專利名稱：測(cè)定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定蛋白酶活力的方法，具體地說(shuō)是一種測(cè)定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋 白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法。
背景技術(shù)：
糜蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶主要提取于動(dòng)物胰臟，胃蛋白酶存在于胃液中。這4 種酶的制劑片劑、膠囊、注射用凍干粉、顆粒沖劑等在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。糜蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，專一水解羧端芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、亮氨酸)或側(cè) 鍵大體積疏水性殘基甲硫氨酸等5它可以分解炎癥部位纖維蛋白的凝結(jié)物，促進(jìn)血凝塊、膿性 分泌物及壞死組織的溶化分解,從而凈化創(chuàng)面，使肉芽組織新生,促進(jìn)傷口愈合等，在治療鼻黏 膜糜爛、痤瘡、潰瘍性直腸炎、胃石、甲狀腺瘤、重癥肺炎、結(jié)核性膿胸等疾病中有一定作 用。據(jù)報(bào)道,該酶在眼科、皮膚科中的臨床應(yīng)用已被肯定。胰蛋白酶作用與糜蛋白酶類似，主要有消化食物、消炎等作用，對(duì)消化道疾病、肝炎、 膽囊炎等有較好的治療效果。此外，直接注射胰蛋白酶還可作為毒蛇咬傷的急救手段。糜蛋 白酶-胰蛋白酶聯(lián)用處理燒傷皮膚有良好的效果。彈性蛋白酶可以水解不溶性彈性硬蛋白，臨床上主要用于防治II型和IV型高血脂癥、動(dòng) 脈粥樣硬化、脂肪肝等。其濃度還可以作為臨床診斷的指標(biāo)，如過(guò)敏鼻炎、遺傳的過(guò)敏性支 氣管炎、皮炎患者血漿中的彈性蛋白酶含量明顯高于正常人。胃蛋白酶目前主要作為助消化類藥物應(yīng)用。目前，這4種動(dòng)物蛋白酶活'力的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法、渾濁度法、比色法、 熒光法、酶聯(lián)法、免疫法、氣壓法、電分析法等。紫外分光光度法所需儀器簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)單， 但靈敏度低，重現(xiàn)性差。用對(duì)苯甲磺?；彼峒柞プ龅孜铮忉尫懦鰧?duì)苯甲磺?；彼崤cNaOH反應(yīng)使得pH值降低，用苯酚紅做指示劑，采用比色法測(cè)定胰蛋白酶的線性范圍 為0.00535 1.605 U/mL。該法操作簡(jiǎn)單，但由于在實(shí)驗(yàn)條件下酶自身帶正電而消耗部分 NaOH，所以精確度不高，結(jié)果往往不夠準(zhǔn)確。用熒光素標(biāo)記牛血清白蛋白做底物可檢測(cè)到 0.35嗎ml—1的胰蛋白酶。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記紅桂木凝集素,通過(guò)夾心酶聯(lián)法能檢測(cè)到胃蛋 白酶的范圍為0.05ng/mL 3.5yg/mL。此法成本高且步驟煩瑣，不易操作。免疫法的靈敏度 較高，有報(bào)導(dǎo)用免疫法能檢測(cè)到0.9 ng/mL的彈性蛋白酶，但其成本也高，所需試劑要求較 高，且需要一定的操作技術(shù)。因此，建立簡(jiǎn)便、靈敏、試劑易得的酶活力的分析方法具有重要的意義。通過(guò)檢索，未見(jiàn)糜蛋a酶等酶活力的催化共振散射光譜法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而公開(kāi)一種操作簡(jiǎn)便、快速、且靈敏度高、 成本低的測(cè)定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法。 本發(fā)明利用共振散射光譜技術(shù)的靈敏性和酶催化的專一性將酶催化反應(yīng)與共振散射光譜結(jié)合，以酪蛋白為底物，分別加入各酶催化，用三氯乙酸(TCA)終止酶催化反應(yīng)并與剩余底 物相互作用形成締合微粒使得共振散射強(qiáng)度急劇加強(qiáng)，由于通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)糜蛋白酶、胰蛋白 酶、彈性蛋白酶及胃蛋白酶體系均在470nm處有最強(qiáng)共振散射峰，且共振散射強(qiáng)度在一定范 圍內(nèi)各酶濃度均呈線性關(guān)系，據(jù)此建立了一個(gè)靈敏度高、選擇性好的測(cè)定糜蛋白酶、胰蛋白 酶、彈性蛋白酶及胃蛋白酶活力的共振散射光譜法。一種測(cè)定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法包括 如下步驟一、 用己知酶活力單位的各酶制備測(cè)試體系，并測(cè)定各酶體系的散射光強(qiáng)度I;1. 在各具塞刻度試管中，依次加入0.09 0.10 mg/mL酪蛋白置于50'C水浴鍋中預(yù)熱10 min，取出分別加入適量上述各蛋白酶，用對(duì)應(yīng)的緩沖液(其中胰蛋白酶或糜蛋白酶或彈性蛋 白酶分別用pH 8.0、 7.5、 8.0的0.2 mol/LNa2HP04- KH2P04緩沖液，胃蛋白酶用0.1 mol/LpH 1.65甘氨酸-NaCI-HCl緩沖液)稀釋至一定體積，搖勻并立即開(kāi)始計(jì)時(shí)放回水浴鍋中反應(yīng)， 其中糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶溫育60 65 min，彈性蛋白酶溫育30 35 min;2. 反應(yīng)時(shí)間到后，取出分別依次加入0.5 0.6mol/LTCA，用二次蒸餾水定容至5.0mL， 搖勻，放置10 30min;3. 用熒光分光光度計(jì)同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(A em—入ex=0 nm)得到體系的RSS光譜。 在360 nm或400 nm或420 nm或470 nm或520 nm處測(cè)定體系的散射光強(qiáng)度I;二、 用步驟一的方法制備上述各酶的試劑空白體系，并測(cè)定各酶的試劑空白Io;三、 計(jì)算各酶的A卜I一Io;四、 以加入的酶的濃度C為橫坐標(biāo)，AI為縱坐標(biāo)，繪制各酶工作曲線；五、 用步驟一的方法制備檢測(cè)體系，其中加入的是未知濃度的待測(cè)樣品，測(cè)定各樣品的△I;六、 根據(jù)工作曲線，即可求得某檢測(cè)樣品中待測(cè)酶在一定線性范圍內(nèi)的濃度。 步驟一所述的具塞刻度試管依次加入的酪蛋白最佳濃度為O.IO mg/mL，用對(duì)應(yīng)的緩沖溶液稀釋至5.0mL，最佳溫育時(shí)間糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶為60min，彈性蛋白酶為30 min;所述的TCA的最佳濃度為0.5 mol/L;定容體積為5.0 mL，搖勻，最佳放置時(shí)間為10 min; 所述的同步共振散射最佳測(cè)定波長(zhǎng)為470 nm。本方法的原理是酪蛋白、蛋白酶的水溶性好，與水之間的界面不明晰，故其共振散射 強(qiáng)度Irs很弱。當(dāng)溶液中的pH值小于酪蛋白的等電點(diǎn)(pl=4.6),酪蛋白肽鏈上的氨基酸殘基 C-末端質(zhì)子化而使該蛋白質(zhì)帶正龜荷。三氯乙酸(TCA)中羧基帶負(fù)電荷，通過(guò)靜電引力形 成疏水性的酪蛋白一TCAn締合物。酪蛋白一TCAn締合物之間存在較強(qiáng)的疏水作用力、范德 華力和氫鍵，可進(jìn)一步聚集形成平均粒徑較大的(酪蛋白-TCAnV締合微粒，粒徑增大且有明 晰的固液界面，故體系的lRs顯著增強(qiáng)(圖l),其平均粒徑為1740nm (圖2， a)。在一定條件下，痕量蛋白酶強(qiáng)烈催化水解酪蛋白生成小分子多肽和氨基酸。加入TCA后，TCA既可 中止酶催化反應(yīng)，又作為酪蛋白的共振散射光測(cè)量試劑。隨著蛋白酶量的增加，剩余酪蛋白 減少，體系的Ins線性降低，微粒的粒徑也有所降低(圖2， b、 c、 d)。酶的含量即可由酶活 力濃度——共振散射校正值曲線算出?；诖?，建立了一種測(cè)定動(dòng)物蛋白酶活力的RSS新方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是-(1) 設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，只需要熒光分光光度計(jì)即可完成；(2) 所用試劑酪蛋白，緩沖溶液容易獲得，成本低廉，無(wú)毒環(huán)保；(3) 本發(fā)明方法將酶催化反應(yīng)與共振散射光譜結(jié)合起來(lái)，分析靈敏度高，選擇性好，由 表1可見(jiàn)，糜蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶及胃蛋白酶活力檢出限分別為0.00115 U/mL、 0.000839 U/mL、 0.000156 U/ml^、 0.000557 U/mL,由表2可見(jiàn),一些常見(jiàn)的氨基酸、維生素 和部分離子對(duì)反應(yīng)的測(cè)定干擾不大。(4) 操作簡(jiǎn)便，普通實(shí)驗(yàn)室分析人員在實(shí)驗(yàn)室即可實(shí)現(xiàn)。


圖1為本發(fā)明檢測(cè)方法原理圖；圖2為本發(fā)明糜蛋白酶-酪蛋白-TCA體系的締合微粒的粒徑分布圖； 其中a: pH7. 5， 0.1 mg/mL酪蛋白-O. 5 mol/L TCA; b: pH7. 5， a-O. 024 U/mL糜蛋白酶; c: pH7. 5， a-0. 045 U/mL糜蛋白酶;d: pH7. 5, a-O. 06 U/mL糜蛋白酶。 圖3為本發(fā)明糜蛋白酶-酪蛋白-TCA體系的共振散射光譜； 其中a: pH7. 5，0. 1 mg/mL酪蛋白-0. 5mol/LTCA; b: a-0. 024U/mL糜蛋白酶；c:a-O. 045 U/mL糜蛋白酶；d: a-0. 06 U/mL糜蛋白酶；e:pH7.5,0. 1 mg/mL酪蛋白，低靈敏度擋；縱 坐標(biāo)=2。圖4為本發(fā)明實(shí)施例樣品測(cè)定結(jié)果與分光光度法測(cè)定結(jié)果的回歸分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述 實(shí)施例試劑40U/mg胰蛋白酶(中國(guó)科學(xué)院新疆理化所)，其酶活力單位定義為在pH7.5，40 。C反應(yīng)30分鐘條件下,每分鐘水解酪蛋白生成三氯醋酸不沉淀物(肽及氨基酸等)在275 mn 波長(zhǎng)處與lumol/L酪氨酸相當(dāng)?shù)拿噶浚瑸?個(gè)活力單位。1500'U/mg糜蛋白酶(上海阿敏 生物技術(shù)公司)，其酶活力單位定義為25。C時(shí)，糜蛋白酶水解N—乙酰一L一酪氨酸乙酯， 采用連續(xù)讀數(shù)法，吸收度每分鐘改變0.0075，即相當(dāng)于l個(gè)糜蛋白酶單位。30U/mg胃蛋白 酶(北京麒麟宏偉科技有限公司)，其酶活力單位定義為在指定條件下，以血紅蛋白為底物， 37i:反應(yīng)10分鐘，每分鐘能催化水解血紅蛋白生成1 Pmol酪氨酸的酶量，為一個(gè)蛋白酶 活力單位。40U/rag彈性蛋白酶(上海阿敏生物技術(shù)有限公司)，其酶活力單位定義為在指定條件下，每20分鐘水解剛果紅彈性蛋白1 mg所需酶量定義為l個(gè)彈性酶活力單位。注射 用糜蛋白酶(4000 U/瓶，上海第一生化藥業(yè)有限公司)，三氯乙酸，0.2 mol/L Na2HP04-NaH2P04緩沖液，0.1 mol/L甘氨酸-NaCl-HCl緩沖液。10mg/mL酪蛋白溶液取酪蛋白1.0g,加0.05rnol/LNa2HPO4溶液50mL，置沸水浴中加熱 30min，攪拌，取出冷至室溫，用0.05moI/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5土0.1，同時(shí)迅速攪拌， 以防止酪蛋白沉淀，用水定容至100mL (臨用新配)。酶液分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg各種蛋白酶，胰蛋白酶或糜蛋白酶或彈性蛋白酶分別用pH 8.0、 7.5 、 8.0 0.2 mol/L Na2HP04- KH2P04緩沖液溶解，胃蛋白酶用0.1 mol/L pH 1.65甘氨酸 -NaCl-HCl緩沖液溶解，然后定容至50mL制成0.2mg/mL儲(chǔ)備液，臨用時(shí)用對(duì)應(yīng)緩沖液稀 釋至所需濃度。所用試劑為分析純，所用水均為二次蒸餾水。測(cè)定上述各酶活力的方法，步驟為一、 制備己知酶活力單位的各酶的測(cè)試體系1、 在各5mL具塞比色管中，分別依次加入0.50mL1.0mg/mL酪蛋白置5(TC水浴鍋(紹 興縣醫(yī)療器械廠)中預(yù)熱lOmin，取出分別加入適量各蛋白酶，用對(duì)應(yīng)的緩沖液稀釋至1.0 mL， 搖勻并立即開(kāi)始計(jì)時(shí)放回水浴鍋中反應(yīng)，其中糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶溫育60min, 彈性蛋白酶溫育30min;2、 取出后依次加入1.0 mL2.5 mol/LTCA，用二次蒸餾水定容至5.0mL，搖勻，放置10 min;3、 用RF-540型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(A em- A ex=0 nm)得到體系的RSS光譜。在470 nm處測(cè)定體系的散射光強(qiáng)度I47Gnm;二、 依據(jù)步驟一的方法制備各酶的試劑空白體系求得試劑空白I(j;三、 計(jì)算AI 470nm =丄470腦 -Io值；四、 以加入的酶的濃度c為橫坐標(biāo)，AI為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線；五、 依據(jù)步驟一的方法，制備各酶的檢測(cè)體系測(cè)定各酶的AI;六、 根據(jù)工作曲線，求得各酶的活力，見(jiàn)表l;本發(fā)明實(shí)施例共存物質(zhì)對(duì)糜蛋白酶測(cè)定 體系的影響見(jiàn)表2。為了證明本發(fā)明方法的可靠性，我們還特地用注射用糜蛋白酶凍干粉為樣品檢驗(yàn)試劑， 用本發(fā)明方法與分光光度法分別多次測(cè)定，并與廠家標(biāo)出的活力單位的相對(duì)比；用I.OmLpH 7.5 0.2 mol/L Na2HP04- NaH2P04緩沖液溶解注射用糜蛋白酶凍干粉,再用此緩沖液稀釋2000 倍，按本發(fā)明方法，根據(jù)工作曲線，測(cè)定溶液中糜蛋白酶活力，同時(shí)參考文獻(xiàn)(Vandermeers A.， Vandermeers-Piret M. C., Rath J., Christophe J. Simple automated spectrophotometric method for assay of trypsin and chymotrypsin in duodenal juice [J]. Clin Chem.1972,18(12): 1514-1517.)用分 光光度法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以每瓶?jī)?nèi)凍干粉總活力表示，結(jié)果見(jiàn)表3。兩種方法的回歸分 析結(jié)果(圖4)表明，兩種方法所測(cè)結(jié)果基本一致；且與出廠所標(biāo)示活力也基本一致(4000U)。參照?qǐng)D3，圖3中的e表明，沒(méi)有TCA存在時(shí)，因酪蛋白水溶性好，其界面不清晰，故 其共振散射信號(hào)均很微弱。圖3中的a表明酪蛋白-蛋白酶體系的共振散射信號(hào)亦很微弱。酪 蛋白可與TCA反應(yīng)形成白色締合物微粒，體系存在明顯的固液界面，故其共振散射信號(hào)顯著 增強(qiáng)。圖3中的b、 c、 d表明糜蛋白酶-酪蛋白-TCA微粒體系的共振散射光譜輪廓與酪蛋白 陽(yáng)TCA微粒體系的相似，均在360nm、 400 nm、 420 nm、 470 nm、 520 nm處產(chǎn)生5個(gè)共振散 射峰，最強(qiáng)峰均位于470nm處。故本方法的最佳共振散射測(cè)定波長(zhǎng)為470 nm。以酶活力濃 度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Al470皿為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表l檢測(cè)體系回歸方程 U/mL線性范圍相關(guān)系數(shù)檢出限(3o/K) U/mL胰蛋白酶△ =702.98C士3. 820.00024-0. 04 U/mL (6-1000 ng/mL)0.99770.000839糜蛋白酶Al條f576. 53C+4. 580. 0012 0. 06 U/mL 0.8-40 ng/mL)0.99570.00115彈性蛋白酶△ I47。 =4908. 4C+5. 870. 0002 0. 006 U/mL (5-150 ng/mL0. 99740.000156胃蛋白酶△ :U =1059C+7. 670.0006-0. 024 U/mL (0. 02-0. 8 li g/mL)0.99820.000557表2共存物質(zhì)允許量 相對(duì)誤差共存物質(zhì)允許量相對(duì)誤差(ug/mL ) (%) (ug/mL ) (%)L-賴氨酸183. 5L-谷氨酸3-4.9DL-甲硫氨酸68.5煙酸301. 2天冬氨酸127.4L-胱氨酸44.4甘氨酸183.5L-酪氨酸605.9DL-色氨酸205.4L-精氨酸4-3. 2葉酸16,5維生素K387.2維生素C8一4. 7維生素Bfi 100 6.9維生素B, 20 5.3維生素B2 4 -2.8Mg2+， CI— 36 -4.3Na', I03— 23 7.5Ca2 CV 4.4 7.3Mg2+， SO/ 754 2.3o o oo o o 2A A萄糖素m M葡庶尿<formula>formula see original document page 8</formula>
權(quán)利要求
1、測(cè)定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法，其特征是檢測(cè)方法包括如下步驟(1)制備已知酶活力單位的各酶的測(cè)試體系①具塞刻度試管中，依次加入0.09～0.10mg/mL酪蛋白置于50℃水浴鍋中預(yù)熱10min，取出加入適量上述各蛋白酶，用對(duì)應(yīng)的緩沖液(其中胰蛋白酶或糜蛋白酶或彈性蛋白酶分別用pH 8.0、7.5、8.0的0.2mol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，胃蛋白酶用0.1mol/L pH 1.65甘氨酸-NaCl-HCl緩沖液)稀釋至一定體積，搖勻并立即開(kāi)始計(jì)時(shí)放回水浴鍋中反應(yīng)，其中糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶溫育60～65min，彈性蛋白酶溫育30～35min；②反應(yīng)時(shí)間到后，取出依次加入0.5～0.6mol/LTCA，用二次蒸餾水定容至5.0mL，搖勻，放置10～30min；③用熒光分光光度計(jì)同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(λem-λex＝0nm)得到體系的RSS光譜，在360nm或400nm或420nm或470nm或520nm處測(cè)定體系的散射光強(qiáng)度I；(2)用步驟一的方法制備上述各酶的試劑空白體系，并測(cè)定各酶的試劑空白IO；(3)計(jì)算各酶的ΔI＝I-IO；(4)以加入的酶的濃度c為橫坐標(biāo)，ΔI為縱坐標(biāo)，繪制各酶工作曲線；(5)用步驟一的方法制備檢測(cè)體系，其中加入的是未知濃度的待測(cè)樣品，測(cè)定各樣品的ΔI；(6)根據(jù)工作曲線，即可求得某檢測(cè)樣品中待測(cè)酶在一定線性范圍內(nèi)的濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是所述的加入的酪蛋白的最佳濃度為0.1mg/ml，用對(duì)應(yīng)的緩沖溶液稀釋至5.0ml，溫育的最佳時(shí)間糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶 為60min，彈性蛋白酶為30min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的測(cè)定方法，其特征是所述的TCA的最佳濃度為0.5 mol/L， 定容體積為5ml，最佳放置時(shí)間為10min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是所述的同步共振散射，最佳測(cè)定波長(zhǎng) 為470nm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法，本發(fā)明以酪蛋白為底物，分別加入各酶催化，用三氯乙酸終止酶催化反應(yīng)并與剩余底物相互作用形成締合微粒使得共振散射強(qiáng)度急劇加強(qiáng)，據(jù)此建立了一個(gè)測(cè)定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法，酶活力濃度——共振散射校正值曲線算出。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于與現(xiàn)有的方法相比，本方法將酶催化反應(yīng)與共振散射光譜結(jié)合起來(lái)，分析靈敏度高，選擇性好，檢測(cè)限低，操作簡(jiǎn)便，并且所用試劑無(wú)毒安全。
文檔編號(hào)G01N21/65GK101226150SQ200810073469
公開(kāi)日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2008年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者廖獻(xiàn)就, 李紀(jì)順, 溫桂清, 蔣治良, 黃國(guó)霞 申請(qǐng)人:廣西師范大學(xué)