Diaz，G.J. ; Daniell，K. ; Leitza， S.T. ； Martin, R丄.；Su, Ζ. ； McDermott, J.S. ； Cox, B.F. ； Gintant, G.A., The[3H] dofetilide binding assay is a predictive screening tool for hERG blockade and proarrhythmia Comparison of intact cell and membrane preparations and effects ofaltering[K+]o.J Pharmacol Toxicol Methods 2004，50，(3)，187—99)。使用[3H]-多非利特(參見(jiàn) Diaz，G.J. ； Daniell，K. ； Leitza, S.T. ； Martin, R.L. ； Su, Ζ. ； McDermott, J.S. ； Cox, B.F. ； Gintant, G.A., The[3H]dofetilide binding assay is a predictive screening tool for hERG blockade and proarrhythmia Comparison of intact cell and membrane preparations and effects of altering[K+]o.J Pharmacol Toxicol Methods 2004，50，(3)，187-99 ；以及 Finlayson，K. ； Turnbull, L. ； January, C.T. ； Sharkey, J. ； Kelly, J.S.， [3H]dofetilide binding to HERG transfected membranes a potential high throughput preclinical screen.Eur J Pharmacol 2001，430，(1)，147-8)，[3H]-阿司咪唑 (參見(jiàn) Chiu，P.J. ； Marcoe, K.F. ； Bounds, S.E. ； Lin, C.H. ； Feng, J.J. ； Lin, A.; Cheng, F.C. ; Crumb, W.J. ； Mitchell, R.，Validation of a[3H]astemizolebinding assay in HEK293 cells expressing HERG K+channels.J Pharmacol Sci 2004, 95， (3)，311-9)，或 [35S]_MK499(參見(jiàn) Wang, J. ； Delia Penna, K. ； Wang, H. ； Karczewski, J. ； Connolly, T.M. ； Koblan, K.S. ； Bennett, P.B. ； Salata，J.J.，F(xiàn)unctional and pharmacological properties of canine ERG potassium channels.Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003，284， (1)，H256-67)的放射配體結(jié)合試驗(yàn)顯示出對(duì)hERG K+通道阻滯的預(yù)測(cè)。然而，放射配體的制備、儲(chǔ)存和處理增加了試驗(yàn)程序的時(shí)間和成本。此外，已描述評(píng)估化合物與hERG K+通道的結(jié)合的放射試驗(yàn)為非均質(zhì)過(guò)濾結(jié)合試驗(yàn)，并需要通過(guò)使用真空歧管在濾紙上捕 獲放射配體結(jié)合的膜蛋白質(zhì)而分離未結(jié)合的放射配體。該程序使得所述試驗(yàn)對(duì)于大規(guī)模 篩選或常規(guī)化合物評(píng)價(jià)(profiling)難以自動(dòng)化，因此限制了其實(shí)際用途。此外，在過(guò)去 十年內(nèi)，工業(yè)界和學(xué)術(shù)界中均力主開(kāi)發(fā)非放射方法以取代這種試驗(yàn)。熒光偏振(FP)試驗(yàn)提供了完全均質(zhì)的混合讀取形式以表征配體對(duì)受體的親合 性，在許多情況中其可用于取代許多放射結(jié)合試驗(yàn)(參見(jiàn)Burke，T.J. ； Loniello, K.R.； Beebe, J.A. ； Ervin, K.M., Development and application of fluorescence polarization assays in drag discovery.Comb Chem High Throughput Screen 2003, 6, (3), 183-94)。 該技術(shù) 基于化合物從受體置換熒光探針(“示蹤物”)的能力，其通過(guò)光學(xué)信號(hào)的變化進(jìn)行檢 測(cè)。在這種試驗(yàn)中，示蹤物通常由已知的受體的高親合性配體組成，所述配體化學(xué)已連 接至熒光分子而不顯著干擾受體-配體相互作用的親合性(參見(jiàn)Huang，X.，F(xiàn)luorescence polarizaion competition assay the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J BiomolScreen 2003，8，(1)，34-8)。在 FP 試驗(yàn)中，當(dāng)示蹤物 分子用平面偏振光激發(fā)時(shí)，若在光子激發(fā)和發(fā)射之間的時(shí)間過(guò)程(通常為納秒)中熒光團(tuán) 保持其取向，則發(fā)射光的偏振得以保持。在溶液中，當(dāng)示蹤物結(jié)合至如蛋白質(zhì)的較大分 子時(shí)，由于蛋白質(zhì)-示蹤物絡(luò)合物相比于自由示蹤物本身旋轉(zhuǎn)更緩慢，因此該取向大量 保持。當(dāng)示蹤物通過(guò)連接至受體的配體而從受體置換時(shí)，來(lái)自示蹤物的光發(fā)射相對(duì)于激 發(fā)源而被消偏振。常規(guī)放射配體結(jié)合試驗(yàn)和FP試驗(yàn)之間的重要實(shí)際區(qū)別在于，與放射配體結(jié)合試 驗(yàn)不同，F(xiàn)P試驗(yàn)得以?xún)?yōu)化設(shè)置，其使用有限量的示蹤物，以及Kd值或Kd值以上的受體 濃度用于受體-示蹤物相互作用。這是因?yàn)樗鶞y(cè)量的光學(xué)信號(hào)取決于來(lái)自存在的所有示 蹤物(自由的或結(jié)合的)的信號(hào)，這不同于放射配體結(jié)合試驗(yàn)，在放射配體結(jié)合試驗(yàn)中 (分離之后)，僅有的測(cè)量信號(hào)歸因于結(jié)合的配體，而自由配體并不貢獻(xiàn)該信號(hào)。因此， 在FP試驗(yàn)中，任何未結(jié)合的示蹤物貢獻(xiàn)存在的消偏振光的含量，由此減少所測(cè)量的偏振 信號(hào)，并減小試驗(yàn)窗口。通常，配置FP試驗(yàn)使得在不存在競(jìng)爭(zhēng)配體下總示蹤物的50至 70%得以結(jié)合，從而在試驗(yàn)窗口(所測(cè)得的最大-最小偏振值)與試驗(yàn)靈敏度(IC5tl值接近 真實(shí) Ki 值的能力)之間取得平衡(參見(jiàn) Huang, X.，F(xiàn)luorescence polarization competition assay the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J Biomol Screen 2003, 8，(1)，34-8) 0 當(dāng)開(kāi)發(fā)使用純化的可溶性重組蛋白質(zhì)的 FP試驗(yàn)時(shí)，由于許多這種蛋白質(zhì)易于以足夠用于這種試驗(yàn)的量制得，因此這通常不是問(wèn) 題。然而，當(dāng)開(kāi)發(fā)用于如hERG的膜相關(guān)蛋白質(zhì)(在大部分情況中所述蛋白質(zhì)并未從它們 的膜組分以功能形式純化，其包含不可溶脂質(zhì)組分以及其他蛋白質(zhì))的試驗(yàn)時(shí)，該需要 構(gòu)成了挑戰(zhàn)。此外，大量膜組分的存在會(huì)通過(guò)散射光(參見(jiàn)Banks，P. ； Gosselin, M.； Prystay，L., Impact of a red-shifted dye label for high throughput fluorescence polarization assays of G protein-coupled receptors.J Biomol Screen 2000, 5, (5), 329-34)或通過(guò)導(dǎo)致增 加的示蹤物(其經(jīng)常含有親脂性熒光團(tuán))與膜本身的非特異性結(jié)合而干擾試驗(yàn)。因此，迄今為止仍未實(shí)現(xiàn)確認(rèn)和表征小分子對(duì)hERG K+通道的親合性，并說(shuō)明 與得自放射配體結(jié)合或膜片鉗試驗(yàn)的數(shù)據(jù)的密切關(guān)聯(lián)的均質(zhì)FP基試驗(yàn)的開(kāi)發(fā)。
1
發(fā)明內(nèi)容
為了避免與放射試驗(yàn)相關(guān)的問(wèn)題而評(píng)估hERG K+通道的結(jié)合，開(kāi)發(fā)了用于這些 試驗(yàn)的均質(zhì)FP基替代物。首先使用常規(guī)的放射配體置換試驗(yàn)確認(rèn)候選的高親合性熒光 示蹤物。然而，由于在初始細(xì)胞系中的hERG K+通道表達(dá)水平(Bmax)不足以配置FP試 驗(yàn)，發(fā)展了通過(guò)使用編碼兩種蛋白質(zhì)的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體將細(xì)胞表面標(biāo)志(CD8)的表達(dá) 連接至hERG K+通道的表達(dá)從而增加hERG K+通道表達(dá)水平的策略。該策略允許使用流 式細(xì)胞儀克隆分離高表達(dá)hERG K+通道細(xì)胞系，并能夠發(fā)展FP試驗(yàn)(包括進(jìn)一步的示蹤 物開(kāi)發(fā)和試驗(yàn)優(yōu)化)。所得FP試驗(yàn)可預(yù)測(cè)hERGK+通道結(jié)合，易于使用標(biāo)準(zhǔn)的板讀取器 (plate readers)進(jìn)行，并良好適于取代常規(guī)的放射結(jié)合試驗(yàn)而用作hERG K+通道傾向性的 化合物的分類(lèi)方式。本文描述了用于篩選小分子，即測(cè)試化合物，以表征它們對(duì)hERG K+通道的親 合性，以及它們引起受試者心臟中毒的能力的FP試驗(yàn)、方法和試劑盒。此外，本文描述 了用于所公開(kāi)的試驗(yàn)、方法和試劑盒的具有高的hERG K+通道表達(dá)水平的新型熒光示蹤 化合物和膜制劑的制備方法。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種新型的具有如下結(jié)構(gòu)通式⑴的熒光示蹤化合 物
權(quán)利要求
1. 一種具有如下結(jié)構(gòu)式的熒光示蹤化合物
2.一種用于篩選測(cè)試化合物的試驗(yàn)，其中所述試驗(yàn)為使用結(jié)合至hERG K+通道或其 片段的源的如權(quán)利要求1所述的熒光示蹤物或其藥物可接受的鹽的結(jié)合試驗(yàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試驗(yàn)，其中篩選測(cè)試化合物提供了該測(cè)試化合物延長(zhǎng)人類(lèi)心 電圖的Q-T間期并由此引起人類(lèi)受試者的心臟中毒或心律失常的傾向的指示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試驗(yàn)，其包括如下步驟a)在存在或不存在不同含量的測(cè)試化合物或測(cè)試化合物的混合物下在試驗(yàn)緩沖液中 培養(yǎng)熒光示蹤物或其鹽以及hERG K+通道或其片段的源；以及b)測(cè)量測(cè)試化合物或測(cè)試化合物的混合物對(duì)結(jié)合至hERGK+通道或其片段的熒光示蹤物的含量的影響。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試驗(yàn)，其中所述試驗(yàn)緩沖液為含有KC1、MgCl2* PLURONIC F-127 的 HEPES 基緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試驗(yàn)，其中所述試驗(yàn)緩沖液包含15mM至50mM的HEPES、 5mM 至 20mM 的 KC1、0.5mM 至 2mM 的 MgCl2,和 0.02 % 至約 0.1 % 的 PLURONIC F-127。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試驗(yàn)，其中所述試驗(yàn)緩沖液包含25mM的HEPES、15mM的 KCL ImM 的 MgCl2,禾Π 0.05%的 PLURONIC F—127。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試驗(yàn)，其中所述試驗(yàn)緩沖液在室溫下的pH為pH7.2至pH7.6。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試驗(yàn)，其中所述試驗(yàn)緩沖液為pH7.4。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試驗(yàn)，其中測(cè)試化合物或測(cè)試化合物的混合物的影響通過(guò) 熒光偏振測(cè)得。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試驗(yàn)，其中步驟b)包括如下步驟i)測(cè)定每個(gè)樣品的特定結(jié)合的熒光示蹤物；和ii)計(jì)算由測(cè)試化合物或測(cè)試化合物的混合物所抑制的熒光示蹤物結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試驗(yàn)，其中hERGK+通道或其片段的源選自i)源自細(xì)胞的膜制劑，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERGK+通道或其片段；ii)細(xì)胞，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERGK+通道或其片段；或iii)源自組織的膜制劑，在所述組織表面上表達(dá)hERGK+通道或其片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試驗(yàn)，其中hERGK+通道或其片段的源為源自細(xì)胞的膜 制劑，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERG K+通道或其片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗(yàn)，其中細(xì)胞表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總膜蛋白質(zhì) 的hERG K+通道。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗(yàn)，其中細(xì)胞表達(dá)hERG電流為約1500pA至約2500pA 的hERG K+通道，所述hERG電流通過(guò)使用完全自動(dòng)化的高通量膜片鉗體系的膜片鉗技 術(shù)測(cè)定。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗(yàn)，其中所述細(xì)胞為HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗(yàn)，其中所述細(xì)胞用選自如下的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染i)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有與SEQ ID NO 1或其片段至少80%同源的氨基酸序列；或ii)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有SEQ ID NO 1或其片段的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試驗(yàn)，其中所述核酸進(jìn)一步包含編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) 蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試驗(yàn)，其中編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)蛋白質(zhì)和CD-8細(xì)胞 質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列連續(xù)位于編碼hERG K+通道的核苷酸序列的下游。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試驗(yàn)，其中hERGK+通道的表達(dá)通過(guò)編碼內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(diǎn)蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
21.一種表征測(cè)試化合物作為hERG K+通道阻滯劑的活度的方法，所述方法包括如下 步驟a)在權(quán)利要求1的熒光示蹤物或其藥物可接受的鹽的存在下，在試驗(yàn)緩沖液中將測(cè) 試化合物與含有hERG K+通道的膜制劑接觸，所述hERG K+通道具有SEQ IDNO 1的 氨基酸序列，所述膜制劑源自用包含編碼hERG K+通道的核苷酸序列的核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞；b)監(jiān)測(cè)測(cè)試化合物是否影響熒光體示蹤物與含有hERGK+通道的膜制劑的結(jié)合；以及C)測(cè)定測(cè)試化合物的hERG K+通道阻滯劑活度。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中細(xì)胞表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總膜蛋白質(zhì) 的hERG K+通道。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中細(xì)胞表達(dá)hERG電流為約1500pA至約2500pA 的hERG K+通道，所述hERG電流通過(guò)使用完全自動(dòng)化的高通量膜片鉗體系的膜片鉗技 術(shù)測(cè)定。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述核酸表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點(diǎn)蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)蛋白質(zhì)和CD-8細(xì)胞 質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列連續(xù)位于編碼hERG K+通道的核苷酸序列的下游。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述核酸表達(dá)載體具有SEQID NO 2的核苷 酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中hERGK+通道的表達(dá)通過(guò)編碼內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(diǎn)蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述試驗(yàn)緩沖液包含25mM的HEPES、15mM 的 KC1、ImM 的 MgCl2,禾Π 0.05% 的 PLURONIC F—127。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述試驗(yàn)緩沖液在室溫下的ρΗ為ρΗ7.2至ρΗ7.6。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述試驗(yàn)緩沖液為ρΗ7.4。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中監(jiān)測(cè)測(cè)試化合物是否影響熒光體示蹤物與含有 hERG K+通道的膜制劑的結(jié)合通過(guò)熒光偏振進(jìn)行測(cè)量。
33.一種用于篩選測(cè)試化合物的試劑盒，所述試劑盒包含a)權(quán)利要求1所述的熒光示蹤物或其藥物可接受的鹽；b)hERG K+通道或其片段的源；和c)試驗(yàn)緩沖液。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述hERGK+通道或其片段的源為源自細(xì) 胞的膜制劑，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERG K+通道或其片段。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中細(xì)胞表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總膜蛋白 質(zhì)的hERG K+通道。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中細(xì)胞表達(dá)hERG電流為約1500pA至約2500pA的hERG K+通道，所述hERG電流通過(guò)使用完全自動(dòng)化的高通量膜片鉗體系的膜 片鉗技術(shù)測(cè)定。
37.根據(jù)扒利要求34所述的試劑盒，其中所述細(xì)胞為HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中所述細(xì)胞用具有SEQID NO 2的核苷酸序 列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中hERGK+通道的表達(dá)通過(guò)編碼內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點(diǎn)蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
40.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述試驗(yàn)緩沖液包含25mM的HEPES、 15mM 的 KC1、ImM 的 MgCl2,禾Π 0.05% 的 PLURONIC F-127。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的試劑盒，其中所述試驗(yàn)緩沖液在室溫下的ρΗ為ρΗ7.2至 ρΗ7.6。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述試驗(yàn)緩沖液為ρΗ7.4。
43.一種hERG K+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總 膜蛋白質(zhì)的hERG K+通道。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞表達(dá)hERG電 流為約1500pA至約2500pA的hERG K+通道，所述hERG電流通過(guò)使用完全自動(dòng)化的高 通量膜片鉗體系的膜片鉗技術(shù)測(cè)定。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞為HEK 293細(xì) 胞或CHO細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞用選自如下的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染i)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有與SEQ ID NO 1或其片段至少80%同源的氨基酸序列；或ii)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有SEQ ID NO 1或其片段的氨基酸序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述核酸進(jìn)一步包含編 碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)蛋白質(zhì)和CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列連續(xù)位于編碼hERG K+通道的核苷酸序列 的下游。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中hERG K+通道的表達(dá)通 過(guò)編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
50.一種制備具有結(jié)構(gòu)式⑴的熒光示蹤化合物的方法，
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于篩選測(cè)試化合物引起受試者心臟中毒的能力的試驗(yàn)、方法和試劑盒。特別地，本發(fā)明公開(kāi)了測(cè)試化合物是否具有延長(zhǎng)Q-T間期的效果，所述Q-T間期由人類(lèi)心電圖測(cè)得。本文公開(kāi)的試驗(yàn)、方法和試劑盒利用新型熒光示蹤物與hERG K+通道之間的結(jié)合相互作用，以及測(cè)試化合物影響所述結(jié)合相互作用的傾向。
文檔編號(hào)G01N33/58GK102016590SQ200980114211
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者D·派珀, K·沃格爾, M·S·謝卡哈尼, S·赫斯, S·達(dá)夫, T·利韋利, Z·鐘 申請(qǐng)人:生命技術(shù)公司