專利名稱：煙草及煙草制品中六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的測定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留的理化檢驗技術領域，主要涉及煙草及煙草制品中止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈等六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的測定技術，具體說是一種在加速溶劑萃取儀(ASE)中萃取農(nóng)藥殘留，以氣相色譜(配電子俘獲檢測器(ECD))直接測定煙草及煙草制品中六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的方法。

背景技術：
煙草作為吸食品，其農(nóng)藥殘留量問題已成為吸煙安全性問題中的重要組成部分，煙草及煙草制品農(nóng)藥殘留量指標是各國在煙草制品質量控制中的重要內(nèi)容，已成為國際市場煙葉評價和選購的重要因素，也是煙草國際貿(mào)易中進行商品檢驗的重要內(nèi)容。二硝基苯胺類農(nóng)藥是煙草農(nóng)殘檢測的重要指標，國際煙草科學研究合作中心(CORESTA)農(nóng)用化學品委員會(ACAC)在2003年提出了煙草及煙草制品中包括止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈等6種二硝基苯胺類農(nóng)藥在內(nèi)的99種農(nóng)藥的推薦性農(nóng)殘限量。GB/T 13595-200中華人民共和國國家標準GB/T 13596-2004煙草及煙草制品擬除蟲菊酯殺蟲劑、有機磷殺蟲劑、含氮農(nóng)藥殘留量的測定規(guī)定了煙草及煙草制品中的氟節(jié)胺、止芽素、異丙樂靈和二甲戊靈等4種二硝基苯胺類農(nóng)藥的測定方法，為該類農(nóng)藥殘留量的檢測提供了的分析依據(jù)，但該法采用丙酮高速勻漿提取提取煙草中的農(nóng)藥殘留，用乙酸乙酯和環(huán)己烷進行液/液分配，凝膠滲透色譜和硅膠柱層析凈化，以氣相色譜法(ECD檢測器)和氣相色譜/質譜法測定，操作步驟比較繁雜，且使用大量有機溶劑，對實驗人員毒性較大；HarbJ等HAIBJ，HOFERI，RENAUD J M.Analysis of multiple pesticide residues in tobacco usingpressurized liquid extraction automated solid-phase extraction clean-upand gas chromatography-tandem mass spectrometry.J.Chromatogr.A，2003，1020173-187.介紹了在加速溶劑萃取儀(ASE)中將煙末和硅藻土混合，以丙酮萃取煙草中的農(nóng)藥殘留，萃取液經(jīng)過兩步固相萃取凈化后，以GC-MS-MS檢測煙草中的止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈，為該類農(nóng)藥殘留量的檢測提供了的分析依據(jù)，但該法在加速溶劑萃取儀(ASE)中完成萃取步驟后，需要對萃取液進行濃縮，然后以兩步固相萃取凈化，實驗步驟相對繁瑣，且儀器GC-MS-MS價格昂貴，普及性差。未見煙草中此類農(nóng)藥檢測的其它文獻報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種采用加速溶劑萃取儀(ASE)萃取煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留，無需對萃取液進行進一步處理，直接以氣相色譜(配ECD檢測器)測定煙草及煙草制品中止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈等六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的測定方法，該方法能快速、準確檢測煙草及煙草制品中六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量，測定結果準確、測定干擾少。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的本發(fā)明的煙草及煙草制品中六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的測定方法包括以下步驟 a、處理弗羅里硅土將弗羅里硅土在馬弗爐中550℃灼燒5h，在無干燥劑的干燥器中冷卻后，加入5％(質量分數(shù))的水混合均勻，并置于密閉玻璃容器中平衡至少48h； b、內(nèi)標溶液的配制使用滅蟻靈標準品作為內(nèi)標物，以正己烷溶解配制成100μg/mL的內(nèi)標溶液； c、稱取樣品準確稱取等量的煙末和弗羅里硅土，將二者研磨、混勻，轉移至底部放一層纖維濾紙和弗羅里硅土的不銹鋼萃取池中； d、ASE萃取將不銹鋼萃取池放置于ASE儀器上，進行農(nóng)藥萃?。? e、萃取液處理在萃取液經(jīng)加入10μL內(nèi)標溶液，并經(jīng)無水Na2SO4干燥后，即為樣品待測液； f、準備標準工作溶液分別稱取0.02g六種農(nóng)藥標準品止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈到各自的100mL容量瓶中，用正己烷稀釋并最終配制成具有濃度梯度的各種農(nóng)藥的標準工作溶液； g、氣相色譜測定吸取配制好的不同濃度的農(nóng)藥標準工作溶液，注入氣相色譜儀(配ECD檢測器)； h、農(nóng)藥殘留量測定結果的計算 以內(nèi)標法進行農(nóng)藥殘留量的定量分析，即以農(nóng)藥和內(nèi)標滅蟻靈的色譜峰面積比對其相應濃度進行回歸分析，得到標準曲線，相關系數(shù)大于等于0.99，對提取后的樣品進行測定，測得檢出農(nóng)藥和內(nèi)標滅蟻靈的色譜峰面積比，代入標準曲線，求得樣品中的止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈等農(nóng)藥的殘留量。
在本發(fā)明中，ASE的儀器參數(shù)設置為萃取溶劑正己烷，溫度80℃，壓力1500psi，加熱時間5min，靜態(tài)時間5min，沖洗體積60％(萃取池體積)，氮氣吹掃時間60s，靜態(tài)循環(huán)次數(shù)2次。
標準工作溶液的配制方式如下分別稱取0.02g每種農(nóng)藥標準品到各自的100mL容量瓶中，精確至0.0001g，用正己烷稀釋定容，配制成濃度約為200μg/mL的每種農(nóng)藥單一標準儲備液；移取各農(nóng)藥單一標準儲備液2.5mL于100mL容量瓶中，用正己烷稀釋定容，得到各農(nóng)藥標準品濃度約為5μg/mL的混合儲備液；分別移取一定體積的混合儲備液于20mL容量瓶中，加入10μL內(nèi)標溶液，用正己烷稀釋定容，即配制成不同濃度的農(nóng)藥標準工作溶液，標準序列0.0125μg/mL，0.025μg/mL，0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1.25μg/mL和2.5μg/mL；按稱取5.00g煙草樣品算，即得到標準序列0.05μg/g，0.10μg/g，0.50μg/g，1.00μg/g，2.00μg/g，5.00μg/g和10.00μg/g。
在氣相色譜測定時，采用的GC條件為色譜柱DB-35熔融石英毛細管柱，柱長30m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.25μm；使用不分流模式，進樣口溫度230℃，進樣量1μL；程序升溫50℃持續(xù)1min，以25℃/min的速度升至150℃，然后以5℃/min的速度升至260℃，持續(xù)5min，再以10℃/min的速度升至290℃，持續(xù)15min；載氣為氮氣，恒速1.2mL/min。
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術樣品處理方法的不足，針對煙草樣品優(yōu)化了樣品前處理方法和儀器檢測條件。與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果 (1)本發(fā)明方法樣品前處理過程簡單，自動化程度高，大大縮短了每個煙草樣品的萃取前處理時間。Harb J等的方法利用加速溶劑萃取技術，具有操作簡便、省時省溶劑和減少有機溶劑對環(huán)境的污染等特點，但是他們是將煙末和硅藻土混合，硅藻土只能起到分散煙末樣品的作用，本發(fā)明方法將煙末直接與適量的固體基質弗羅里硅土研磨、混勻，裝入萃取池中，并將適量的弗羅里硅土至于萃取池的最下端，弗羅里硅土既起到分散煙末樣品，提高萃取效率的作用，又能對煙草中的色素及煙草植物組織的其他共萃物起到較好的吸附凈化作用，這樣就將樣品的提取和凈化一步完成，即避免了樣品轉溶、濃縮、凈化等過程造成的待測農(nóng)藥組分損失，又使實驗操作更加簡單、快捷。
(2)Harb J等的方法采用丙酮萃取煙草中的農(nóng)藥，丙酮萃取出的雜質較多，需要繁雜的凈化步驟；本發(fā)明方法采用非極性的正己烷為萃取溶劑，即保證了低級性的止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈等六種二硝基苯胺類農(nóng)藥的萃取效率，又能最小程度地減少煙草中色素等雜質的干擾，從而使前處理過程變得比較簡單。
(3)本發(fā)明方法利用內(nèi)標法定量，通過內(nèi)標物的加入，利用組分的相對峰面積值進行一些量化數(shù)據(jù)的計算，可以不用定容，且可以減少由前處理方法重現(xiàn)性和儀器精密度問題帶來的誤差。本文選擇已不再使用的殺蟲劑滅蟻靈作為內(nèi)標。
(4)本發(fā)明方法具有操作準確、靈敏度高及重復性好的優(yōu)點。
①本發(fā)明方法的檢測限 將不同濃度的止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈農(nóng)藥標準工作溶液注入GC-ECD，以3倍信噪比(S/N＝3)計算檢測限(LOD)，檢測限在0.01μg/g-0.03μg/g之間。
②本發(fā)明方法的重復性和加標回收率 在煙草樣品中加入止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈農(nóng)藥的標準溶液，然后分別進行前處理和GC-ECD分析，并按照加標量和測定值計算其回收率，結果見表1。由表1可以看出，六種二硝基苯胺類農(nóng)藥的回收率在90.0％-98.1％之間，平均相對標準偏差(RSD)在為2.9-6.5之間，說明本發(fā)明方法的回收率高，重復性好。
表1 六種二硝基苯胺類農(nóng)藥的回收率和重復性(n＝6)



附圖為本發(fā)明的測定方法流程圖(該圖作為摘要附圖)。

具體實施例方式 本發(fā)明以下結合實例做進一步描述，但并不是限制本發(fā)明。
實例1 1.儀器與試劑 農(nóng)藥止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈，內(nèi)標滅蟻靈，均為標準品；無水Na2SO4，分析純；正己烷(農(nóng)殘級)；弗羅里硅土(Florisil，60目-100目，農(nóng)殘級)。
Agilent 6890N氣相色譜儀，配備ECD檢測器；ASE-200型加速溶劑萃取儀(美國Dionex公司)；AE 163電子天平(感量0.0001g)和AE166電子天平(感量0.01g)(瑞士Mettler公司)。
2.樣品處理 無水硫酸鈉用前在馬弗爐中550℃烘4h。
弗羅里硅土將弗羅里硅土在馬弗爐中550℃灼燒5h，在無干燥劑的干燥器中冷卻后，加入5％(質量分數(shù))的水混合均勻，并置于密閉玻璃容器中平衡至少48h。
準確稱取5g煙末(精確至0.01g)和5g弗羅里硅土(5±0.05g)，將二者研磨、混勻，轉移至底部放一層纖維濾紙和5g弗羅里硅土(5±0.05g)的33mL不銹鋼萃取池中。將33mL不銹鋼萃取池放置于ASE儀器上，進行農(nóng)藥萃取，ASE的儀器參數(shù)設置為萃取溶劑正己烷，溫度80℃，壓力10Mpa(1500psi)，加熱時間5min，靜態(tài)時間5min，沖洗體積60％(萃取池體積)，氮氣吹掃時間60s，靜態(tài)循環(huán)次數(shù)2次。萃取液經(jīng)無水Na2SO4干燥后，加入10μL內(nèi)標溶液(濃度為100μg/mL)，即為樣品待測液。
3.準備標準工作溶液分別稱取0.02g每種農(nóng)藥標準品到各自的100mL容量瓶中，精確至0.0001g，用正己烷稀釋定容，配制成濃度約為200μg/mL的每種農(nóng)藥單一標準儲備液；移取各農(nóng)藥單一標準儲備液2.5mL于100mL容量瓶中，用正己烷稀釋定容，得到各農(nóng)藥標準品濃度約為5μg/mL的混合儲備液；分別移取一定體積的混合儲備液于20mL容量瓶中，加入10μL內(nèi)標溶液，用正己烷稀釋定容，即配制成不同濃度的農(nóng)藥標準工作溶液，標準序列0.0125μg/mL，0.025μg/mL，0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1.25μg/mL和2.5μg/mL。按稱取5.00g煙草樣品算，即得到標準序列0.05μg/g，0.10μg/g，0.50μg/g，1.00μg/g，2.00μg/g，5.00μg/g和10.00μg/g。
4.測定方法將配制好的不同濃度的農(nóng)藥標準工作溶液注入GC-ECD，以農(nóng)藥和內(nèi)標滅蟻靈的色譜峰面積比對其相應濃度進行回歸分析，得到標準曲線。對提取后的樣品待測液進行測定，測得農(nóng)藥和內(nèi)標滅蟻靈的色譜峰面積比，代入標準曲線，求得樣品中的氟節(jié)胺和二甲戊靈含量分別為0.20μg/g和0.64μg/g。
采用的GC條件為色譜柱DB-35熔融石英毛細管柱，柱長30m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.25μm；使用不分流模式，進樣口溫度230℃，進樣量1μL；程序升溫50℃持續(xù)1min，以25℃/min的速度升至150℃，然后以5℃/min的速度升至260℃，持續(xù)5min，再以10℃/min的速度升至290℃，持續(xù)15min；載氣為氮氣，恒速1.2mL/min。
為判斷方法的準確性，在此煙葉樣品中加入0.23μg/g的氟節(jié)胺和0.60μg/g的二甲戊靈標準溶液，進行同上的樣品前處理，以GC/MS測得氟節(jié)胺、二甲戊靈和內(nèi)標滅蟻靈的色譜峰面積比，代入標準曲線，求得此時樣品中的氟節(jié)胺和二甲戊靈含量為0.41μg/g和1.21μg/g，即氟節(jié)胺和二甲戊靈的加標回收率為93.3％和94.5％，說明此方法是準確的。
實例2 如實施例1所述，選擇另一煙葉樣品，測得樣品中止芽素和氟節(jié)胺的殘留量分別為0.86μg/g和0.13μg/g。
實例3 如實施例1所述，選擇另一煙葉樣品，測得樣品中異丙樂靈和二甲戊靈的殘留量分別為0.77μg/g和4.02μg/g。
實例4 如實施例1所述，選擇另一煙葉樣品，測得樣品中氟樂靈含量為0.39μg/g。
權利要求
1、一種煙草及煙草制品中六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的測定方法，其特征在于該測定方法包括以下步驟
a、處理弗羅里硅土將弗羅里硅土在馬弗爐中550℃灼燒5h，在無干燥劑的干燥器中冷卻后，加入5％(質量分數(shù))的水混合均勻，并置于密閉玻璃容器中平衡至少48h；
b、內(nèi)標溶液的配制使用滅蟻靈標準品作為內(nèi)標物，以正己烷溶解配制成100μg/mL的內(nèi)標溶液；
c、稱取樣品準確稱取等量的煙末和弗羅里硅土，將二者研磨、混勻，轉移至底部放一層纖維濾紙和弗羅里硅土的不銹鋼萃取池中；
d、ASE萃取將不銹鋼萃取池放置于ASE儀器上，進行農(nóng)藥萃?。?br> e、萃取液處理在萃取液經(jīng)加入10μL內(nèi)標溶液，并經(jīng)無水Na2SO4干燥后，即為樣品待測液；
f、準備標準工作溶液分別稱取0.02g六種農(nóng)藥標準品止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈到各自的100mL容量瓶中，用正己烷稀釋并最終配制成具有濃度梯度的各種農(nóng)藥的標準工作溶液；
g、氣相色譜測定吸取配制好的不同濃度的農(nóng)藥標準工作溶液，注入氣相色譜儀(配ECD檢測器)；
h、農(nóng)藥殘留量測定結果的計算
以內(nèi)標法進行農(nóng)藥殘留量的定量分析，即以農(nóng)藥和內(nèi)標滅蟻靈的色譜峰面積比對其相應濃度進行回歸分析，得到標準曲線，相關系數(shù)大于等于0.99，對提取后的樣品進行測定，測得檢出農(nóng)藥和內(nèi)標滅蟻靈的色譜峰面積比，代入標準曲線，求得樣品中的止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈等農(nóng)藥的殘留量。
2、根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于ASE的儀器參數(shù)設置為萃取溶劑正己烷，溫度80℃，壓力1500psi，加熱時間5min，靜態(tài)時間5min，沖洗體積60％(萃取池體積)，氮氣吹掃時間60s，靜態(tài)循環(huán)次數(shù)2次。
3、根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于標準工作溶液的配制方式如下分別稱取0.02g每種農(nóng)藥標準品到各自的100mL容量瓶中，精確至0.0001g，用正己烷稀釋定容，配制成濃度約為200μg/mL的每種農(nóng)藥單一標準儲備液；移取各農(nóng)藥單一標準儲備液2.5mL于100mL容量瓶中，用正己烷稀釋定容，得到各農(nóng)藥標準品濃度約為5μg/mL的混合儲備液；分別移取一定體積的混合儲備液于20mL容量瓶中，加入10μL內(nèi)標溶液，用正己烷稀釋定容，即配制成不同濃度的農(nóng)藥標準工作溶液，標準序列0.0125μg/mL，0.025μg/mL，0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1.25μg/mL和2.5μg/mL；按稱取5.00g煙草樣品算，即得到標準序列0.05μg/g，0.10μg/g，0.50μg/g，1.00μg/g，2.00μg/g，5.00μg/g和10.00μg/g。
4、根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于采用的GC條件為色譜柱DB-35熔融石英毛細管柱，柱長30m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.25μm；使用不分流模式，進樣口溫度230℃，進樣量1μL；程序升溫50℃持續(xù)1min，以25℃/min的速度升至150℃，然后以5℃/min的速度升至260℃，持續(xù)5min，再以10℃/min的速度升至290℃，持續(xù)15min；載氣為氮氣，恒速1.2mL/min。
全文摘要
本發(fā)明屬于煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留的理化檢驗技術領域，具體說是一種煙草及煙草制品中六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的測定方法，該方法是在加速溶劑萃取儀(ASE)中萃取農(nóng)藥殘留，以氣相色譜(配電子俘獲檢測器(ECD))直接測定煙草及煙草制品中止芽素、氟節(jié)胺、異丙樂靈、二甲戊靈、乙丁氟靈和氟樂靈等六種二硝基苯胺類農(nóng)藥殘留量的方法。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術樣品處理方法的不足，針對煙草樣品優(yōu)化了樣品前處理方法和儀器檢測條件，與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果本發(fā)明方法樣品前處理過程簡單，可減少煙草中色素等雜質的干擾，整個操作自動化程度高，并具有操作準確、靈敏度高及重復性好的優(yōu)點。
文檔編號G01N30/00GK101393183SQ20081023065
公開日2009年3月25日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權日2008年10月30日
發(fā)明者邊照陽, 唐綱嶺, 張洪非, 李中皓, 進 楊, 侯宏衛(wèi), 龐永強, 胡清源 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院