專利名稱：：前列腺癌的檢測的制作方法前列腺癌的檢測
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及與其他診斷方法以及供這些方法使用的試劑盒相一致的甲基化基因的檢查。在高等真核細(xì)胞中，DNA僅在CpG二核苷酸中的位于鳥嘌呤5'位置的胞嘧啶處甲基化。這一修飾在基因表達(dá)上具有重要的調(diào)節(jié)效果，尤其是當(dāng)它涉及位于基因啟動子區(qū)域的富含CpG的區(qū)域(CpG島)時(shí)。正常的未甲基化CpG島的異常甲基化是永生化細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的常見事件，并與特定腫瘤抑制基因或其他與一些人體癌癥的改善有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄失活相聯(lián)系。最近公開了許多潛在的甲基化標(biāo)記物。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是示例性的蛋白質(zhì)，其中表達(dá)它們的基因的甲基化狀態(tài)對前列腺癌有重要的預(yù)后和診斷價(jià)值。所述蛋白質(zhì)通過使具有化學(xué)反應(yīng)性的親電子試劑與谷胱甘肽綴合來催化細(xì)胞內(nèi)解毒反應(yīng)，包括使親電子性的致癌物質(zhì)失活(C.B.Pickett等人，An皿.Rev.Blocbern.，58:743，1989;B.Coles等人，CRCCrit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，25:47，1990;T.H.Rushmore等人，J.Biol.Chem.268:11475,1993)。由在不同基因座的幾個(gè)不同基因編碼的人類GST已被分為四個(gè)不同的家族，稱作a、y、ji禾Pe(B.Mannervik，etal.，Biochem.J.，282:305,1992)。由夕卜遺傳(印igenetic)改變導(dǎo)致的GSTP1表達(dá)的降低常與前列腺癌與肝癌有關(guān)。S100蛋白是鈣-結(jié)合蛋白，除了他以外，該蛋白與腫瘤發(fā)生(t咖erigenesis)有關(guān)。所述家族包括S100A2、S100A4、S100A5、S100A6、S100A8、S100A9和S100A11，雖然它們起到的確切作用還并不清楚，但其全部顯示與腫瘤的發(fā)展具有某些關(guān)系。S100A6(結(jié)合蛋白)的表達(dá)似乎能夠降低前列腺癌的發(fā)展。已經(jīng)顯示S100A2在乳腺癌、肺癌以及前列腺癌中呈現(xiàn)出減少的表達(dá)。據(jù)信這是由于基因啟動子的超甲基化，但是實(shí)際情況并不清楚，因?yàn)樵诜菒盒郧傲邢偕掀ぜ?xì)胞和BPH中也發(fā)現(xiàn)了超甲基化作用。在外遺傳檢測(印igenetictesting)中，樣品和樣品的制備是重要因素。每一個(gè)樣品源都具有其問題(issues)。甚至直接從患病組織取得的活體檢查樣品也已知可能由于患病細(xì)胞的不均勻分步而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。尿是合意的樣品，因?yàn)樗墨@得比其他可能樣品的獲得具有更少的侵入性。排入尿中的前列腺癌細(xì)胞的數(shù)目和濃度是非常易改變的，其取決于很多因素例如收集尿的時(shí)間、其是否是按照前列腺按摩法收集的、以及核酸酶的存在和作用以及用于使它們的作用最小化的試劑和方法。雖然一些人建議用尿樣品進(jìn)行前列腺癌檢測，但實(shí)際上進(jìn)行這樣的檢測已經(jīng)被證明是困難的。首先，這樣的檢測的基礎(chǔ)是假定癌細(xì)胞會從腫瘤或損傷部位脫落到泌尿系統(tǒng)中。實(shí)際上對這一過程的了解很少。并且似乎分析物濃度的變化可能會比其他樣品例如組織活體檢查甚至血清樣品中的濃度變化更加顯著，這取決于各種各樣的生理和環(huán)境因素例如患者被水合的程度?？紤]到核酸酶和各種其他物質(zhì)的存在會影響核酸，所以對分析物在基質(zhì)中的穩(wěn)定性也沒有很好的了解。供許多其他尿檢測用的樣品的制備使用的是被稱為沉積物的旋轉(zhuǎn)沉淀樣品。這種方法是否對甲基化標(biāo)記物具有意義是不能夠演繹推測的。對患者的準(zhǔn)備工作和可選的預(yù)處理也不是很了解。直腸指檢(DRE)是用于確定前列腺健康的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，在該方法中治療醫(yī)師會注意解剖學(xué)異常。過去，將用DRE結(jié)果來決定是否需要進(jìn)行活體檢查或者其他診斷或治療方法。所述方法例如DRE或相關(guān)的前列腺按摩是否會引起細(xì)胞脫落以便于在后續(xù)的診斷方法中能夠檢測到這些細(xì)胞以及脫落到什么程度是不清楚的。在程序上，DRE和手指直腸按摩法以及進(jìn)行這些方法的時(shí)機(jī)存在很大的不同，這些也被加入到該領(lǐng)域內(nèi)未知事物的目錄中。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個(gè)方面是用于在患者中表征前列腺癌的方法，所述方法包括在收集尿三天內(nèi)檢測尿中的GSTP1甲基化和一種或多種參照基因。如果GSTP1的甲基化程度超過了預(yù)先確定的值則認(rèn)為檢測對前列腺癌是陽性的，如果沒有超過預(yù)先確定的值則認(rèn)為其對前列腺癌是陰性的。本發(fā)明的另一方面是用于在患者中表征前列腺癌的方法，所述方法包括在收集尿三天內(nèi)檢測尿中的GSTP1甲基化、一種或多種參照基因和S100基因。通過對GSTP1甲基化檢測值和S100甲基化檢測值進(jìn)行比較來確定GSTP1的標(biāo)準(zhǔn)化值。如果標(biāo)準(zhǔn)化后的甲基化檢測值超過了預(yù)先確定的值則認(rèn)為檢測對前列腺癌是陽性的，如果沒有超過預(yù)先確定的值則認(rèn)為其對前列腺癌是陰性的。本發(fā)明的又一方面是用于在患者中表征前列腺癌的方法，所述方法包括作為嵌套式PCR反應(yīng)進(jìn)行的檢測GSTP1甲基化和一種或多種參照基因。如果GSTP1的甲基化程度超過了預(yù)先確定的值則認(rèn)為檢測對前列腺癌是陽性的，如果沒有超過預(yù)先確定的值則認(rèn)為其對前列腺癌是陰性的。在本發(fā)明的又一方面中，檢測了以下基因組合的甲基化a.GSTPl，APC。b.GSTP1，APC，S100A2。c.GSTP1，RARP2。d.GSTP1，RARP2，S100A2。所述基因組合中還可以包括參照基因。在本發(fā)明的又一方面中，甲基化狀態(tài)是通過實(shí)時(shí)定量PCR確定的。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明是用于檢測甲基化核酸的試劑盒。所述試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)容器；第一容器含有用于修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑，第二容器含有用于啟動含CpG的核酸擴(kuò)增的試劑，其中，所述試劑能區(qū)分修飾的甲基化核酸和未甲基化的核酸。所述試劑盒含有對被懷疑患有前列腺癌的患者進(jìn)行分析的說明書。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，試劑盒包括具有分隔的部件的反應(yīng)容器，引物最初儲存在分隔的部件中，并且其中在試劑盒的使用期間，引物按照一定的順序流入反應(yīng)室以便能夠適當(dāng)?shù)卦u估甲基化狀態(tài)。所述引物能夠用于實(shí)施嵌套式擴(kuò)增反應(yīng)。發(fā)明詳述本發(fā)明的基于尿的檢測優(yōu)選在已經(jīng)進(jìn)行了PSA檢測且結(jié)果不明確或難以確定(最優(yōu)選2.5-4.Ong/ml)的患者上進(jìn)行。用本發(fā)明檢測的陰性結(jié)果(在沒有其他臨床癥狀時(shí))能夠使患者免于進(jìn)行更具侵入性的檢測例如用活體檢查方法進(jìn)行的檢測。因此，從范圍最廣的方面來看，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法包括首先在患者中進(jìn)行PSA檢測，接著再對那些所測得的PSA水平為2.5-4.Ong/ml的患者進(jìn)行下面更詳細(xì)描述的檢測。本發(fā)明的檢測能夠檢出與特定基因相對應(yīng)的核酸的超甲基化，其中所述特定基因的甲基化狀態(tài)與前列腺癌相關(guān)。當(dāng)某基因的甲基化狀態(tài)提供關(guān)于前列腺癌的信息時(shí)，核酸對應(yīng)于其甲基化狀態(tài)與前列腺癌相關(guān)的該基因，并且所述序列是該基因的編碼段或其補(bǔ)體、該基因的典型段或其補(bǔ)體、該基因的啟動子或調(diào)控序列或其補(bǔ)體、表示該基因存在的序列或其補(bǔ)體、或該基因的全長序列或其補(bǔ)體。這樣的核酸在本說明書中稱為標(biāo)志(Markers)。標(biāo)志僅對應(yīng)于下列基因GSTP1(Seq.IDNo.17)、APC(啟動子二Seq.IDNo.18，基因二Seq.IDNo.19)、RARP2(Seq.IDNo.20)、S100A2(Seq.IDNo.21)。其他所關(guān)注的序列包括可用作檢測參照的組成型基因，例如P-肌動蛋白(Seq.IDNo.22和23)和PTGS2(啟動子=Seq.IDNo.24，基因=Seq.IDNo.25)。檢測超甲基化的試驗(yàn)包括諸如MSP和限制性內(nèi)切核酸酶分析的技術(shù)。啟動子區(qū)域是用于檢測這樣的超甲基化分析的特別顯著的目標(biāo)。對GSTP1的啟動子區(qū)域的序列分析顯示近72%的核苷酸是CG，約10X是CpG雙核苷酸。本發(fā)明包括測定尿或尿道沖洗物中的標(biāo)志的一定區(qū)域的甲基化狀態(tài)，其中與前列腺癌相關(guān)的DNA被擴(kuò)增和檢測。因?yàn)橛脴?biāo)志編碼的蛋白水平降低(g卩，較少轉(zhuǎn)錄)通常是由于特定區(qū)域如啟動子的超甲基化所導(dǎo)致的，所以希望能夠判斷所述區(qū)域是否被超甲基化。這在GSTP1基因的情況中以及在發(fā)明概述部分顯示的基因組合中是最有可能得到證實(shí)的。使用對于一定標(biāo)志區(qū)域有特異性的核酸探針或報(bào)道基因來檢測標(biāo)志基因的甲基化區(qū)域的存在。超甲基化區(qū)域是與正常組織相比在疾病組織的樣品中被甲基化到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著程度的區(qū)域。如上面所指出的，本發(fā)明的測定是用尿作為基質(zhì)進(jìn)行的。最優(yōu)選地，所述尿是在前列腺按摩后收集的，并儲存在4t:直至其沉積。最優(yōu)選其在4小時(shí)內(nèi)旋轉(zhuǎn)沉淀。前列腺按摩，當(dāng)與本發(fā)明的甲基化分析一起進(jìn)行時(shí)，最好如下進(jìn)行緊緊地壓迫腺體使其足以壓低每個(gè)葉的從底部到頂部以及從側(cè)線到中線的表面以確保能夠排出足夠數(shù)目的前列腺細(xì)胞。最優(yōu)選該按摩進(jìn)行20秒或更短的時(shí)間。將本發(fā)明的引物/探針或報(bào)道基因試劑中的一些用于檢測標(biāo)志基因的表達(dá)控制序列的甲基化。這些是調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄，并在一些情況中是調(diào)節(jié)核酸序列的翻譯的核酸序列。因此，表達(dá)控制序列可以包括與啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子的剪接信號、維持正確的所述基因的讀框以許可mRNA的適當(dāng)翻譯和終止密碼子有關(guān)的序列。GSTP1啟動子是最優(yōu)選的標(biāo)志。它是能夠引導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄以生成谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶蛋白的多核苷酸序列。啟動子區(qū)域位于上游，或相對于結(jié)構(gòu)基因的5'端。它可以包括下述元件(element)，所述元件足以致使啟動子依賴的基因表達(dá)對于細(xì)胞型-特異性、組織-特異性是可控的，或是可通過外來信號或物質(zhì)誘導(dǎo)的；這樣的元件可位于多核苷酸序列的5'或3'區(qū)。本發(fā)明的一個(gè)方法包括使含有標(biāo)志的靶細(xì)胞和與核酸結(jié)合的試劑接觸。所述靶細(xì)胞組分是核酸例如從尿中通過產(chǎn)生不含蛋白質(zhì)的純DNA的細(xì)胞裂解和純化(基于柱或溶液的)提取到的DNA。所述試劑包括引發(fā)和探測PCR或MSP反應(yīng)以及檢測目標(biāo)序列的組分。這些試劑可以包括合并或鍵合至其自身的報(bào)道基因部分的引發(fā)序列，例如在Whitcombe等人的美國專利6，326，145和6，270，967中描述的、稱為Scorpion試劑或Scorpion報(bào)道基因的那些啟動序列(在此以引用的方式引入上述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容)。盡管它們并不相同，但術(shù)語"引物"和"引發(fā)序列"在本說明書中可用于指引發(fā)核酸序列擴(kuò)增的分子或分子段。檢測甲基化模式的一個(gè)靈敏的方法包括聯(lián)合使用甲基化敏感的酶和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在用酶消化DNA后，只有當(dāng)DNA裂解被甲基化阻止時(shí)才從限制性酶切位點(diǎn)側(cè)翼的引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明的PCR引物是以位于根據(jù)基因位置編號M24485(Genbank)距GSTP1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)大約-71+59bp之間的啟動子和轉(zhuǎn)錄區(qū)域作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的。本發(fā)明的方法還可以包括使含有核酸的樣本與修飾非甲基化的胞嘧啶的試劑接觸；利用CpG特異性寡核苷酸引物擴(kuò)增樣品中含有CpG的核酸；以及檢測甲基化的核酸。優(yōu)選的修飾是把未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換成另一個(gè)核苷酸，該核苷酸能夠?qū)⑽醇谆陌奏づc甲基化的胞嘧啶區(qū)分開來。優(yōu)選地，所述試劑將未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶并且是亞硫酸氫鈉，然而，也可以使用其他的修飾未甲基化的胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶的試劑。亞硫酸氫鈉(NaHS03)修飾是最優(yōu)選的，其易于與胞嘧啶的5，6-雙鍵發(fā)生反應(yīng)，但其與甲基化胞嘧啶的反應(yīng)較差。胞嘧啶與亞硫酸氫鹽離子反應(yīng)形成對脫氨基作用敏感的磺化胞嘧啶反應(yīng)中間體，從而產(chǎn)生磺化尿嘧啶?；撬狨セ鶊F(tuán)可以在堿性條件除去，結(jié)果形成尿嘧啶。尿嘧啶通過Taq聚合酶被識別為胸腺嘧啶，因此在進(jìn)行PCR時(shí)，最終產(chǎn)品僅在初始模板中出現(xiàn)5-甲基胞嘧啶的位置處包含胞嘧啶。Scorpion報(bào)道基因和試劑以及其他的檢測系統(tǒng)按照這種方式類似地將經(jīng)修飾的樣本與未經(jīng)修飾的樣本區(qū)分開來。本發(fā)明中用于擴(kuò)增樣本中含有CpG的核酸的引物在修飾(例如使用亞硫酸氫鹽)后，能夠明確地區(qū)分未處理的DNA、甲基化的DNA和非甲基化的DNA。在甲基化特異性PCR(MSPCR)中，用于非甲基化DNA的引物或引發(fā)序列優(yōu)選在3'CG對具有T，從而將其與甲基化的DNA中保留的C相區(qū)別，補(bǔ)體被設(shè)計(jì)為反向引物。用于非甲基化DNA的MSP引物或引發(fā)序列(primingsequence)通常在序列中含有相對很少的Cs或Gs，因?yàn)镃s將在正義引物中缺失，而Gs在反向引物中缺失(C被修飾為U(尿嘧啶)，其在擴(kuò)增產(chǎn)物中被擴(kuò)增為T(胸腺嘧啶核苷))。本發(fā)明的引物是具有足夠長度和適當(dāng)序列的寡核苷酸，從而提供在多態(tài)性基因座(polymorphiclocus)中大量核酸的聚合的特異性引發(fā)。當(dāng)暴露于適當(dāng)?shù)奶结樆驁?bào)道基因時(shí)，被擴(kuò)增的序列顯示出甲基化狀態(tài)，由此顯示診斷信息。優(yōu)選的引物最優(yōu)選是八個(gè)或八個(gè)以上能夠引發(fā)引物延伸產(chǎn)物合成的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，所述產(chǎn)物與多態(tài)性基因座鏈基本上互補(bǔ)。有助于合成的環(huán)境條件包括三磷酸核苷和聚合用試劑例如DNA聚合酶的存在，以及適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H。為了最大擴(kuò)增效率，所述引物的引發(fā)部分或引發(fā)序列優(yōu)選是單鏈的，不過也可以是雙鏈的。如果為雙鏈，則所述引物在用于制備延伸產(chǎn)物前首先要進(jìn)行處理以使其鏈分離。所述引物必須是足夠長的以在存在聚合用誘導(dǎo)劑時(shí)引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的精確長度取決于諸如溫度、緩沖劑、陽離子和核苷酸組成的因素。寡核苷酸引物最優(yōu)選包含約12-20個(gè)核苷酸，盡管它們可以包含更多或更少的核苷酸，優(yōu)選按照公知的設(shè)計(jì)方針或規(guī)則。引物被設(shè)計(jì)成與將被擴(kuò)增的基因座的每個(gè)鏈基本上互補(bǔ)，并包含如上所述適當(dāng)?shù)腉或C核苷酸。這意味著所述引物必須充分互補(bǔ)從而在允許使用聚合用試劑的條件下與其各自的鏈雜交。換言之，所述引物應(yīng)當(dāng)與5'和3'側(cè)翼序列充分互補(bǔ)以進(jìn)行雜交和容許基因座擴(kuò)增。8引物被用于擴(kuò)增過程中。也就是說，相對于所包括的反應(yīng)步驟的數(shù)目來說反應(yīng)(優(yōu)選酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))產(chǎn)生了非常大量的靶基因座。在最優(yōu)的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)產(chǎn)生了按指數(shù)規(guī)律增大的量的靶基因座。例如這樣的反應(yīng)包括PCR反應(yīng)。一般地，一個(gè)引物與基因座的負(fù)(_)鏈互補(bǔ)，而另一個(gè)引物與正(+)鏈互補(bǔ)。對引物進(jìn)行退火以使核酸變性然后使用酶，例如DNA聚合酶I(Klenow)的大片段和核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果得到新合成的包含+鏈和_鏈的靶基因座序列。鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物是不連續(xù)的核酸雙螺旋體，其末端相當(dāng)于使用的特異引物的末端。所述引物可以通過使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽洌绨ㄗ詣踊椒ǖ某Ｒ?guī)的磷酸三酯和磷酸二酯法。在一個(gè)這樣的自動化實(shí)施方案中，二乙基亞氨基磷酸酯(diethylphosphoramidite)單體用作起始材料，并可以通過Beaucage等人描述的方法合成(TetrahedronLetters,22:1859-1862，1981)。美國專利號4，458，066中描述了用于在經(jīng)修飾的固體載體上合成寡核苷酸的方法。任何從尿或尿道沖洗物取得的核酸樣本，以純化或非純化的形式，均可用作起始核酸，只要其含有或懷疑含有具有靶基因座(例如CpG)的特定核酸序列。因此，所述方法可以使用例如DNA或RNA，包括信使RNA。所述DNA或RNA可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。在RNA用作模板的事件中，可以使用用于將模板逆轉(zhuǎn)錄為DNA的最佳的酶和/或條件。另外，可以使用包含各自的一個(gè)鏈的DNA-RNA雜交體。還可以使用核酸的混合物，或者也可以使用利用相同或不同的引物在本文中前述的擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的核酸。將被擴(kuò)增的特定的核酸序列，即耙基因座，可以是大分子的一部分，或者在開始時(shí)顯現(xiàn)為不連續(xù)的分子從而使特定序列構(gòu)成整個(gè)核酸。如果提取的樣品不純，則它可以在擴(kuò)增之前使用一定量的試劑進(jìn)行處理，所述試劑能夠有效地打開樣品的細(xì)胞、液體、組織或動物細(xì)胞膜，并能夠暴露和/或分離核酸的鏈。用于暴露并分離鏈的該裂解和核酸變性步驟將使擴(kuò)增能夠更容易地進(jìn)行。當(dāng)樣品的靶核酸序列包含兩條鏈時(shí)，在其用作模板之前必須對核酸的鏈進(jìn)行分離。鏈分離可以作為單獨(dú)的步驟實(shí)施，也可以與引物延伸產(chǎn)物的合成同時(shí)進(jìn)行。這樣的鏈分離可以通過使用各種適當(dāng)?shù)淖冃詶l件，包括物理的、化學(xué)的或酶的方法來完成。一種分離核酸鏈的物理方法包括加熱核酸直至其變性。典型的熱變性包括在約80□_105°〇的溫度范圍內(nèi)加熱最長達(dá)10分鐘。鏈的分離也可以通過來自被稱作解螺旋酶類的酶或通過酶RecA得到誘導(dǎo)，所述酶RecA具有解螺旋酶活性，并且已知其在存在riboATP時(shí)能夠使DNA變性。適于使用解螺旋酶分離核酸鏈的反應(yīng)條件由KuhnHoffmann-Berling描述(CSH-QuantitativeBiology，43:63，1978)。在C.Radding中對使用RecA的技術(shù)進(jìn)行了評述(Ann.Rev.Genetics,16:405-437，1982)。這些技術(shù)的精制形式現(xiàn)在也是眾所周知的。當(dāng)核酸的互補(bǔ)鏈被分離時(shí)，不管核酸原來是單鏈還是雙鏈，分離的鏈將可以用作合成其他核酸鏈的模板。該合成在允許引物雜交到模板的條件下進(jìn)行。合成通常發(fā)生在緩沖水溶液中，優(yōu)選地pH值為7-9，最優(yōu)選約為8。優(yōu)選將摩爾量過量(對于基因組核酸，通常為引物模板約108:1)的兩種寡核苷酸引物加入到含有分離的模板鏈的緩沖液中。如果將本發(fā)明的方法用于診斷應(yīng)用，則互補(bǔ)鏈的量可以是未知的，因此相對于互補(bǔ)鏈的量的引物的量不一定總是能夠準(zhǔn)確地確定。然而，實(shí)際上當(dāng)將被擴(kuò)增的序列包含在復(fù)雜的長鏈核酸鏈的混合物中時(shí)，引物的添加量與互補(bǔ)鏈(模板)的量相比通常是摩爾量過量的。優(yōu)選使用過量較多的摩爾量以改善所述方法的效率。將足夠量的三磷酸脫氧核糖核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP單獨(dú)地或與引物一起添加到合成混合物中，將所得溶液加熱到大約90°C-IO(TC，加熱最長達(dá)10分鐘，優(yōu)選1到4分鐘。在該加熱階段后，使溶液冷卻至室溫，這對于引物雜交來說是優(yōu)選的。向冷卻的混合物中加入用于進(jìn)行引物延伸反應(yīng)的適宜的試劑("聚合用試劑")，并使反應(yīng)在本領(lǐng)域公知的條件下進(jìn)行。如果聚合用試劑是熱穩(wěn)定的，則聚合用試劑也可以與其他試劑一同加入。該合成(或擴(kuò)增)反應(yīng)可以在室溫至聚合用試劑不再起作用的溫度下進(jìn)行。聚合用試劑可以是任何能用于完成引物延伸產(chǎn)物的合成的化合物或系統(tǒng)，優(yōu)選酶。用于該目的的適宜的酶包括，例如，E.coilDNA聚合酶1、E.coilDNA聚合酶1的克列諾(Klenow)片段、T4DNA聚合酶、其他可利用的DNA聚合酶、聚合酶突變體、反轉(zhuǎn)錄酶、和其他酶，包括熱穩(wěn)定的酶(例如，在經(jīng)受充分升高直至導(dǎo)致變性的溫度后進(jìn)行引物延伸的那些酶)。優(yōu)選試劑是Taq聚合酶。適宜的酶將以適當(dāng)?shù)姆绞酱龠M(jìn)核苷酸的組合，從而形成與各基因座核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。通常，合成將在各引物的3'端開始，并沿模板鏈在5'方向進(jìn)行，直到合成結(jié)束，以產(chǎn)生不同長度的分子。然而，也可以使用這樣的聚合用試劑，其利用與上述方法相同的方法，在5'端開始合成，并沿另一個(gè)方向進(jìn)行。最優(yōu)選地，擴(kuò)增方法是利用PCR進(jìn)行的。也可以采用替代性擴(kuò)增方法，只要使用本發(fā)明引物通過PCR擴(kuò)增的甲基化和非甲基化基因座能夠通過所述替代性手段被類似地?cái)U(kuò)增即可。在一個(gè)這樣的最優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)是作為嵌套式PCR進(jìn)行的。在嵌套式PCR方法中，采用兩級或多級聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一級聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用一對外寡核苷酸引物來擴(kuò)增第一序列，所述外寡核苷酸引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物和下游引物分別在5'和3'位置處位于特定第一靶核苷酸序列的側(cè)翼。在隨后的級次中，使用同樣由上游引物和下游引物組成的第二組內(nèi)或嵌套式寡核苷酸引物來擴(kuò)增包含在第一靶核苷酸序列內(nèi)的較小的第二靶核苷酸序列。上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物分別在5'和3'位置處位于第二靶核苷酸序列的側(cè)翼。側(cè)翼引物與在PCR過程中擴(kuò)增的雙鏈靶核苷酸序列的3'-端部分上片段互補(bǔ)。第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列位于以在第一級聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中被擴(kuò)增為目標(biāo)的基因的區(qū)域內(nèi)，其側(cè)翼具有在5'上游位置處的上游引物和在3'下游位置處的下游引物。第一靶核苷酸序列，以及由此地第一級聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基對長度是可預(yù)知的，所述長度是通過下述堿基對之間的距離確定的，所述堿基對分別位于外引物對的上游引物和下游引物的5'上游和3'下游雜交位置處。在第一級聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束時(shí)，使等份試樣的所得混合物繼續(xù)進(jìn)入第二級聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該反應(yīng)優(yōu)選自動地在密封或密閉的容器內(nèi)進(jìn)行，所述容器例如具有來自C印heid的"SMARTCAP"裝置。在該第二級反應(yīng)中，第一級反應(yīng)的產(chǎn)物與特異性的內(nèi)或嵌套弓I物合并。這些內(nèi)引物來源于在第一靶核苷酸序列內(nèi)的核苷酸序列，并且位于包含在第一靶核苷酸序列內(nèi)的第二、較小的靶核苷酸序列的側(cè)翼。使該混合物經(jīng)受最開始進(jìn)行的變性、退火和擴(kuò)增步驟，然后如前所述地?zé)嵫h(huán)以允許重復(fù)地變性、退火和延伸或復(fù)制第二靶核苷酸序列。該第二靶核苷酸序列側(cè)翼具有在5'上游位置的上游引物和在3'下游位置處的下游引物。第二靶核苷酸序列，以及由此地第二級PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基對長度是可預(yù)知的，所述長度是通過下述堿基對之間的距離確定的，所述堿基對分別位于內(nèi)引物對的上游引物和下游引物的5'上游和3'下游雜交位置處。使用產(chǎn)物特異性的探針或報(bào)道基因?qū)U(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選鑒別為甲基化的或非甲基化的，其中所述探針或報(bào)道基因是例如授予Mullis等人的美國專利4，683，195所描述的，此處通過引用而全部引入。用于檢測多核苷酸的探針和報(bào)道基因的領(lǐng)域的進(jìn)展是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。任選地，核酸的甲基化模式可以通過其他技術(shù)確認(rèn)，例如限制性內(nèi)切酶酶解和DNA印跡分析?？捎糜跈z測5'CpG甲基化的甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶的實(shí)例包括Smal、SaclI、Eagl、Mspl、HpalI、BstUI和BssHII。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，使用甲基化率。該甲基化率可以通過確定所得到的標(biāo)志的擴(kuò)增的甲基化種類的量與擴(kuò)增的參照標(biāo)志或擴(kuò)增的非甲基化標(biāo)志區(qū)域的量之間的比例獲得。其最好使用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行。比率超過確定的或預(yù)定的臨界值(cutoff)或閾值時(shí)被認(rèn)為是超甲基化的，并表示具有增殖病癥如癌癥(在GSTP1的情況中為前列腺癌)。臨界值是按照已知的方法確定的，其中所述方法被用于至少兩組樣品具有已知疾病狀況的樣品和具有已知正常狀況的樣品。本發(fā)明的參照標(biāo)志還可以用作內(nèi)部參照。所述參照標(biāo)志優(yōu)選是在樣品細(xì)胞中以組成型表達(dá)的基因，如P_肌動蛋白。已確定的或預(yù)定的值(臨界值或閾值)也可以在根據(jù)本發(fā)明的不使用比率的方法中被確定并使用。在這種情況下，臨界值由相對于某些基準(zhǔn)值，例如正常樣品或臨床不顯著的癌樣品(已知不會發(fā)展為臨床相應(yīng)的狀態(tài)或是非侵襲性的)中的甲基化的量或程度的甲基化的量或程度來建立。這些臨界值是按照公知的方法建立的，正如其應(yīng)用于基于甲基化率方法中的情況一樣。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，將通過MSP或其他適當(dāng)方法獲得的GSTP1甲基化值用使用同樣方法測定的S100A2甲基化值標(biāo)準(zhǔn)化。如實(shí)施例7中所顯示的，標(biāo)準(zhǔn)化值是通過從GSTP1值中減去S100A2測定值獲得的。也可以使用其他標(biāo)準(zhǔn)化方法例如生成甲基化率(其是通過下述方法獲得的將Ct值轉(zhuǎn)化為所關(guān)心的基因的拷貝數(shù)，并且用該拷貝數(shù)除以通過同樣方式獲得的P-肌動蛋白的拷貝數(shù))。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值時(shí)，臨界值是通過首先生成訓(xùn)練組(trainingset)，在該訓(xùn)練組中由臨界值生成最佳靈敏度和專一性，然后再在不相關(guān)的有效組中驗(yàn)證所述臨界值而確定的。本發(fā)明的方法和試劑盒可包括用于多路復(fù)用(multiplexing)的步驟和試劑。也就是說，可以同時(shí)測定一個(gè)以上的標(biāo)志。但僅對以下標(biāo)志進(jìn)行了檢測以作為本發(fā)明的部分GSTP1、RAR-P2、APC和S100A2以及內(nèi)部參照基因例如P-肌動蛋白。由于與標(biāo)志有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的降低常常是多核苷酸序列和/或表達(dá)控制序列(例如啟動子序列)的特定元件超甲基化的結(jié)果，因此制備匹配這些序列的引物。因而，本發(fā)明提供了通過檢測特殊區(qū)域，優(yōu)選在標(biāo)志的表達(dá)控制或啟動子區(qū)內(nèi)的甲基化來檢測或診斷細(xì)胞增殖性病癥的方法。用于檢測這些區(qū)域的甲基化的探針可用于這樣的診斷或預(yù)后方法。本發(fā)明的試劑盒可以配置有各種構(gòu)成部件，只要它們都包含至少一個(gè)引物或探針或檢測分子(例如Scorpion報(bào)道基因)即可。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增和檢測超甲基化標(biāo)志片段的試劑。任選地，所述試劑盒包括樣品制備試劑和/或從樣品中提取核酸的制品(例如管)。在優(yōu)選的試劑盒中，包括單管(one-tube)MSP所必需的試劑，例如，相應(yīng)的PCR引物組、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶如Taq聚合酶和適當(dāng)?shù)臋z測試劑，如水解探針或分子信標(biāo)。在任選優(yōu)選試劑盒中，檢測試劑是Scorpion報(bào)道基因或試劑。還可以使用對雙鏈DNA有特異性的單獨(dú)的染色引物或熒光染料，如溴化乙錠。引物優(yōu)選是能產(chǎn)生高濃度的量。試劑盒中的其他材料可包括適宜的反應(yīng)管或瓶、隔離成分，一般為蠟珠(waxbead)，任選包括鎂；必需的緩沖液和試劑如dNTP;對照核酸和/或任何可用于MSP反應(yīng)的另外的緩沖劑、化合物、輔因子、離子組分、蛋白質(zhì)和酶、聚合物等。所述試劑盒任選包括核酸提取試劑和材料。實(shí)施例實(shí)施例1:樣品的制備和MSPCR前列腺樣品從已知臨床結(jié)果的患者處獲得。甲基化測定是如下進(jìn)行的。使用商售的亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化試劑盒(ZymoResearch,Orange,CA，USA)修飾基因組DNA。該處理將未甲基化的DNA中的所有胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而在甲基化的DNA中僅有不在鳥嘌呤前面的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。所有在鳥嘌呤前面的胞嘧啶(在CpG雙核苷酸中)仍然保持是胞嘧啶。下面將對所述試驗(yàn)進(jìn)行更加全面的描述。a.沉積如下所述獲得沉積的尿樣品在+4攝氏度下將含有尿的50-mlFalcon管以3000g在VRXSorvall離心機(jī)上離心10分鐘。除去上清液，并在離心團(tuán)上方保留5ml上清液。然后再次對管進(jìn)行旋轉(zhuǎn)沉淀(3000g，5分鐘)以棄去剩余的上清液(使用1ml吸頭)。接著用20mL冷(4°C)PBS洗滌尿沉淀物，再次旋轉(zhuǎn)沉淀(3000g，5分鐘)，并將剩余的上清液吸出。然后在_201:下儲存樣CIb.細(xì)胞裂解和DNA的提取接著將沉淀物中的細(xì)胞如下地進(jìn)行裂解。向每個(gè)含有尿細(xì)胞離心團(tuán)的樣品中加入700ill的細(xì)胞理解溶液。接著將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到2.Oml的微量離心管中，并向溶胞產(chǎn)物中加入3iU的蛋白酶K溶液(ProteinaseKSolution)(20mg/ml)，上下反轉(zhuǎn)25次進(jìn)行混合，并在55t:下培養(yǎng)一小時(shí)到過夜。通過在20°C(加熱塊)放置10分鐘將樣品冷卻到室溫。接著向裂解產(chǎn)物中加入3001的蛋白質(zhì)沉淀溶液，然后將裂解產(chǎn)物高速劇烈渦旋20秒。將樣品置于冰浴中5分鐘并以(16000RPM)離心5分鐘。沉淀的蛋白質(zhì)形成緊密的離心團(tuán)。然后將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2.0ml的管中，重復(fù)沉淀步驟。然后將含有DNA的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2.0ml微量離心管中并重復(fù)離析分離操作(16000RPM，3分鐘)，再次將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2.0ml的微量離心管中，該微量離心管中含有900ii1100%異丙醇和2iU的糖元(Glycogen)20mg/ml。通過輕輕地上下反轉(zhuǎn)50次混合樣品并將其在搖動器上在室溫下保持至少10-15分鐘，然后冷卻到_20°C。接著將樣品以16000RPM離心5分鐘。此時(shí)可以看到DNA為小的白色離心團(tuán)。用lml-移液管除去上清液并將樣品以(16000RPM)離心60秒。用100iU-移液管除去剩余的上清液。加入900ii170X的乙醇并將管上下反轉(zhuǎn)10次以洗滌DNA離心團(tuán)，接著以16000RPM再次離心1分鐘。用lml-移液管除去乙醇，接著以(16000RPM)再次離心60秒。用100yl-移液管除去剩余的上清液，并將樣品空氣干燥10-15分鐘。向干燥的樣品中加入45iULoTE緩沖液，通過在65t:以1100rpm搖動培養(yǎng)1小時(shí)并在20°C以llOOrpm搖動培養(yǎng)過夜來使DNA被再水合。將DNA存儲于-S(TC下的帶有清楚標(biāo)簽的管中。c.亞硫酸氫鹽修飾接著用來自ZymoResearch的EZ-DNA甲基化試劑盒(商品目錄號D5001)如下地修飾DNA樣品。將24ml無水乙醇加入到M_洗滌(M-Wash)緩沖液濃縮物中以制備最終的M_洗滌(M-Wash)緩沖液。將5illM-稀釋緩沖液(M-DilutionBuffer)直接加入到45的DNA樣品中。通過用移液管上下地吸吐來混合該混合物，接著稍微旋轉(zhuǎn)，然后將其在以llOOrpm搖動的加熱塊中在37t:下培養(yǎng)15分鐘。在培養(yǎng)期間，通過加入750ii1的BakerWater和210ill的M-稀釋緩沖液(M-DilutionBuffer)來制備CT轉(zhuǎn)化試劑。接著通過每2分鐘渦流旋轉(zhuǎn)1分鐘共計(jì)10分鐘來進(jìn)行混合。在上述的培養(yǎng)后，將100ml的制備的CT轉(zhuǎn)化試劑(在略微搖動后)加入到各樣品中，接著使各樣品輕輕地渦旋并略微地旋轉(zhuǎn)。然后將樣品用蓋有鋁箔的加熱塊(以llOOrpm搖動)在7(TC下培養(yǎng)3小時(shí)。接著對樣品略進(jìn)行旋轉(zhuǎn)沉淀并置于冰上10分鐘。將400mlM_結(jié)合(M-Binding)緩沖液加入到樣品中，通過用移液管上下吸吐對其進(jìn)行混合。將全部的上清液負(fù)載在Zymo-SpinColumn柱上，所述柱子被放置在一個(gè)2ml的接收管中。將所述管以最大的速度離心15-30秒，丟棄流過柱子的部分。向柱子中加入200iU的M-洗滌緩沖液(M-WashBuffer)，將柱子以最大的速度離心15-30秒，再次丟棄流過柱子的部分。將200ii1的M-脫磺酸緩沖劑(M-DesulphonationBuffer)加入到柱子中并讓其室溫下直立15分鐘，接著以最大的速度離心15-30秒并丟棄流過柱子的部分。然后重復(fù)進(jìn)行該過程三次，最后一個(gè)離心步驟持續(xù)30秒。接著將柱子置于干凈的1.5ml的管上，向其中加入50iU的M-洗脫緩沖液。然后使柱子在RT下靜置2分鐘，接著以最大的速度離心1分鐘以洗脫DNA。將洗脫的DNA貼上標(biāo)簽并作為'BT修飾的'儲存在-S(TC下。接著用以下引物和探針建立MSPCR試驗(yàn)夕卜PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>內(nèi)PCRScorpion探針/引物組<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>BHQ=BlackHoleQuencher報(bào)道分子。HEG=六乙二醇嵌套式PCR反應(yīng)是使用"SMARTCAP"管(C印heid)禾口"SMARTCYCLER"(C印heid)PCR分析儀如下地進(jìn)行的。將各解凍的試劑略微地渦旋以進(jìn)行混合。將足夠的C印heidSmartC即PCR反應(yīng)管貼上標(biāo)簽并將其置于架子中。對每個(gè)管均使用新鮮的移液管尖，將5ul的第一輪PCR主混合物(mastermix)加入到每個(gè)管中。再次對每個(gè)樣本使用新鮮的移液管尖，將5yL的樣本加入到各自的管中，接著將所述管封閉但沒有在原地咬合住SmartC即s。在"SMARTCYCLER"離心機(jī)中將所述管離心30秒，并以在"SMARTCYCLER"儀中的順序放置，用"SMARTCYCLER"上的蓋子封閉儀器，并且開始啟動試驗(yàn)。以下顯示了C印heid平臺上的循環(huán)條件(第一輪PCR)。在上述過程完成后，除去管并如下地建立第二輪PCR。打開管蓋，然后向"SMARTCAP"存儲池中加入15ul第二輪PCR主混合物使得最終體積為25ul。插入長釘并將蓋子咬合在相應(yīng)位置。接著在微量離心機(jī)中將所述管用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子離心30秒。然后在循環(huán)條件下在C印heid平臺上使內(nèi)PCR反應(yīng)進(jìn)行40次循環(huán)，其中所述循環(huán)條件如下所示(第二輪PCR)。在上述過程完成后，取出C印heid管并棄去。使用以下循環(huán)參數(shù)。第一輪PCR第二輪PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>用以下單獨(dú)組分來制備用于SMARTCAP管中的單個(gè)四路復(fù)用的反應(yīng)混合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>外引物PM-1最終濃度全部/肌動蛋白標(biāo)志-0.05uM-0.04uM參第二輪PCR(R2)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>PCR主混合物是如下制備的(外引物和內(nèi)Scorpion探針/引物混合物)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>最終25ii1反應(yīng)物的組成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>數(shù)據(jù)結(jié)果來自"SMARTCYCLER"分析儀。數(shù)據(jù)是通過執(zhí)行表1中顯示的預(yù)定閾值和標(biāo)準(zhǔn)而分析的。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>按以下試驗(yàn)性能特征生成并顯示結(jié)果％靈敏度，特異性和95%置信區(qū)間，它們是用為2合IPCR模式定義的Ct臨界值為標(biāo)志的組合計(jì)算的。以用兩個(gè)統(tǒng)計(jì)軟件程序包進(jìn)行的ROC曲線分析為基礎(chǔ)計(jì)算曲線數(shù)值下面積。對于單一的標(biāo)志分析，使用MedCalc軟件生成AUC值，并且對于多種標(biāo)志的不同的組合使用S-Plus統(tǒng)計(jì)軟件中的邏輯回歸模型。以癌和非癌患者之間的Ct值的相對分布為基礎(chǔ)設(shè)定臨界值。如果由甲基化標(biāo)志組所獲得的Ct值中的任何一個(gè)低于定義的臨界值，則認(rèn)為該樣品是甲基化的，即使肌動蛋白顯示的是"未測定"的情形。圖表顯示了多種參數(shù)的交叉比較數(shù)據(jù)以說明本發(fā)明的各實(shí)施方案。實(shí)施例2:樣品存儲和基因組合鑒別的影響用組合試驗(yàn)重復(fù)實(shí)施例1中描述的方法，所述組合試驗(yàn)包含來自GSTP1、RARP2和APC基因的標(biāo)志的組合。如所顯示的，在樣品收集的第3天，樣品收集的第5天和樣品收集的第16天內(nèi)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示于表2中。表2.GSTPRAR02APC儲存天數(shù)靈敏度(％)特異性(％)X163196X163193X163686XX164491XX163985XXX164982X53596X53591X54085XX55090XX54484XXX55481X33691X33288X32993XX3548820<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>用于該實(shí)施例的樣品組是全(純)尿樣品，其由16天組的148個(gè)樣品(68個(gè)已知患有癌癥)、5天組的121個(gè)樣品(52個(gè)已知患有癌癥)和三天組的73個(gè)樣品(30個(gè)已知患有癌癥)組成。意外的是，GSTP和RARP2的組合優(yōu)于GSTP、RARP2和APC的組合，盡管APC是已知的前列腺癌標(biāo)志。當(dāng)樣品被儲存三天或更少的時(shí)間時(shí)，該二基因組合大大地優(yōu)于任何其他的組合。當(dāng)所有試驗(yàn)均被考慮時(shí)，與保留5天樣品的51.35%的陽性預(yù)測值和儲存16天樣品的47.22%的陽性預(yù)測值相比，儲存3天的樣品的陽性預(yù)測值是65.9%。然后，使用全尿樣品和使用如上所述制備且儲存3天的沉淀物對新的數(shù)據(jù)組(N=73，已知患癌的個(gè)數(shù)=30，已知未患癌的個(gè)數(shù)=43)進(jìn)行ROC曲線分析。確定單獨(dú)的標(biāo)志的曲線下面積。結(jié)果總結(jié)于表3中。表3標(biāo)志樣品靈敏度/特異性近似值(%)AUCGSTPWU38/93.66RAR0wu31/93.58APCWU35/98.64GSTP沉積43/90.64RAR0沉積56/77.64APC沉積52/87.62當(dāng)樣品為全尿(純的)樣品時(shí)，ROC分析表明單獨(dú)的GSTP給出了最好的結(jié)果。如所顯示的，該同樣的分析表明旋轉(zhuǎn)樣品以使其沉降為沉積物的操作明顯改善了RARI3標(biāo)志的性能。實(shí)施例3:前列腺按摩對兩個(gè)其他樣品組進(jìn)行試驗(yàn)并分析以確定前列腺按摩對尿基試驗(yàn)的性能的影響。在第一個(gè)樣品組中，36個(gè)樣品(20個(gè)已知患有癌癥)是從接受了限于小于20秒的前列腺按摩的患者處獲得的。在另一個(gè)樣品組中，77個(gè)樣品(30個(gè)已知患有癌癥)是從接受了超過20秒的前列腺按摩的患者處獲得的。在每種情況中，樣品均被存儲5天或更少。在這些樣品上進(jìn)行MSPCR的結(jié)果總結(jié)在表4中。表421<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>最好的結(jié)果是由包括GSTP、RARI3和APC的基因組合在前列腺按摩持續(xù)時(shí)間小于20秒時(shí)獲得的。這是意外的，因?yàn)槿藗兛赡芤呀?jīng)預(yù)期較長的按摩會排放出更多的細(xì)胞并且至少會提高特異性。實(shí)施例4.直腸指檢對四個(gè)其他樣品組進(jìn)行試驗(yàn)和分析以確定根據(jù)直腸指檢(DRE)異常比正常的比進(jìn)行的樣品選擇對尿基試驗(yàn)性能的影響。在第一個(gè)樣品組中，64個(gè)全尿樣品(23個(gè)已知患有癌癥)是從DRE正常的患者處獲得的。在第二個(gè)樣品組中，33個(gè)全尿樣品(19個(gè)已知患有癌癥)是從DRE異常的患者處獲得的。第三個(gè)樣品組包含顯示DRE正常的48個(gè)沉積樣品(21個(gè)已知患有癌癥)。第四個(gè)樣品組包含從DRE異?；颊咛帿@得的22個(gè)沉積樣品(8個(gè)已知患有癌癥)。在每種情況中，樣品均被存儲5天或更少。在這些樣品上進(jìn)行MSPCR的結(jié)果總結(jié)在表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>用于選自DRE異常患者的樣品的標(biāo)志，其表現(xiàn)顯著優(yōu)于在DRE陰性患者情況中的表現(xiàn)。當(dāng)標(biāo)志基因組合由GSTP和APC組成時(shí)，來自DRE異?；颊叩娜驑悠繁辉囼?yàn)出具有幾乎與最好的沉積樣品相同的靈敏度和特異性。在DRE異常的沉積樣品中，單獨(dú)的標(biāo)志(APC)試驗(yàn)的表現(xiàn)最好，但GSTP/APC基因組合的表現(xiàn)與其相差不大。實(shí)施例5:PSA水平對兩個(gè)其他樣品組進(jìn)行試驗(yàn)和分析以確定以PSA水平為基礎(chǔ)的樣品選擇的影響。在第一個(gè)樣品組中，52個(gè)全尿樣品(25個(gè)已知患有癌癥)是從PSA值為2.5-4ng/ml的患者處獲得的。在另一個(gè)樣品組中，169個(gè)樣品(80個(gè)已知患有癌癥)是從PSA水平為4-10ng/ml的患者處獲得的。在每種情況中，在尿收集和沉積過程之間，樣品均在5天以內(nèi)被存儲于4t:下。在這些樣品上進(jìn)行MSPCR的結(jié)果總結(jié)在表6中。對于PSA水平在2.5到4ng/ml之間的52個(gè)受試者(包括25個(gè)患有癌癥和27未患有癌癥的病例)來說，當(dāng)使用邏輯回歸模型時(shí)其顯示出58%的靈敏度和88%的特異性，或者當(dāng)使用具有以下Ct臨界值的3個(gè)標(biāo)記物GSTP=26，RAR=28，APC=25并且無試驗(yàn)率為3.8%時(shí)，其分別顯示為58%的靈敏度和81%的特異性。對于具有PSA4-10的隊(duì)列(co-hort)的患者來說，使用相同標(biāo)志和Ct臨界值的敏感度/特異性特征值為59/65%。二樣品的T-檢驗(yàn)證實(shí)在下述試驗(yàn)中不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異，所述試驗(yàn)是在PSA范圍為2.5-4和4-10ng/ml(P=0.000)的兩個(gè)隊(duì)列(co-hort)之間進(jìn)行的。結(jié)果顯示在表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例6:更廣泛的多路復(fù)用使用已知能夠用于前列腺癌分析的其他標(biāo)志進(jìn)行更廣泛的多路復(fù)用。如果試驗(yàn)的目的是解決PSA結(jié)果(在臨床應(yīng)用中為2.5-4ng/ml)不明確的問題，則追求最大試驗(yàn)特異性。試驗(yàn)在儲存3天的沉積樣品上進(jìn)行。60個(gè)樣品(30個(gè)來自患有癌癥的病例，30個(gè)來自未患有癌癥的病例)中的每一個(gè)均進(jìn)行第一輪PCR。使用3個(gè)四路復(fù)用反應(yīng)的6個(gè)標(biāo)志(GST+RAR+APC+RASS+CDH1+PDLIM4)產(chǎn)生的尿沉積物的數(shù)據(jù)證明CDH1、RASS和PDLM4對保持80%特異性沒有附加價(jià)值。包括全部6個(gè)標(biāo)志削弱了試驗(yàn)特異性(靈敏度=44%，特異性=63%)。而且，6個(gè)標(biāo)志的使用不適合于單管試驗(yàn)?zāi)Ｊ?。結(jié)果顯示于表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>以上數(shù)據(jù)顯示了代表性的組中的三個(gè)標(biāo)志各自的性能以及作為組合的性能，其中所述代表性的組中有20個(gè)患有癌癥，10個(gè)未患有癌癥。靈敏度比一般觀察到的低，因?yàn)樵诔练e之前尿樣品的儲存時(shí)間小于其最佳存儲時(shí)間。接著用S100分析同樣的樣品，并且用S100和所關(guān)心的基因之間的ACt來生成臨界值。數(shù)據(jù)對RARP2和APC顯示出改善的性能，但對GSTP1沒有顯示出改善的性能。觀察到上述不同的影響是因?yàn)閷τ赗ARI32和APC來說，邊緣情況現(xiàn)在可以被明顯地確定為患有癌癥，因此改善了靈敏度。然而，對于GSTPl來說在該數(shù)據(jù)組中不存在邊緣情況，因此靈敏度保持不變。表8Pm-Mu-NormS100GSTP1RARAPC靈敏度20.00%15.00%20.00%特異性90.00%100,00%90.00%GSTP1/APC//RARB2靈敏度40.00%特異性80.00%序列表IndividualApplicant--------------------Street:City:State:Country:26〈222〉LocationTo:1其他信息fam-CDSJoin:No特征-------序列#3:〈221〉FeatureKey:miscj寺征〈222〉LocationF簡〈222>lxicationTo:其他信息GSTP1ScorpionCDSJoin:No特征-------序列#3:<221〉FeatureKey:modified_base〈222〉LocationFrom:32〈222〉LocationTo:32其他信息BHQ-HEG-CDSJoin:No序列--------〈213〉生物體名稱人類〈400〉PreSequenceString:gccccaatactaaatcacgaeg22〈212〉類型DNA<211〉長度22序列名稱#4序列描述特征-------序歹lj:#4:〈221〉FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222幾o(hù)cationTo:其他信息GSTPi反向引物CDSJoin:No特征-------序列#4:〈221>FeatureKey:modified—base〈222〉LocationFrom:22〈222〉LocationTo:22其他信息3'CDSJoin:No牛寺征-------序歹lj:#4:〈221>FeatureKey:modified_base〈222>LocationFrom:1<222>LocationTo:1其他信息5'CDSJoin:No序歹lj--------〈213〉生物體名稱人類〈400>PreSequenceString:gatataaggttagggataggatag24〈212〉類型DNA〈211>長度24序列名稱#5序列描述特征-------序列#5:〈221〉FeatureKey:miscj寺征<222>LocationFrom:〈222>LocationTo:其他信息肌動蛋白_309_U24CDSJoin:No序列--------〈213>生物體名稱人類〈400〉PreSequenceString:aaccaataaaacctactcctcc22〈212〉類型DNA〈211〉長度22序列名稱#6序列描述特征-------序列恥〈221〉FeatureKey:miscj寺征〈222>LocationFrom:〈222>LocationTo:其他信息肌動蛋白_501_L22CDSJoin:No序歹lj--------〈213>生物體名稱人類〈400>PreSequenceString:ccgcgcatcaccaccccacacgcgcggggagtatataggttggggaagtttg52〈212〉類型DNA〈211>長度52序列名稱#7序列描述特征--------序列#7:〈221>FeatureKey-modified—base<222>Lx>cationFrom:1〈222〉LocationTo:1其他信息q670CDSJoin:No特征-------序列#7:<221>FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222幾o(hù)cationTo:其他信息肌動蛋白ScorpionCDSJoin:No特征-------序歹lj:#7:〈221〉FeatureKey:modified_base〈222>LocationFrom:28<222>bocationTo:28其他信息-BHQ2-HEG-CDSJoin:No序列--------〈213>生物體名稱人類〈400>PreSequenceString:朋c3C3C朋t朋C3肪C3C3朋ttcac27〈212>類型DNA<211>長度27序列名稱#8序列描述特征-------序列#8:〈221>FeatureKey-modified—base〈222>LocationFrom:1〈222>lxicationTo:1其他信息5'CDSJoin:No特征-------序列#8:〈221〉FeatureKey:misc_特征〈222>LocationFrom:〈222>U>cationTo:其他信息肌動蛋白反向引物CDSJoin:No牛寺征-------序列#8:〈221>FeatureKey-modified—base〈222〉LocationFrom:27〈222〉LocationTo:27其他信息3'CDSJoin:No序列--------〈213>生物體名稱人類〈400>PreSequenceString:ccctataccccactacgaa19〈212〉類型:DNA〈211〉長度19序列名稱#9序列描述特征序列#9:〈221>FeatureKey:misc—特征〈222>LocationFrom:〈222〉LocationTo:其他信息APC—0uter_692_U19CDSJoin:No序列〈213〉生物體名稱人類〈400〉PreSequenceString:ggcgggttgtatt朋tet;agttate2.5〈212〉類型DNA〈211〉長度25序列名稱#10序列描述特征序列#10:〈221>FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222〉LocationTo:其他信息APC—0uter_830—L25CDSJoin:No序列〈213〉生物體名稱人類〈400>PreSequenceString:gccggcgggttttcgacgggccggccgaaccaaaacgctcccca44〈212〉類型:DNA〈211〉長度44序列名稱#11序列描述特征-------序列#11:〈221>FeatureKey:modified_base〈222>U)cationFrom:1〈222>LocationTo:1其他信息texasred-CDSJoin:No特征-------序列#11:〈221>FeatureKey:modified—base〈222〉LocationF濯25〈222〉LocationTo:25其他信息-BHQ2-HEG-CDSJoin:No序列--------〈213〉生物體名稱人類〈400〉PreSequenceString:gtcggttacgtgcgtttatatttag25〈212〉類型DNA〈211>長度25序列名稱#12序列描述特征-------序列#12:〈221〉FeatureKey:misc—特征〈222〉LocationFrom:〈222幾o(hù)cationTo:其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)施所述方法。22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中基因的甲基化狀態(tài)是使用嵌套式PCR確定的，其中先進(jìn)行第一輪PCR，接著再進(jìn)行后續(xù)輪的PCR，其中用于進(jìn)行所述后續(xù)PCR的引物和探針對應(yīng)于在第一輪PCR中擴(kuò)增的序列內(nèi)部的序列，并且其中在進(jìn)行第一輪PCR之前先旋轉(zhuǎn)沉淀尿樣品以形成沉積物。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中在收集所述尿樣品之前，先使人體經(jīng)受約20秒的前列腺按摩。24.—種用于實(shí)施檢測前列腺癌的分析的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測基本上由GSTP1和一種或多種參照基因組成的基因的存在的核酸擴(kuò)增和檢測試劑以及說明書，所述說明書指導(dǎo)了所述試劑在測量的PSA水平為2.5-4ng/ml的患者中的應(yīng)用。25.—種用于實(shí)施檢測前列腺癌的分析的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測基本上由GSTP1、RARI31和一種或多種參照基因組成的基因的存在的核酸擴(kuò)增和檢測試劑以及說明書，所述說明書指導(dǎo)了所述試劑在測量的PSA水平為2.5-4ng/ml的患者中的應(yīng)用。26.—種用于實(shí)施檢測前列腺癌的分析的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測基本上由GSTP1、RARI31、APC和一種或多種參照基因組成的基因的存在的核酸擴(kuò)增和檢測試劑以及說明書，所述說明書指導(dǎo)了所述試劑在測量的PSA水平為2.5-4ng/ml的患者中的應(yīng)用。27.—種用于實(shí)施檢測前列腺癌的分析的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測S100A2基因和選自GSTPl、RARI31和APC的另一種基因以及一種或多種參照基因的存在的核酸擴(kuò)增和檢測試劑。全文摘要本發(fā)明涉及前列腺癌的檢測。本發(fā)明屬于疾病檢測領(lǐng)域。本發(fā)明提供了用于檢測前列腺癌的方法，包括在獲得尿樣品后不遲于三天時(shí)僅測定尿樣品中的GSTP1基因和一種或多種參照基因的甲基化狀態(tài)。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施檢測前列腺癌的分析的試劑盒，其包括用于檢測基本上由GSTP1和一種或多種參照基因組成的基因的存在的核酸擴(kuò)增和檢測試劑。文檔編號C12Q1/68GK101724685SQ20081009174公開日2010年6月9日申請日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2007年4月12日發(fā)明者A·馬祖姆達(dá),D·喬達(dá)里,H·王,J·F·貝登,T·維納申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司