專利名稱：一種雙酚a的熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙酚A的一種熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法，屬于熒光偏振免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雙酚A(BispherK)I Α,ΒΡΑ)學(xué)名2，2_ 二(4_羥基苯基)丙烷，是從食品包裝材料中新發(fā)現(xiàn)的一種“破壞內(nèi)分泌化學(xué)物質(zhì)(Endocrine Disrupting Chemicals，EDC) ”。BPA是由苯酚、丙酮在酸性介質(zhì)中合成的，是重要的有機(jī)化工原料，主要用于制造高分子材料，在容器內(nèi)壁涂料、食品包裝材料等方面有著重要的用途。在生產(chǎn)和生活中，BPA可通過(guò)皮膚、呼吸道、消化道等途徑進(jìn)入人體，BPA對(duì)皮膚、呼吸道、消化道和角膜均有中等強(qiáng)度刺激性。人類主要通過(guò)食用含有BPA材料包裝的食物，使用嬰兒奶瓶，牙科填充物和密封罐等攝入BPA。 BPA在低劑量時(shí)即具有DNA氧化損傷作用。因此其食品包裝材料中的殘留也越來(lái)越引起了國(guó)內(nèi)外的重視。現(xiàn)有的這些儀器檢測(cè)法雖然有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但是樣品前處理復(fù)雜，所需的儀器昂貴，成本高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，因此有必要研究特異性強(qiáng)，靈敏度高同時(shí)價(jià)格低廉，能快速簡(jiǎn)便的免疫檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)展了對(duì)雙酚A免疫分析方法的研究。但目前為止，國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有運(yùn)用熒光偏振免疫分析技術(shù)檢測(cè)雙酚A的報(bào)道，為此設(shè)計(jì)合成了以雙酚A的類似物雙酚酸為半抗原合成了熒光素標(biāo)記物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)雙酚A殘留的熒光偏振免疫檢測(cè)方法，并且有較高的靈敏度和特異性。本發(fā)明的技術(shù)方案一種雙酚A的熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法，利用雙酚酸作為半抗原偶聯(lián)FITC熒光素衍生物合成熒光標(biāo)記物，并以雙酚A為標(biāo)準(zhǔn)品，用雙酚A多抗為抗體，建立雙酚A的熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法；步驟如下
(1)FITC熒光素衍生物EDF的制備
Φ分別量取200mg乙二胺鹽酸鹽，500 μ L三乙胺，溶解于50mL的甲醇中，得含乙二胺鹽酸鹽的三乙胺溶液；
(2)117mg的熒光素FITC，100 μ L的三乙胺，溶解于IOmL的甲醇中，得FITC溶液；
CD逐滴將FITC溶液滴加入含乙二胺鹽酸鹽的三乙胺溶液中；
④混合溶解，室溫避光下攪拌反應(yīng)10h，然后過(guò)濾分離出沉淀，干燥，得FITC熒光素衍
生物(EDF)，避光保存；
(2) EDF標(biāo)記物的制備N-羥基琥珀酰亞胺NHS 9. ang，二環(huán)己基碳二亞胺DCC16. %ig，和雙酚酸1. %ig，溶解于 2. OmL的DMF中，室溫下攪拌過(guò)夜；
向反應(yīng)溶液中加入FITC熒光素標(biāo)記物的衍生物EDF 2-3mg,室溫下避光攪拌反應(yīng)3h， 制得EDF標(biāo)記物；
(3)EDF標(biāo)記物的純化
以CHCl3/MeOH=l 1為展開(kāi)液，室溫下進(jìn)行薄層層析，分離純化EDF標(biāo)記物，紫外透射儀下觀察，選擇1=0. 56的條帶，用300 μ L甲醇萃取；
(4)EDF標(biāo)記物工作濃度的確定
用0. 025Μ、pH8. 0硼酸鹽緩沖液稀釋不同濃度的EDF標(biāo)記物，上偏振儀檢測(cè)偏振光強(qiáng)度，以10倍于空白溶液的偏振光強(qiáng)度作為其工作濃度；確定選取1:1500稀釋作為工作濃度；空白溶液選用0. 025Μ、pH8. 0硼酸鹽緩沖液；
(5)雙酚A多抗的工作濃度的確定
在每個(gè)試管中依次加入500 μ L用0. 025Μ、pH8. 0硼酸鹽緩沖液稀釋成不同稀釋濃度 1:200,1:400,1:800,1 1600，1 3200，1 6400，1 12800 的雙酚 A 多抗，并依次加入 500 μ L
的EDF標(biāo)記物，室溫下孵育5min，上偏振儀檢測(cè)偏振光值，確定選取1 800稀釋作為抗體的工作濃度；
(6)競(jìng)爭(zhēng)
雙酚A用超純水稀釋成1，5，25，125，625，3125，15625，78125ng/mL系列濃度分別加入不同的試管中，另設(shè)一個(gè)超純水空白對(duì)照，50μ L/管；然后向每個(gè)試管中加入500μ L稀釋1500倍的EDF標(biāo)記物，最后分別加入500 μ L稀釋800倍的雙酚A多抗于室溫下孵育 5min，上偏振儀檢測(cè)偏振光值；
(7)建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)抑制對(duì)數(shù)曲線將所測(cè)得的檢測(cè)偏振光值為縱坐標(biāo)，以雙酚A濃度為橫坐標(biāo)作圖建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)抑制對(duì)數(shù)曲線；
(8)實(shí)際樣品的檢測(cè)以實(shí)際樣品按步驟(6)的方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得的偏振光值以雙酚 A的標(biāo)準(zhǔn)抑制對(duì)數(shù)曲線對(duì)照，確定樣品的雙酚A殘留濃度。更詳細(xì)的步驟為 主要溶液配制
1)配制0. 025M、ρΗ8· 0硼酸鹽緩沖液
Na2B4O7 · IOH2O9. 534 g，加超純水稀釋至 980 mL，用 2M NaOH 調(diào)至 ρΗ8· 0，加超
純水定容至1000 mL。熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法的步驟如下
預(yù)先將雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)品配制成lmg/mL的甲醇溶液作為工作母液，在4°C保存待用。配制硼酸鹽緩沖液(0. 025mol/L、pH8. 0)，以此為基礎(chǔ)配制系列反應(yīng)液，用以稀釋熒光素標(biāo)記物和雙酚A多抗。a、熒光素標(biāo)記物工作濃度的確定稀釋不同濃度的熒光素標(biāo)記物，上機(jī)檢測(cè)偏振光強(qiáng)度，以10倍于空白溶液(0. 025M、pH8. 0硼酸鹽緩沖液)的偏振光強(qiáng)度作為其工作濃度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取1:5000作為工作濃度。b、雙酚A抗體的工作濃度的確定在每個(gè)試管中依次加入500yL用0. 025M、 PH8.0硼酸鹽緩沖液稀釋成不同稀釋濃度的雙酚A抗體(1:200，1:400，1:800，1:1600，
41 3200，1 6400，1 12800),并依次加入500 μ L的熒光素標(biāo)記物，室溫下孵育5min,上機(jī)檢測(cè)偏振光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取1:800作為抗體的工作濃度。C、競(jìng)爭(zhēng)
將雙酚A用超純水稀釋成1，5，25，125，625，3125，15625，78125ng/mL系列濃度分別加入不同的試管中，另設(shè)一個(gè)超純水空白對(duì)照，50 μ L/管。然后向每個(gè)試管中加入500μ L稀釋1500倍的熒光素標(biāo)記物，最后分別加入500 μ L稀釋800倍的雙酚A多抗，于室溫下孵育 5min。d、測(cè)定上機(jī)檢測(cè)偏振光值。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了雙酚A熒光偏振免疫檢測(cè)方法，為雙酚A殘留檢測(cè)提供了一種快速高效的檢測(cè)手段，由于采用的是多克隆抗體和便攜式的熒光偏振儀器， 費(fèi)用較低，快速，方便，可靠。靈敏度為2ng/mL，線性范圍為20-800ng/mL。免疫反應(yīng)的高特異性和高親和性使熒光偏振免疫具有極高的選擇性和靈敏性，樣本前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，操作方便，快速。


圖1用熒光偏振儀建立的雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)抑制對(duì)數(shù)曲線。 具體實(shí)施方案以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。一、儀器
KFLOff純水機(jī)，凱佛隆公司， AB104-N型電子分析天平， 便攜式熒光偏振儀，SENTARY 100， 可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司， 渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠。二、試劑
雙酚A多克隆抗體，實(shí)驗(yàn)室自制， 其他試劑均為分析純?cè)噭?。三、步驟
1. FITC熒光素衍生物(EDF)的制備，步驟如下
Φ分別量取200mg乙二胺鹽酸鹽，500 μ L三乙胺，溶解于50mL的甲醇中，得含乙二胺
鹽酸鹽的三乙胺溶液。
117mg的熒光素FITC，100 μ L的三乙胺，溶解于IOmL的甲醇中，得FITC溶液。@逐滴將FITC溶液滴加入含乙二胺鹽酸鹽的三乙胺溶液中。 混合溶解，室溫避光下攪拌反應(yīng)10h，然后過(guò)濾分離出沉淀，干燥，得FITC熒光素衍生物(EDF)，避光保存。2. EDF標(biāo)記物的制備，步驟如下
N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (9. 2mg, 80 μ mol)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (16. 4mg, 80 μ mol)，和雙酚酸(1. 4mg,4. 8 μ mol)溶解于2. OmL的DMF中。室溫下攪拌過(guò)夜。向反應(yīng)溶液中加入FITC熒光素標(biāo)記物的衍生物EDF2_3mg，室溫下避光攪拌反應(yīng)池，制得EDF標(biāo)記物。3、EDF標(biāo)記物的純化
以CHCl3/MeOH=l:l為展開(kāi)液，室溫下進(jìn)行薄層層析，分離純化EDF標(biāo)記物。紫外透射儀下觀察，選擇1=0. 56的條帶。用300 μ L甲醇萃取。4、EDF標(biāo)記物工作濃度的確定
用0. 025Μ、pH8. 0硼酸鹽緩沖液稀釋不同濃度的EDF標(biāo)記物，上機(jī)檢測(cè)偏振光強(qiáng)度，以 10倍于空白溶液(0. 025M、pH8. 0硼酸鹽緩沖液)的偏振光強(qiáng)度作為其工作濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取1:1500作為工作濃度。5、雙酚A抗體的工作濃度的確定
在每個(gè)試管中依次加入500 μ L用0. 025M、pH8. 0硼酸鹽緩沖液稀釋成不同稀釋濃度的雙酚 A 抗體(1:200,1:400,1:800,1 1600，1 3200，1 6400，1 12800),并依次加入 500 μ L 的EDF標(biāo)記物，室溫下孵育5min，上偏振儀檢測(cè)偏振光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取1 800作為抗體的工作濃度。6、競(jìng)爭(zhēng)
雙酚A用超純水稀釋成1，5，25，125，625，3125，15625，78125ng/mL系列濃度分別加入不同的試管中，另設(shè)一個(gè)超純水空白對(duì)照，50 μ L/管。然后向每個(gè)試管中加入500μ L稀釋1500倍的EDF標(biāo)記物，最后分別加入500 μ L稀釋800倍的雙酚A多抗于室溫下孵育 5min。上偏振儀檢測(cè)偏振光值。試驗(yàn)結(jié)果如下
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線本發(fā)明所獲得的抗體檢測(cè)的線性范圍是為20 800ng/mL。2、靈敏度靈敏度是所得90%最大偏振光值所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，即ICltl為 2ng/mL。
權(quán)利要求
1. 一種雙酚A的熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法，其特征在于利用雙酚酸作為半抗原偶聯(lián) FITC熒光素衍生物合成熒光標(biāo)記物，并以雙酚A為標(biāo)準(zhǔn)品，用雙酚A多抗為抗體，建立雙酚 A的熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法；步驟如下(1)FITC熒光素衍生物EDF的制備①分別量取200mg乙二胺鹽酸鹽，500μ L三乙胺，溶解于50mL的甲醇中，得含乙二胺鹽酸鹽的三乙胺溶液；②117mg的熒光素FITC，100μ L的三乙胺，溶解于IOmL的甲醇中，得FITC溶液；③逐滴將FITC溶液滴加入含乙二胺鹽酸鹽的三乙胺溶液中；④混合溶解，室溫避光下攪拌反應(yīng)10h，然后過(guò)濾分離出沉淀，干燥，得FITC熒光素衍生物EDF，避光保存；(2)EDF標(biāo)記物的制備N-羥基琥珀酰亞胺NHS 9. 2mg, 二環(huán)己基碳二亞胺DCC16. 4mg,和雙酚酸1. 4mg,溶解于 2. OmL的DMF中，室溫下攪拌過(guò)夜；向反應(yīng)溶液中加入FITC熒光素標(biāo)記物的衍生物EDF 2-3mg,室溫下避光攪拌反應(yīng)3h， 制得EDF標(biāo)記物；(3)EDF標(biāo)記物的純化以CHCl3/MeOH=l 1為展開(kāi)液，室溫下進(jìn)行薄層層析，分離純化EDF標(biāo)記物，紫外透射儀下觀察，選擇1=0. 56的條帶，用300 μ L甲醇萃??；(4)EDF標(biāo)記物工作濃度的確定用0. 025Μ、pH8. 0硼酸鹽緩沖液稀釋不同濃度的EDF標(biāo)記物，上偏振儀檢測(cè)偏振光強(qiáng)度，以10倍于空白溶液的偏振光強(qiáng)度作為其工作濃度；確定選取1:1500稀釋作為工作濃度；空白溶液選用0. 025Μ、pH8. 0硼酸鹽緩沖液；(5)雙酚A多抗的工作濃度的確定在每個(gè)試管中依次加入500 μ L用0. 025Μ、pH8. 0硼酸鹽緩沖液稀釋成不同稀釋濃度 1:200,1:400,1:800,1 1600，1 3200，1 6400，1 12800 的雙酚 A 多抗，并依次加入 500 μ L的EDF標(biāo)記物，室溫下孵育5min，上偏振儀檢測(cè)偏振光值，確定選取1 800稀釋作為抗體的工作濃度；(6)競(jìng)爭(zhēng)雙酚A用超純水稀釋成1，5，25，125，625，3125，15625，78125ng/mL系列濃度分別加入不同的試管中，另設(shè)一個(gè)超純水空白對(duì)照，50 μ L/管；然后向每個(gè)試管中加入500 μ L稀釋 1500倍的EDF標(biāo)記物，最后分別加入500 μ L稀釋800倍的雙酚A多抗于室溫下孵育5min， 上偏振儀檢測(cè)偏振光值；(7)建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)抑制對(duì)數(shù)曲線將所測(cè)得的檢測(cè)偏振光值為縱坐標(biāo)，以雙酚A濃度為橫坐標(biāo)作圖建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)抑制對(duì)數(shù)曲線；(8)實(shí)際樣品的檢測(cè)以實(shí)際樣品按步驟(6)的方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得的偏振光值以雙酚 A的標(biāo)準(zhǔn)抑制對(duì)數(shù)曲線對(duì)照，確定樣品的雙酚A殘留濃度。
全文摘要
一種雙酚A的熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法，屬于熒光偏振免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用雙酚酸作為半抗原偶聯(lián)FITC熒光素衍生物，合成熒光標(biāo)記物，并以雙酚A為標(biāo)準(zhǔn)品，雙酚A多抗為抗體，建立了雙酚A的熒光偏振免疫分析方法。本發(fā)明建立了雙酚A的熒光偏振免疫分析方法，為雙酚A的殘留檢測(cè)提供了一種快速高效的檢測(cè)方法。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、快速、成本低，結(jié)果可靠。靈敏度為2ng/mL，線性范圍為20～800ng/mL。免疫反應(yīng)的高特異性和親和性使熒光偏振免疫分析方法具有極高的選擇性和靈敏度。
文檔編號(hào)G01N33/536GK102175846SQ20101060467
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者吳曉玲, 彭池方, 李灼坤, 王利兵, 胥傳來(lái), 馬偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)