国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的開管毛細(xì)管柱及方法

      文檔序號(hào):6028761閱讀:395來源:國(guó)知局
      專利名稱:一種富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的開管毛細(xì)管柱及方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域,是在利用質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)之前,首 先對(duì)其進(jìn)行選擇性富集的一種方法,即一種利用功能化修飾的開管毛細(xì)管柱實(shí)現(xiàn)離線及在線 選擇性富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法。
      背景技術(shù)
      蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾之一,對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 細(xì)胞凋亡等生命過程具有重要的調(diào)控作用。近幾年來,質(zhì)譜(MS)已經(jīng)廣泛用于磷酸化蛋白 質(zhì)的鑒定。由于細(xì)胞/組織內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)的化學(xué)計(jì)量值較低,以及質(zhì)譜分析時(shí)非磷酸化肽段 對(duì)磷酸肽存在信號(hào)抑制,使得直接質(zhì)譜分析磷酸化蛋白質(zhì)或磷酸肽存在很大的困難。因此發(fā) 展高選擇性的分離富集技術(shù),對(duì)于磷酸化肽段的鑒定是十分必要的,可以促進(jìn)磷酸肽的質(zhì)譜 檢測(cè)。
      目前,最常用的富集磷酸肽的方法包括固相金屬離子親和色譜(IMAC)。在IMAC中, 利用磷酸肽的磷酸基與IMAC填料表面螯合的金屬離子如F^+、 G^+等之間特異性的吸附作 用,使得磷酸肽被保留在固相化的金屬螯合離子上。 一些金屬氧化物如Ti02, Zr02, A1203 等也用于磷酸肽的富集。在最近的研究中,人們將磷酸鋯(ZrP)基團(tuán)修飾在多晶硅的表面, 用于磷酸化蛋白的富集分離,并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜技術(shù)(Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-MS),取得了良好的富集效果[Houjiang Zhou, Songyun Xu, Mingliang Ye, Shun Feng, Chensong Pan, Xiaogang Jiang, Xin Li, Guanghui Han, Yu Fu, and Hanfa Zou. Zirconium phosphonate-modified porous silicon for highly specific capture of phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis(利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的多晶硅高選擇性富集磷 酸肽及基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜分析).J. Proteome Res, 2006, 5:2431-2437]。同樣,在 聚甲基丙烯酸縮水甘油酯[poly(glycidyl methacrylate~co-ethylene dimethacrylate), GMA-EDMA] 珠子表面修飾ZrP基團(tuán),用于磷酸化蛋白富集分離的方法也見報(bào)道。由于ZrP基團(tuán)與磷酸肽的 磷酸基團(tuán)之間的強(qiáng)的配位作用,使得富集效果顯著提高。但這些富集方法要么操作步驟非常 煩瑣,同時(shí)處理多個(gè)樣品困難。要么由于在離心管內(nèi)手工操作,轉(zhuǎn)移過程導(dǎo)致樣品損失,一 次最多只能處理幾個(gè)樣品,無法滿足蛋白組學(xué)大規(guī)模、高通量分析的要求。這些缺點(diǎn)限制了 其在大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組分析中的進(jìn)一步應(yīng)用。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的開管毛細(xì)管柱,及選擇性富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法。該方案的原理如下
      制備一種功能化的開管毛細(xì)管柱,其內(nèi)壁具有可選擇性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)。加樣后可直接對(duì)磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行富集,再利用清洗緩沖液除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白質(zhì)和鹽,清洗完成后利用洗脫液對(duì)磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫,洗脫的磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)可在線或離線進(jìn)行質(zhì)譜分析。
      發(fā)明使用的毛細(xì)管柱是一種功能化的開管毛細(xì)管柱,其內(nèi)壁具有可選擇性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)。具體的說,是利用毛細(xì)管開管柱內(nèi)表面的硅羥基與磷酸肽或磷酸
      化蛋白質(zhì)吸附材料化學(xué)連接的方式制得,該吸附材料優(yōu)選的為磷酸鋯(ZrP)。
      為實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟
      (1) 制備功能性開管毛細(xì)管柱;
      (2) 將樣品注入到開管毛細(xì)管柱中,孵育以選擇性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì);
      (3) 將洗脫液注入開管毛細(xì)管柱,對(duì)磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫;
      (4) 對(duì)洗脫后的磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。孵育吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)時(shí),可采用連續(xù)注射形式或進(jìn)樣后靜態(tài)孵育。為提高分析的準(zhǔn)確性,在富集含鹽生物樣品時(shí),在步驟(2)和(3)之間還應(yīng)進(jìn)行脫鹽
      操作。具體的說,是將清洗液注入開管毛細(xì)管柱,除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白質(zhì)和鹽。
      進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)可采用離線或在線方式。離線富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)時(shí)的洗脫液中
      可加入基質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)靶并在MALDI-TOF-MS上進(jìn)行分析;為便于操作,離線富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)時(shí)可采用微量進(jìn)樣泵,并可以保證上樣溶液、清洗溶液及洗脫溶液流速的穩(wěn)定性。自動(dòng)在線富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)時(shí),可以將開管毛細(xì)管柱接在微升或納升級(jí)毛細(xì)管高壓液相色譜-質(zhì)譜(LC-ESI-MS)的液相部分上,直接進(jìn)行ESI-MS/MS分析,提高操作的自動(dòng)化水平和樣品的利用率。
      本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)
      1、操作簡(jiǎn)便高效,適用范圍廣。本發(fā)明對(duì)磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的富集是基于磷酸鋯功能基團(tuán)與磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的磷酸基團(tuán)之間的強(qiáng)的配位作用,因而具有很高的富集效率。操作上,既可以利用微量進(jìn)樣泵離線富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì),整個(gè)操作過程非常簡(jiǎn)單、方便;又可以接在微升或納升級(jí)ESI-MS的液相部分上,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)在線富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì),大大提升其分析效率。在與質(zhì)譜分析器的聯(lián)用方面,既可以結(jié)合MALDI-MS分析,又可以結(jié)合ESI-MS/MS分析,滿足不同的樣品分析需求。
      2、 成本低,易于重復(fù)使用。本發(fā)明所用開管毛細(xì)管柱制備簡(jiǎn)單,價(jià)廉易得,并可以制成不同類型規(guī)格的富集柱,滿足不同的分析需求。對(duì)使用過的開管毛細(xì)管柱,可以通過注入含游離鋯離子溶液的方式進(jìn)行功能修復(fù),從而延長(zhǎng)其使用壽命。
      3、 特別適用于大樣本的處理。本發(fā)明所用開管毛細(xì)管柱可以一次批量處理多個(gè)樣品。無論采用離線富集的方式,還是采用在線富集的方式,不同樣品可以依次分別負(fù)載在開管毛細(xì)管柱上,孵育完成后通過依次清洗及洗脫,進(jìn)而對(duì)洗脫下來的磷酸肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。尤其當(dāng)采用在線富集方式時(shí),可以通過自動(dòng)化的控制軟件,輕松實(shí)現(xiàn)大批量樣本的自動(dòng)上樣、清洗、洗脫及質(zhì)譜分析,其分析效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常用的磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)富集方法。
      4、 特別適用于復(fù)雜樣品處理分析。本發(fā)明利用開管毛細(xì)管柱富集復(fù)雜樣品中的磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)時(shí),復(fù)雜樣品前處理常用的一些組分不會(huì)被柱子保留,也不會(huì)干擾磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的富集。整個(gè)過程不需要對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽前處理,極大地降低了樣品損失,適合處理微量的樣品,如二維凝膠電泳的膠內(nèi)酶解肽段等。


      圖1是發(fā)明技術(shù)方案的流程圖。(a)為未修飾的開管毛細(xì)管柱;(b)為修飾氨丙基的開管毛細(xì)管柱;(c)為修飾磷酸基團(tuán)的開管毛細(xì)管柱;(d)為修飾磷酸鋯基團(tuán)的開管毛細(xì)管柱;(e)為磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱富集磷酸肽的示意;(f)為富集的磷酸肽被洗脫后的示意。l為上樣操作,2為清洗操作,3為洗脫操作。
      圖2是a-酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS圖。(a)酶解產(chǎn)物不富集直接MS分析;(b)酶解產(chǎn)物利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱富集后MS分析。
      圖3是卩酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS圖。(a)酶解產(chǎn)物不富集直接MS分析;(b)酶解產(chǎn)物利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱富集后MS分析。
      圖4是a-酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱富集后的MALDI-TOF-MS圖。(a)酶解產(chǎn)物溶液中不含尿素、SDS及氯化鈉;(b)酶解產(chǎn)物溶液中含IM尿素;(c)酶解產(chǎn)物溶液中含1%SDS; (d)酶解產(chǎn)物溶液中含1M氯化鈉。
      圖5是不同量的P-酪蛋白與牛血清白蛋白酶解產(chǎn)物混合物直接分析及利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱富集后的MALDI-TOF-MS圖。(a) (5-酪蛋白:牛血清白蛋白,1:1,直接分析;(b) P-酪蛋白:牛血清白蛋白,1:1,富集后分析;(c) P-酪蛋白:牛血清白蛋白,1:10,直接分析;(d)P-酪蛋白:牛血清白蛋白,1:10,富集后分析;(e) P-酪蛋白:牛血清白蛋白,1:100,直接分析;(f) P-酪蛋白:牛血清白蛋白,1:100,富集后分析。
      圖6是30pL牛奶蛋白提取物酶切液利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱富集前后的MALDI-TOF-MS圖。(a)富集前,(b)富集后。
      圖7是與納升級(jí)LC-ESI-MS結(jié)合實(shí)現(xiàn)自動(dòng)在線富集分析磷酸肽。
      具體實(shí)施例方式
      實(shí)施例1
      將0.1MHC1溶液用微量進(jìn)樣泵推入毛細(xì)管柱,以lpL/min左右流速?zèng)_洗10min,然后將毛細(xì)管注滿HC1溶液后用橡膠塞封住末端,常溫靜置30min。將HC1溶液推出,用水沖洗至流出液pH為7左右,將0.1M NaOH溶液注入毛細(xì)管,以lnL/min左右流速?zèng)_洗10min,然后將毛細(xì)管注滿NaOH溶液后用橡膠塞封住末端,常溫靜置2h。將NaOH溶液推出,用水沖洗至流出液pH為7左右。
      將10%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)甲醇溶液(Wv)推入毛細(xì)管中,密封毛細(xì)管兩端,將毛細(xì)管浸入7(TC水浴中加熱8h。然后將APES溶液推出,用20nL甲醇溶液沖洗毛細(xì)管,氮?dú)獯蹈伞?br> 用注射器快速將P0Cl3溶液推入毛細(xì)管柱中,封住末端,常溫反應(yīng)12h。將POCl3溶液推出,用20pL甲醇溶液沖洗毛細(xì)管,氮?dú)獯蹈伞?br> 稱取lmg的ZrOCl2粉末,將其溶于lml水中,則ZrOCl2快速水解,充分振蕩后,用注射器推入石英毛細(xì)管中,靜置反應(yīng)4h。將管中溶液推出,用純水沖洗毛細(xì)管柱至流出液pH為7。
      實(shí)施例2
      將標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)a-酪蛋白質(zhì)的酶切液用50%ACN, 0.1%TFA溶液稀釋至2pmol4iL后,用微量進(jìn)樣泵以0.2pL/min的流速推入磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱(內(nèi)徑50^im,長(zhǎng)150cm)中,共進(jìn)樣20)aL。用50pL的50%ACN, 0.1TFAQ/。溶液及50pL純水以1.0pL/min的流速先后沖洗毛細(xì)管柱內(nèi)壁,以除去內(nèi)壁上黏附的非磷酸肽及鹽等雜質(zhì)。用0.1M氨水溶液lOpL以0.2pL/min流速注入毛細(xì)管柱中洗脫被特異吸附的磷酸肽,將洗脫下的溶液點(diǎn)于MALDI-TOF靶上,自然風(fēng)干后點(diǎn)上DHB溶液(50%ACN, 0.1%H3PO4),待結(jié)晶后進(jìn)行質(zhì)譜分析。不富集時(shí),有很多非磷酸肽出現(xiàn),僅檢測(cè)到7個(gè)磷酸肽,如圖2a,而在利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱富集之后,大部分非磷酸肽被除去,檢測(cè)到了 16個(gè)磷酸肽,如圖2b所示。檢測(cè)到的磷酸肽在圖中進(jìn)行了標(biāo)記。
      6實(shí)施例3
      利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱負(fù)載|3酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物,重復(fù)實(shí)施例2的操作進(jìn)行富集、MALDI-TOF-MS分析。不富集時(shí),信噪比很低,而富集后,大部分非磷酸肽消失,檢測(cè)到兩個(gè)磷酸肽,成為譜圖中兩個(gè)最強(qiáng)的峰,如圖3a-b所示。
      實(shí)施例4
      將分別含1M尿素、1%SDS和lMNaCl的a-酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物20pL (2pmol4iL)分別推入磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱(內(nèi)徑75tim,柱長(zhǎng)50cm),重復(fù)上述富集步驟,進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。同時(shí)利用20|iL不含尿素、SDS和NaCl的a-酪蛋白質(zhì)酶切液進(jìn)行對(duì)照。它們富集效果之間沒有明顯差別,如圖4a-d所示。檢測(cè)到的磷酸肽在圖中進(jìn)行了標(biāo)記。
      實(shí)施例5
      將a-酪蛋白質(zhì)與牛血清白蛋白質(zhì)的酶切肽段溶液分別以物質(zhì)的量比率1:1, 1:10, 1:100的比例相混合,牛血清白蛋白質(zhì)濃度保持2pmol4iL, a-酪蛋白質(zhì)濃度依次降低。利用磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱(內(nèi)徑50pm,柱長(zhǎng)50cm)按照上述步驟對(duì)三種比例的混合物進(jìn)行富集,MALDI-TOF-MS分析。對(duì)a-酪蛋白質(zhì)與牛血清白蛋白質(zhì)以物質(zhì)的量比率1:100比例混合的樣本,仍然可以富集檢測(cè)到4個(gè)磷酸肽,而對(duì)照樣品只能檢測(cè)到1個(gè)磷酸肽,如圖5a-f所示。
      實(shí)施例6
      將30nL牛奶溶于900|aL 50mM的NH4HC03溶液中,振蕩混勻,在16000r/min離心15分鐘。取清液,重復(fù)離心3次。將清液在含有尿素(8M)和DTT U0mM)的溶液中37 °C水浴還原4h,加入IAA (lOmM)暗處放置0.5h進(jìn)行烷基化,37 。C水浴孵育酶解。
      將30pL牛奶蛋白質(zhì)酶切液用微量進(jìn)樣泵以0.3pL/min的流速推入磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱(內(nèi)徑50pm,長(zhǎng)150cm),按照上述步驟進(jìn)行富集,MALDI-TOF-MS分析??梢愿患瘷z測(cè)到10個(gè)磷酸肽,而對(duì)照樣品只能檢測(cè)到4個(gè)磷酸肽,如圖6a-b所示。
      實(shí)施例7
      將磷酸鋯基團(tuán)修飾的開管毛細(xì)管柱(內(nèi)徑5C)^n,長(zhǎng)150cm)接在納升級(jí)LC-ESI-MS液相的預(yù)柱之前,利用自動(dòng)進(jìn)樣器,通過自動(dòng)化的控制軟件,輕松實(shí)現(xiàn)大批量樣本的自動(dòng)上樣、清洗、洗脫及質(zhì)譜分析,如圖7所示。
      權(quán)利要求
      1.一種用于富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的開管毛細(xì)管柱,其特征為內(nèi)壁具有可選擇性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的開管毛細(xì)管柱,其特征為其內(nèi)表面硅羥基與磷酸肽或 磷酸化蛋白質(zhì)吸附材料化學(xué)連接。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的開管毛細(xì)管柱,其特征在于連接的磷酸肽或磷酸化蛋 白質(zhì)吸附材料為磷酸鋯。
      4. 一種富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法,其特征在于包括以下步驟(1) 制備權(quán)利要求1所述的功能性開管毛細(xì)管柱;(2) 將樣品注入到開管毛細(xì)管柱中,孵育以選擇性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì);(3) 將洗脫液注入開管毛細(xì)管柱,對(duì)磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫;(4) 對(duì)洗脫后的磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法,其特征在于步驟 (2)選擇性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)時(shí),可采用連續(xù)注射形式或進(jìn)樣后靜態(tài)孵育。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法,其特征在于步驟 (2)完成后,將清洗液注入開管毛細(xì)管柱,除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白質(zhì)和鹽,再進(jìn)行步驟(3)。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法,其特征在于步驟 (4)為將洗脫后的磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)樣品點(diǎn)于MALDI靶上,加入基質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法,其特征在于步驟 (4)為與電噴霧質(zhì)譜結(jié)合,自動(dòng)在線富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)。
      9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法,其特征在于自 動(dòng)在線富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)分析時(shí)使用微升或納升級(jí)電噴霧質(zhì)譜。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種功能化修飾的開管毛細(xì)管柱離線及在線富集磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的方法制備一種內(nèi)壁具有可選擇性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)的磷酸鋯功能基團(tuán)的開管毛細(xì)管柱,負(fù)載樣品后可以對(duì)磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行富集,再利用清洗緩沖液除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白質(zhì)和鹽,清洗完成后利用洗脫液對(duì)磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫,洗脫的磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)可點(diǎn)在MALDI靶上,進(jìn)行正常的MALDI-TOF-MS分析。也可以接在微升或納升級(jí)LC-ESI-MS的液相部分上,結(jié)合ESI-MS/MS自動(dòng)在線富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白質(zhì)。
      文檔編號(hào)G01N1/40GK101685051SQ20081021172
      公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月23日
      發(fā)明者衛(wèi)軍營(yíng), 張養(yǎng)軍, 薛彥峰, 錢小紅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1