專(zhuān)利名稱(chēng)：：Hiv病毒抗原及配體管式pcr檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：早期蛋白質(zhì)檢測(cè)是以抗體同特定待檢物蛋白質(zhì)的低解離常數(shù)和一定的特異性為基礎(chǔ)，采用簡(jiǎn)易方便的篩選方法——抗體捕捉法。該法是檢測(cè)樣品中有無(wú)抗原首先將抗原包被于固相支持物，然后用抗體去結(jié)合抗原形成復(fù)合物，沖洗去掉未結(jié)合的抗體，最后用和結(jié)合抗體特異識(shí)別的標(biāo)記分子去檢測(cè)結(jié)合抗體；也可以抗原、抗體先反應(yīng)形成復(fù)合物后，再結(jié)合到固相支持物上，然后檢測(cè)復(fù)合物。許多抗體捕捉法是利用間接法來(lái)檢測(cè)抗體，如檢測(cè)抗體是鼠抗體，則檢測(cè)分子可能是帶檢測(cè)標(biāo)記的兔抗鼠抗體，所用的傳統(tǒng)檢測(cè)標(biāo)記包括放射性同位素、染料和作用于底物產(chǎn)生可檢測(cè)分子如色原的酶。酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)是廣為人知的免疫檢測(cè)法，傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)似三明治夾心法，即兩抗體共同結(jié)合到某一抗原——捕捉抗體，將其同樣品中的抗原結(jié)合，再加入同抗原結(jié)合的偶連酶的檢測(cè)抗體，然后反應(yīng)形成捕捉抗體一抗原一檢測(cè)抗體"三明治"復(fù)合物，最后測(cè)偶連酶活性顯示檢測(cè)結(jié)果。雖然抗體檢測(cè)法具有較大的應(yīng)用價(jià)值，但是它的檢測(cè)范圍受捕捉抗體和抗原反應(yīng)的解離常數(shù)(Kd)值限制。在實(shí)踐中，檢測(cè)低限大約是Kd值的iy。，當(dāng)待分析物濃度降低到這個(gè)可能檢測(cè)極限時(shí)，所捕捉到的待分析物抗體百分率將不足以產(chǎn)生相對(duì)于信噪比的可檢測(cè)信號(hào)。因此，用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系的抗體檢測(cè)法的檢測(cè)下限約lpg/ml(10-4M對(duì)平均分子量50，OOO道爾頓的蛋白質(zhì))。隨著基因技術(shù)應(yīng)用的快速發(fā)展，在抗原抗體檢測(cè)方面已有較多的基因檢測(cè)技術(shù)。核酸待測(cè)物的檢測(cè)要求不同于抗體檢測(cè)的技術(shù)。在二十世紀(jì)八十年代中期，DNA技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)了通過(guò)酶重復(fù)擴(kuò)增過(guò)程可擴(kuò)增DNA的方法，后來(lái)叫聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR):首先加入兩互補(bǔ)的寡核苷酸序列(叫引物)，它將結(jié)合在所要擴(kuò)增的區(qū)域的兩側(cè)，然后加熱變性，在降溫退火過(guò)程中讓引物同互補(bǔ)序列結(jié)合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I以延伸引物，通過(guò)重復(fù)變性、退火、延伸所希望的片段，目標(biāo)DNA就會(huì)以指數(shù)方式擴(kuò)增。PCR曾經(jīng)過(guò)許多改進(jìn)，一個(gè)重要的變化是耐熱聚合酶(即Taq聚合酶)的應(yīng)用，它產(chǎn)于溫泉中嗜熱菌，具有熱穩(wěn)定性，幾乎不被PCR變性中高溫影響，所以不必像應(yīng)用不耐熱的Klenow聚合酶I，每一次變性后得補(bǔ)加聚合酶。在以PCR作為擴(kuò)增系統(tǒng)的運(yùn)用中，產(chǎn)生了免疫-PCR方法。該法是把特定待測(cè)物連接到微孔板上，然后用PCR擴(kuò)增放大能力來(lái)檢測(cè)——例如小牛血清白蛋白(BSA)被動(dòng)吸附到一免疫檢測(cè)板上，加入對(duì)BSA的特異抗體(連有蛋白A鏈親和素融合蛋白及生物素標(biāo)記的報(bào)告擴(kuò)增子)，PCR后用瓊脂糖電泳分析報(bào)告擴(kuò)增子，可檢測(cè)到幾百個(gè)BSA分子，但這種方法不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，同時(shí)因?yàn)槿狈Υ郎y(cè)物的特異捕捉分子，也不能用于生物樣品檢測(cè)。為此，人們不斷對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)首先用生物素化第二抗體和一個(gè)連接生物素化報(bào)告擴(kuò)增子的鏈親和素融合蛋白，然而5種試劑的加入、洗板、擴(kuò)增、檢測(cè)很費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且解離復(fù)雜；隨后又把報(bào)告擴(kuò)增子共價(jià)連到第二抗體上，雖然直接連接減少了試劑數(shù)目和解離復(fù)雜性，但仍需要PCR操作，勞動(dòng)強(qiáng)度和試驗(yàn)室污染的可能性還是無(wú)法降低。三明治式免疫-PCR是由傳統(tǒng)ELISA方式的改編而來(lái)，即檢測(cè)抗體連有DNA標(biāo)記，再運(yùn)用到分析檢測(cè)生物樣品。早期的抗體免疫-PCR檢測(cè)形式是將初級(jí)抗體固定在平板上，然后依次加入樣品，再用生物素化檢測(cè)抗體，鏈親和素和生物素化的DNA;后來(lái)改進(jìn)為直接連接DNA到抗體上和用標(biāo)記引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而PCR的擴(kuò)增能力可產(chǎn)生大量DNA標(biāo)記，這種DNA標(biāo)記可用典型的凝膠電泳檢測(cè)分析。PCR擴(kuò)增抗體攜帶的DNA標(biāo)記可提高對(duì)抗原檢測(cè)的靈敏度(該法缺少用基因芯片法來(lái)檢測(cè))，比傳統(tǒng)ELISA方法的靈敏度還高，但用凝膠電泳純化擴(kuò)增產(chǎn)物需要大量人工操作，因此耗時(shí)；而且用于PCR擴(kuò)增的引物在退火時(shí)可引起二聚體擴(kuò)增產(chǎn)生副產(chǎn)品；同時(shí)它還存在污染核糖或污染也將同樣被擴(kuò)增的情況。免疫PCR方法是采用一個(gè)捕捉抗體，類(lèi)似于直接ELISA三明治夾心法,不同點(diǎn)在于選擇檢測(cè)方法。該方法已被成功用于檢測(cè)腫瘤壞死因子、e-半乳糖甘酶、人甲狀腺刺激激素、鼠可溶T-細(xì)胞受體、重組乙肝表面抗原、不同的人心鈉素、e-葡糖苷激酶、絨毛膜促性腺激素等物質(zhì)，有的敏感度達(dá)10'15摩爾水平。在免疫PCR方法中，抗原濃度通常由PCR后產(chǎn)物分析決定，可以是凝膠電泳分析，也可以是PCR-ELISA分析。定量分析PCR終點(diǎn)產(chǎn)物的DNA標(biāo)記易產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果，因?yàn)楫a(chǎn)物形成率在幾個(gè)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)循環(huán)后即下降，再者PCR樣品處理可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染；另外，這些實(shí)驗(yàn)由于步驟多且需沖洗，因此在這個(gè)過(guò)程中抗原抗體復(fù)合物可能會(huì)出現(xiàn)解離。實(shí)時(shí)定量PCR是更先進(jìn)的PCR技術(shù)，己用于核酸分析。在實(shí)時(shí)PCR中，PCR擴(kuò)增DNA是在非線(xiàn)性標(biāo)記、雙熒光雜交探針存在條件下進(jìn)行，其中一種熒光染料用作報(bào)告分子,它的發(fā)射光譜被第二種熒光染料淬滅;該實(shí)時(shí)PCR在鏈延伸時(shí)，報(bào)告染料位于雜交探針5'端(FAM)，淬滅染料位于3'端(TAMRA)，此探針和PCR擴(kuò)增的特殊靶序列結(jié)合，當(dāng)未結(jié)合時(shí)，5'端FAM發(fā)射的熒光被3'TAMRA淬滅，但隨著PCR循環(huán)增加，擴(kuò)增子增多，雜交探針被Taq多聚酶5'-3'核酸活性切割，結(jié)果使報(bào)告熒光染料從淬滅染料中釋放出來(lái)，致報(bào)告分子發(fā)射峰值增加。序列檢測(cè)系統(tǒng)用氬原子激光激活熒光(488nm)，激光裝置照相機(jī)監(jiān)控PCR反應(yīng)，收集從所有96孔發(fā)出的500nm-660nm熒光，然后利用相應(yīng)原理、設(shè)立內(nèi)參照，直接通過(guò)一定的軟件分析定量。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)整個(gè)反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)控，同時(shí)也可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR。由于序列檢測(cè)系統(tǒng)用96孔熱循環(huán)儀可連續(xù)檢測(cè)每孔中PCR反應(yīng)時(shí)的熒光譜，因此，可排除復(fù)制子試驗(yàn)室污染。Gold等在1995年(GoldL，etal.AnnuRevBiochem(生物化學(xué)年報(bào))，64:763—797)應(yīng)用SELEX篩選出的系統(tǒng)性紅斑狼瘡特異抗體的RNA和ssDNA配基，不僅對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡進(jìn)行診斷，而且可以進(jìn)行病情監(jiān)測(cè)和療效檢驗(yàn)；Gold等又在1999年(GoldL，etal.DiagnDec(診斷)；4(4):381-8)在配基微陣分子診斷應(yīng)用研究中，對(duì)配基微陣分辨率進(jìn)行了研究。上述研究均顯示出核酸配基檢測(cè)具有巨大的應(yīng)用前景，但是目前的配基檢測(cè)都是采用直接對(duì)配基PCR擴(kuò)增放大檢測(cè)，這種檢測(cè)操作復(fù)雜，不但需要將配體和配基分離，而且由于配體和配基分離后，配基純度及殘留配體和配基的再結(jié)合可以阻斷DNA復(fù)制，因此導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度低和準(zhǔn)確性差。核酸與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)相互作用是普遍現(xiàn)象，核酸能折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這對(duì)其與蛋白質(zhì)相互結(jié)合作用非常重要，通過(guò)使核苷酸序列多樣化而使體外檢測(cè)核酸蛋白質(zhì)相互作用方法成熟。指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX)被用來(lái)分離所選靶目標(biāo)的核苷酸配體，這些配體被稱(chēng)為配基或適配體，意即核酸可以形成一定結(jié)構(gòu)并適配入靶分子的口袋，SELEX技術(shù)就是利用該原理篩選耙分子配基的方法。利用SELEX技術(shù)，許多靶標(biāo)的核苷酸配基己被篩選出，尤其是已知能和核酸結(jié)合的許多蛋白質(zhì)可作為SELEX技術(shù)的較合適靶標(biāo)，如T4DNA聚合酶、噬菌體R17被膜蛋白、大腸桿菌rho因子、大腸桿菌核糖體蛋白S1、苯丙氨酸-tRNA合成酶、識(shí)別RNA的自身免疫抗體、E2F轉(zhuǎn)錄因子及不同的HIV相關(guān)蛋白。SELEX技術(shù)可篩選出許多不同蛋白配基的事實(shí)引發(fā)了配基應(yīng)用的拓展，這些配基可作為單抗和多抗產(chǎn)品的替代品應(yīng)用于診斷和治療，如DNA聚合酶的配基已被用于熱啟動(dòng)PCR來(lái)診斷低拷貝的復(fù)制子，提高PCR敏感性和保真性；同時(shí)配基也被用于促進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，如中性彈性蛋白的酶配體熒光標(biāo)記用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)彈性酶濃度，中性彈性蛋白酶配基用于鼠肺炎癥診斷模型體內(nèi)診斷。在酶聯(lián)寡核苷酸方法中，一個(gè)或多個(gè)抗體被對(duì)抗原有高親和力、高特異性的配基取代，這樣的配基可通過(guò)SELEX技術(shù)體外篩選獲得。美國(guó)專(zhuān)利WO96/40991和WD97/38134中描述了酶聯(lián)寡核苷酸方法，其中用核苷酸配基代替夾心法中的檢測(cè)抗體或捕捉抗體；同時(shí)也提到捕捉分子-耙分子-檢測(cè)分子復(fù)合物中核酸配基PCR擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)。該方法利用常用報(bào)告分子如酶、生物素等的PCR引物來(lái)擴(kuò)增擴(kuò)增子，這樣在提高配體數(shù)量的同時(shí)，還需要進(jìn)一步增加把擴(kuò)增的配基和不純的核苷酸引物二聚體分離的步驟。DNA和RNA配基也存在著這樣的問(wèn)題。另外，夾心法用傳統(tǒng)的酶聯(lián)檢測(cè)抗體檢測(cè)捕捉分子-抗原復(fù)合物，然后用報(bào)告酶分子標(biāo)記寡核苷酸，這需要化學(xué)合成步驟和額外的勞動(dòng)，同時(shí)用來(lái)標(biāo)記的引物不能解決不純問(wèn)題和引物二聚體擴(kuò)增問(wèn)題，因此，無(wú)法解決定量檢測(cè)的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高靈敏度、快速、可定量檢測(cè)的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種簡(jiǎn)便易行的HIV病毒抗原8及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法。本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒，包括-PCR管為聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒靶分子的抗體或配基；—檢測(cè)試劑A液和B液，用于獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒配體/抗原檢測(cè)；一標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣品；一陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品。一種用于如上所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的A液，其特征在于它由100ul、pH值為7.4的25pmol/ul帶有人為序列修飾的檢測(cè)配基和2ug/ml抗體的磷酸鹽緩沖液組成。所述人為序列修飾的檢測(cè)配基是指人為在配基的3'和5'端分別或同時(shí)加上已知序列的單鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)和兩條互補(bǔ)雙鏈。一種用于如上所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的B液，其特征在于它由lul上游引物、lul下游引物、8ul4XdNTP、lOullOXPCR緩沖液、2-5單位的耐熱DNA聚合酶和水組成；其中上游引物序列為l:5'-TCTAACGTGAATGATAG-3，；下游引物序列為2:5，國(guó)TATGGTCGAATAAGTTAA國(guó)3,。該B液還含有分子信標(biāo)。所述的分子信標(biāo)是修飾序列的莖環(huán)分子信標(biāo)、SYBRGreen1熒光染料及帶有熒光分子和淬滅分子的探針?lè)肿有艠?biāo)中的任意一種。一種制備如上所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的方法，包括以下步驟(1)在37土rC下、用體積濃度為120。/。的戊二醛處理PCR管，使戊二醛附著在PCR管；(2)用超純水清洗PCR管；(3)將捕捉HIV靶分子的配基/抗體包被在PCR管上；(4)用pH值為7.4的含5。/。的脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液封閉PCR管，經(jīng)干燥得PCR管；(5)配制檢測(cè)試劑A液將檢測(cè)HIV病毒的抗體和經(jīng)序列修飾的抗體特異寡核苷酸配基在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中孵育并通過(guò)紫外線(xiàn)交聯(lián)，或用磷酸鹽緩沖液溶解配基即可；(6)配制檢測(cè)試劑B液將B液各組分混合后加水即得；(7)將干燥后的PCR管、檢測(cè)試劑A液和B液與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣品、陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品組裝，放入試劑盒即可。所述步驟(3)中的配基包被在PCR管上是指先將鏈酶親和素包被在PCR管上，再加入帶有生物素的配體捕捉配基，通過(guò)鏈酶親和素和生物素的結(jié)合，使捕捉配基固著在PCR管上。所述步驟(3)中的抗體包被在PCR管上是指將單克隆抗體用pH值為9.6的碳酸氫鈉緩沖液包被在PCR管上。一種如上所述的fflV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，包括以下步驟①設(shè)置陰性和和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；②待測(cè)樣品的制備；③在PCR管中加入待測(cè)樣品和陰陽(yáng)對(duì)照樣品，在37土rC孵育45~120分鐘；④將步驟③中孵育后的PCR管用洗液沖洗；⑤在PCR管中加入A液，在37土rC孵育45120分鐘；⑥將步驟⑤中孵育后的PCR管用洗液沖洗；⑦在PCR管中加入B液后再加入標(biāo)準(zhǔn)品，采用實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。所述步驟④和⑥中的洗液是指pH值為7.4、含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述步驟⑦中的實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)的標(biāo)記物選自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、熒光和同位素中的一種或多種。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明利用聚苯乙烯制成的PCR管經(jīng)戊二醛處理后，可附著核酸配體(或抗原、抗體及配基等)，通過(guò)特異寡核苷酸配基(或攜帶信號(hào)分子的特異寡核苷酸配基)與配體直接結(jié)合，將配體信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸配基信號(hào)，然后經(jīng)PCR(或滾環(huán)復(fù)制)擴(kuò)增放大、檢測(cè)，來(lái)測(cè)定配體，因此其檢測(cè)配體具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、多配體微陣檢測(cè)和可機(jī)械化完成的特點(diǎn)。2、由于本發(fā)明是利用連接在抗體或配基上的人為修飾DNA或RNA序列作為信號(hào)分子，該修飾DNA或RNA序列具有一對(duì)引物和中間的人為標(biāo)記序列，針對(duì)被檢測(cè)的靶分子和檢測(cè)目的的要求這一對(duì)引物可以相同也可以不相同，中間的標(biāo)記序列是靶分子的標(biāo)記，因此通過(guò)對(duì)信號(hào)修飾序列的PCR擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或配體的檢測(cè)。3、由于本發(fā)明在使用過(guò)程中是通過(guò)采用實(shí)時(shí)定量-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)或寡核苷酸芯片檢測(cè)來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理的，同時(shí)通過(guò)對(duì)DNA或RNA修飾序列的變換來(lái)達(dá)到數(shù)據(jù)的效正，因此可有效進(jìn)行單一樣品或多種樣品的檢測(cè)。4、由于本發(fā)明在使用過(guò)程中所進(jìn)行的數(shù)據(jù)采集和處理都在PCR管內(nèi)一次性完成，無(wú)須將產(chǎn)物轉(zhuǎn)換地方，進(jìn)行提純、檢測(cè)等步驟，并且PCR產(chǎn)物可在PCR管內(nèi)封閉銷(xiāo)毀，因此操作過(guò)程簡(jiǎn)單、安全、可有效避免逸出產(chǎn)物所造成的環(huán)境污染。5、本發(fā)明由于在反應(yīng)時(shí)只需將配體和配基室溫孵育45分鐘就能完成配體和配基的結(jié)合反應(yīng)，因此操作簡(jiǎn)便，便于一般實(shí)驗(yàn)室或臨床檢驗(yàn)科室的普及應(yīng)用。6、由于本發(fā)明組裝的檢測(cè)試劑盒或構(gòu)建的生物芯片可以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究與臨床檢測(cè)，因此具有一定的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1為本發(fā)明的小鼠IgG-Fc片段的配基特異寡核苷酸配基序列。圖2為本發(fā)明的新型免疫-PCR檢測(cè)流程。圖2a為本發(fā)明的抗體IgG的Fc片段特異寡核苷酸修飾配基。圖2b為本發(fā)明的抗體IgG的Fc片段特異寡核苷酸修飾配基PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光信號(hào)分子5'熒光分子-TTTnTnTT-熒光淬滅分子3'序列。圖3為本發(fā)明的配基檢測(cè)流程。圖3a為本發(fā)明的5'生物素化的捕捉配基序列。圖3b為本發(fā)明的修飾的檢測(cè)配基序列。圖3c為本發(fā)明的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光信號(hào)分子5'熒光分子(激發(fā)光源波長(zhǎng)470nm,檢測(cè)光源波長(zhǎng)510nm)-TTTTTTTTTT-熒光淬滅分子3'序列。圖4為本發(fā)明的實(shí)時(shí)定量-PCR原理圖。圖5為本實(shí)施例1的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)曲線(xiàn)。圖6為本實(shí)施例1的樣品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖7為本實(shí)施例2的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)曲線(xiàn)。圖8為本實(shí)施例2的樣品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。具體實(shí)施例方式一種HIV病毒抗原及配體PCR管式檢測(cè)試劑盒,包括其上包被捕捉fflV病毒耙分子的抗體或配基的檢測(cè)PCR管；用于HIV病毒配體/抗原檢測(cè)的檢測(cè)試劑A液和B液；標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品。其中A液由帶有人為序列修飾的配基/抗體和磷酸鹽緩沖溶液組成；B液包括上游引物、下游引物、4XdNTP、IOXPCR緩沖液和耐熱DNA聚合酶；上游引物序列為l:5，-TCTAACGTGAATGATAG-3'下游引物序列為2:5，-TATGGTCGAATAAGTTAA-3'標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣品、陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品為國(guó)家認(rèn)定的已知滴度為103~108拷貝/ul的檢測(cè)樣品。標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣品序列為5'-TCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3，在B液中還可以加入莖環(huán)分子信標(biāo)、SYBRGreen1nucleicacidstain及帶有熒光分子和淬滅分子的探針?lè)肿有艠?biāo)中任意一種的分子信標(biāo)。在本實(shí)施例中選用了熒光分子信標(biāo)，其序列為5'熒光分子-TTTTTTTTTT-熒光淬滅分子3'。為便于理解，本發(fā)明選用小鼠IgG-Fc片段的特異寡核苷酸配基序列(參見(jiàn)圖1)進(jìn)行具體實(shí)施例的描述，該序列是通過(guò)SELEX技術(shù)針對(duì)配體篩選出的一段20-40個(gè)堿基的寡核苷酸片段，再經(jīng)人為增加修飾序列后，使其變成可攜帶大量信息的配基序列用于多種配體同時(shí)檢測(cè)的示意圖。人為序列可以分別加在5'端、3'端或在5'端和3'端同時(shí)加上，長(zhǎng)度可以多樣，其中PCR所用引物為寡核苷酸配基兩端人為添加序列的互補(bǔ)序列。實(shí)施例l:新型免疫-PCR檢測(cè)新型PCR檢測(cè)流程(參見(jiàn)圖2)是指將PCR管處理后，首先包被一抗體，然后與檢測(cè)樣品共同孵育，形成一抗體-抗原復(fù)合物；再經(jīng)清洗后，加入經(jīng)配基標(biāo)記的檢測(cè)抗體，共同孵育后洗去未結(jié)合的檢測(cè)抗體，最后針對(duì)配基修飾序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和處理。其具體步驟如下1、？01管的制備將0.21111聚苯乙烯PCR管用50ul、體積濃度為1~20%的戊二醛在37±TC下處理1~3小時(shí)；用超純水、每次2~5分鐘沖洗PCR管三次；用pH值為9.6的碳酸氫鈉緩沖液將捕捉HIV病毒抗原的單克隆抗體2ug/ml包被在PCR管上，然后將該P(yáng)CR管用100ul、pH值為7.4的含5%脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液在37土rC下處理13小時(shí)，使PCR管封閉，干燥后待用。2、抗體試劑A液的制備將檢測(cè)HIV病毒的小鼠IgG抗體2ug/ml和經(jīng)序列修飾的小鼠IgG抗體Fc特異寡核苷酸配基25pmol/ul(參見(jiàn)圖2a:檢測(cè)配基由兩部分組成，第一部分5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCAAGCTAACCCTCATCTGCGCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3，為小鼠IgG抗體Fc特異寡核苷酸配基；第二部分雙鏈5,-TCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3'為配基修飾序列，其中5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'為標(biāo)志序列)，在100ul、pH值為7.4的lXPBS(138mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HP04，l.lmMKH2P。4,lmMMgCl2)中共同孵育60-120分鐘，并通過(guò)308納米波長(zhǎng)、12焦耳、1分鐘的紫外線(xiàn)交聯(lián)，使抗體和配基形成更穩(wěn)定的復(fù)合物。3、PCR檢測(cè)試劑B液的制備將含修飾序列的上游引物和下游引物各(25pmol/ul)lul、4XdNTP8ul、10XPCR緩沖液10ul(含Mg2+)和2~5單位的TaqDNA聚合酶(臨用前加入)混合后加水至100ul(可根據(jù)檢測(cè)儀即得。其中IOXPCR緩沖液是由pH值為8.3的50mmol氯化鉀、15mmol氯化鎂、10mmol的Tris-HCl和質(zhì)量濃度為0.1%的明膠組成的混合物；4XdNTP是由每種2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP組成的混合物。13以下為應(yīng)用具體操作步驟每次檢測(cè)均應(yīng)根據(jù)陰性、陽(yáng)性對(duì)照樣品按100pg，10pg,lpg，0.1pg，0.01pg，O.OOlpg設(shè)置陰性和和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。(1)從試劑盒中取出檢測(cè)PCR管放入檢測(cè)架上，將在56。C下滅活60分鐘的人血清樣品100ul，及陰陽(yáng)對(duì)照樣品放入普通微量離心機(jī)中，以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘后，分別取被檢測(cè)人血清和陰陽(yáng)對(duì)照樣品血清各50ul加入檢測(cè)PCR管中，在37土rC下孵育45120分鐘。(2)用洗液沖洗PCR管3次，3分鐘/次；其中洗液為pH值為7.4、含0.05°/。吐溫-20(Tween-20)的磷酸鹽緩沖液(PBS)。(3)在PCR管中加入A液60ul，在37±rC下孵育45~120分鐘。(4)用步驟(2)中的洗液沖洗PCR管3次，3分鐘/次。(5)在PCR管中加入B液60ul后，同時(shí)再加入4個(gè)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用Rotor-GeneRG3000實(shí)行實(shí)時(shí)定量-PCR擴(kuò)增，共35個(gè)循環(huán)(參見(jiàn)圖4、圖5),然后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理并打印檢測(cè)報(bào)告。其中擴(kuò)增條件為預(yù)變性95'C、5分鐘；變性94'C、30秒；復(fù)性55aC、30秒；延伸72'C、30秒；終延伸72'C、5分鐘。實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)的標(biāo)記物選自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、熒光和同位素中的一種或多種。圖4為本發(fā)明的實(shí)時(shí)定量-PCR原理圖。圖5為本實(shí)施例的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)曲線(xiàn)，該曲線(xiàn)橫坐標(biāo)是PCR的循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是PCR產(chǎn)物熒光檢測(cè)對(duì)數(shù)值。通過(guò)該曲線(xiàn)可計(jì)算出每個(gè)模板的Ct值，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)達(dá)到對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。圖6為本實(shí)施例的樣品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，該曲線(xiàn)橫坐標(biāo)是配基修飾序列模板的拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)是Ct值。利用標(biāo)準(zhǔn)品的已知起始拷貝數(shù)和Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每個(gè)未知模板的Ct值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出未知模板的起始拷貝數(shù)，從而計(jì)算出檢測(cè)配體或抗原的含量。檢測(cè)結(jié)果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>編號(hào)名稱(chēng)類(lèi)型Ct預(yù)定拷貝(copies/ul)檢測(cè)拷貝(c叩ies/ul)標(biāo)準(zhǔn)品2Standard21.435,000,000.000000004,782,804.11532328標(biāo)準(zhǔn)品3Standard24.71500,000.00000000496,732.82251228標(biāo)準(zhǔn)品4Standard28.0050,000.0000000050,967.95853644|20080616H01Unknown34.25680.48976215|20080617H01Unknown32.342,555.21558119|20080617H02Unknown34.06776.30482338陰性對(duì)照Unknown陽(yáng)性對(duì)照Unknown20.568,722,804.87739972實(shí)施例2:配基檢測(cè)配基檢測(cè)流程(參見(jiàn)圖3)是指將PCR管處理后，首先包被識(shí)別配體的配基，然后與檢測(cè)樣品共同孵育，形成配體-配基復(fù)合物；再經(jīng)清洗后，加入經(jīng)修飾序列標(biāo)記的識(shí)別檢測(cè)配體的不同配基，共同孵育后洗去未結(jié)合的檢測(cè)配基，最后針對(duì)配基修飾序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和處理。其具體步驟如下1、PCR管的制備將0.2ml聚苯乙烯PCR管用50ul、1~20%戊二醛在37土1。C處理13小時(shí)；用超純水、每次25分鐘清洗PCR管三次；將50ul鏈菌親和素(streptavidin)包被在PCR管上后，用60ul、pH值為7.4的含5%脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液在37'C處理2小時(shí)封閉，干燥后待用；然后用300ul、pH值為7.4碳酸氫鈉緩沖液漂洗三次，每次3分鐘；再加入25pmol/ul的50ul捕捉fflV配體的含生物素配基(biotin，B，其序列為生物素-5，陽(yáng)TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCTTAGTTGTTCTCCTAGGCATGTTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3，)(參見(jiàn)圖3a)，在37土1'C孵育1小時(shí)后用300ul、pH值為7.4的碳酸氫鈉緩沖液漂洗三次，每次3分鐘，干燥后待用。2、抗體試劑A液的制備、PCR檢測(cè)試劑B液的制備及具體應(yīng)用均同實(shí)施例l。其中圖7為本實(shí)施例的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)曲線(xiàn)；圖8為本實(shí)施例的樣品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。檢測(cè)結(jié)果如下彩線(xiàn)名稱(chēng)類(lèi)型Ct預(yù)定拷貝(copies/ul)檢測(cè)拷貝(copies/ul)纟彩15編號(hào)24名稱(chēng)類(lèi)型Ct預(yù)定拷貝(copies/ul)檢測(cè)拷貝(copies/ul)標(biāo)準(zhǔn)品1Standard20.3650,000，000.0000000050,868,803.211562卯標(biāo)準(zhǔn)品2Standard24.165,000,000.000000004，871,065.50894628標(biāo)準(zhǔn)品3Standard27.84500，000.00000000500,285.05007451標(biāo)準(zhǔn)品4Standard31.5650，000.0000000050,418.1611242120080324H01Unknown20.3252,214,313.17167810陰性對(duì)照NegativeControl陽(yáng)性對(duì)照PositiveControl22.9610,256,470.100018701權(quán)利要求1、一種HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒，包括—PCR管為聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒靶分子的抗體或配基；—檢測(cè)試劑A液和B液，用于獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒配體/抗原檢測(cè)；—標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣品；—陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品。2、一種用于如權(quán)利要求1所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的A液，其特征在于它由IOOul、pH值為7.4的25pmol/ul帶有人為序列修飾的檢測(cè)配基和2ug/ml抗體的磷酸鹽緩沖液組成。3、如權(quán)利要求2所述的一種用于HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的A液，其特征在于所述人為序列修飾的檢測(cè)配基是指人為在配基的3'和5'端分別或同時(shí)加上已知序列的單鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)和兩條互補(bǔ)雙鏈。4、一種用于如權(quán)利要求1所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的B液，其特征在于它由lul上游引物、lul下游引物、8ul4XdNTP、10ulIOXPCR緩沖液、2-5單位的耐熱DNA聚合酶和水組成；其中上游引物序列為1:5，-TCTAACGTGAATGATAG-3';下游引物序列為2:5，畫(huà)TATGGTCGAATAAGTTAA-3'。5、如權(quán)利要求4所述的一種用于HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的B液，其特征在于該B液還含有分子信標(biāo)。6、如權(quán)利要求5所述的一種用于HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的B液，其特征在于:所述的分子信標(biāo)是修飾序列的莖環(huán)分子信標(biāo)、SYBRGreen1熒光染料及帶有熒光分子和淬滅分子的探針?lè)肿有艠?biāo)中的任意一種。7、一種制備如權(quán)利要求1所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的方法，包括以下步驟(1)在37土rC下、用體積濃度為120。/。的戊二醛處理PCR管，使戊二醛附著在PCR管；(2)用超純水清洗PCR管；(3)將捕捉fflV耙分子的配基/抗體包被在PCR管上；(4)用pH值為7.4的含5。/。的脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液封閉PCR管，經(jīng)干燥得PCR管；(5)配制檢測(cè)試劑A液將檢測(cè)HIV病毒的抗體和經(jīng)序列修飾的抗體特異寡核苷酸配基在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中孵育并通過(guò)紫外線(xiàn)交聯(lián)，或用磷酸鹽緩沖液溶解配基即可；(6)配制檢測(cè)試劑B液將B液各組分混合后加水即得；(7)將干燥后的PCR管、檢測(cè)試劑A液和B液與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣品、陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品組裝，放入試劑盒即可。8、如權(quán)利要求7所述的制備HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于所述步驟(3)中的配基包被在PCR管上是指先將鏈酶親和素包被在PCR管上，再加入帶有生物素的配體捕捉配基，通過(guò)鏈酶親和素和生物素的結(jié)合，使捕捉配基固著在PCR管上。9、如權(quán)利要求7所述的制備HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于所述步驟(3)中的抗體包被在PCR管上是指將單克隆抗體用pH值為9.6的碳酸氫鈉緩沖液包被在PCR管上。10、一種如權(quán)利要求1所述的fflV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，包括以下步驟①設(shè)置陰性和和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；②待測(cè)樣品的制備；③在PCR管中加入待測(cè)樣品和陰陽(yáng)對(duì)照樣品，在37土1。C孵育45~120分鐘；④將步驟③中孵育后的PCR管用洗液沖洗；⑤在PCR管中加入A液，在37土1。C孵育45120分鐘；⑥將步驟⑤中孵育后的PCR管用洗液沖洗；⑦在PCR管中加入B液后再加入標(biāo)準(zhǔn)品，采用實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)釆集和處理。11、如權(quán)利要求10所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)獲得性人類(lèi)免疫缺陷病mv病毒的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟④和⑥中的洗液是指pH值為7.4、含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。12、如權(quán)利要求10所述的HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟Q中的實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)的標(biāo)記物選自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、熒光和同位素中的一種或多種。全文摘要本發(fā)明涉及一種HIV病毒抗原及配體PCR管式檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括包被捕捉獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒靶分子的抗體或配基的PCR管、用于獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒配體/抗原檢測(cè)的檢測(cè)試劑A液和B液、標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品。本發(fā)明通過(guò)特異寡核苷酸配基(或攜帶信號(hào)分子的特異寡核苷酸配基)與配體直接結(jié)合，將配體信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸配基信號(hào)，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增放大、檢測(cè)，來(lái)測(cè)定配體，因此其檢測(cè)配體具有快速、靈敏度高、可定量檢測(cè)的特點(diǎn)。同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)了該試劑盒的制備方法和在檢測(cè)獲得性人類(lèi)免疫缺陷病HIV病毒的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用方法。文檔編號(hào)G01N21/00GK101503738SQ200810232319公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2008年10月30日優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日發(fā)明者廖世奇,李安敏,王云普申請(qǐng)人:西北師范大學(xué);蘭州普利生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司