專利名稱：檢測(cè)hiv-1抗原用試劑及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)HIV-lp24抗原用試劑及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
后天性免疫缺陷癥候群(AIDS)是感染人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的疾病。歷 來(lái)，艾滋病的診斷都是靠檢測(cè)血液中的HIV抗體。然而，在HIV感染初期，血液中存在一段 抗體價(jià)不升高的空白期。因此，檢測(cè)HIV抗體的檢查方法有可能忽略HIV初期感染患者。為解決這種問(wèn)題，檢測(cè)血液中的HIV抗原的方法已為人所知。而且已知有一種檢 測(cè)方法可以檢測(cè)顯示穩(wěn)定抗原性的1型HIV病毒的P24核心蛋白質(zhì)(以下稱“HIV-1P24抗 原”)。這些眾所周知的方法比如有登載在美國(guó)專利第5173399號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)1)、美國(guó) 專利第4983529號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)2)和美國(guó)專利第6432633號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)3)等的夾 心檢測(cè)法。專利文獻(xiàn)1 美國(guó)專利第5173399號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 美國(guó)專利第4983529號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 美國(guó)專利第6432633號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題血液中HIV抗原的檢測(cè)因HIV抗原在血液中僅含有微量，所以要求敏感度很高。以 往的免疫檢測(cè)法使用小鼠單克隆抗體作為檢測(cè)HIV-lp24抗原的抗體。以此方法，當(dāng)樣本含 有人抗鼠抗體(HAMA)時(shí)，作為試劑含有的小鼠單克隆抗體和樣本中的HAMA發(fā)生反應(yīng)，有可 能得出假陽(yáng)性的結(jié)果。因此，本發(fā)明的目的是提供一種既能夠降低因HAMA造成的假陽(yáng)性，又能高度敏感 地檢測(cè)出HIV-lp24抗原的試劑及其方法。解決課題的手段本發(fā)明人完成本發(fā)明主要是發(fā)現(xiàn)了以下兩點(diǎn)1)采取運(yùn)用人單克隆抗體進(jìn)行夾心免疫檢測(cè)的方法能夠高度敏感地檢測(cè)出 HIV-lp24抗原；及2)使用人單克隆抗體，即使是含有HAMA的樣本也可以降低假陽(yáng)性。因此，本發(fā)明提供，(1) 一種檢測(cè)HIV抗原用試劑，其含有第一抗體、固相和第二抗體，其中第一抗體 是用標(biāo)記物標(biāo)記了的識(shí)別HIV-lp24抗原的第一人單克隆抗體，第二抗體是與可結(jié)合到上 述固相上的物質(zhì)結(jié)合的識(shí)別HIV-lp24抗原的第二人單克隆抗體；(2) (1)所述檢測(cè)HIV抗原用試劑，它包括含有所述第一抗體的第一試劑、含有作 為所述固相的粒子的第二試劑和含有所述第二抗體的第三試劑；(3) (2)所述檢測(cè)HIV抗原用試劑，所述標(biāo)記物是酶，所述試劑還包括含有這種酶的底物的第四試劑；(4) (1) (3)其中之一所述檢測(cè)HIV抗原用試劑，所述固相可以固定抗生物素蛋 白或鏈霉親和素，可以與所述固相結(jié)合的物質(zhì)是生物素；(5) (1) (4)其中之一所述檢測(cè)HIV抗原用試劑，所述固相是磁性粒子；(6) 一種HIV抗原檢測(cè)方法，在固相上形成包括樣本中所含HIV_lp24抗原、第一抗 體和第二抗體在內(nèi)的復(fù)合物，根據(jù)此復(fù)合物中所含上述標(biāo)記物檢測(cè)HIV抗原。其中，第一抗 體為標(biāo)記物標(biāo)記的識(shí)別HIV-lp24抗原的第一人單克隆抗體，第二抗體為結(jié)合了可與固相 結(jié)合的物質(zhì)的識(shí)別HIV-lp24抗原的第二人單克隆抗體；(7) (6)所述HIV抗原檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟混合所述抗原和所述第一 抗體；混合上述混合步驟獲得的混合物、所述固相粒子和所述第二抗體，在該粒子上形成所 述復(fù)合物；及根據(jù)在上述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含標(biāo)記物，檢測(cè)HIV抗原；(8) (6)所述HIV抗原檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟第一混合步驟，混合所述抗 原和所述第一抗體；第二混合步驟，混合第一混合步驟獲得的混合物和作為所述固相的粒 子；復(fù)合物形成步驟，混合第二混合步驟獲得的混合物和所述第二抗體，在上述粒子上形成 所述復(fù)合物；檢測(cè)步驟，根據(jù)在上述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含所述標(biāo)記物，檢測(cè)HIV 抗原；(9) (6)所述HIV抗原檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟第一混合步驟，混合所述抗 原和所述第一抗體；第二混合步驟，混合第一混合步驟獲得的混合物和所述第二抗體；復(fù) 合物形成步驟，混合第二混合步驟獲得的混合物和作為所述固相的粒子，在上述粒子上形 成所述復(fù)合物；檢測(cè)步驟，根據(jù)在上述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含標(biāo)記物，檢測(cè)HIV抗 原；(10) (6)所述HIV抗原檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟第一混合步驟，混合所述 抗原和所述第一抗體；第二混合步驟，混合作為所述固相的粒子和所述第二抗體；復(fù)合物 形成步驟，混合第一混合步驟獲得的混合物和第二混合步驟獲得的混合物，在所述粒子上 形成所述復(fù)合物；檢測(cè)步驟，根據(jù)在上述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含所述標(biāo)記物，檢測(cè) HIV抗原；(11) (7) (10)其中之一所述HIV抗原檢測(cè)方法，所述標(biāo)記物是酶，該方法還有使 該酶的底物與在所述粒子上形成的所述復(fù)合物混合的步驟，所述檢測(cè)步驟根據(jù)上述酶與上 述底物的反應(yīng)檢測(cè)HIV抗原；(12) (11)所述HIV抗原檢測(cè)方法，所述底物是發(fā)光底物或顯色底物，所述檢測(cè)步 驟是通過(guò)檢測(cè)所述酶與所述底物發(fā)生反應(yīng)所發(fā)出的光或顯現(xiàn)的顏色來(lái)檢測(cè)HIV抗原；(13) (6) (12)其中之一所述HIV抗原檢測(cè)方法，所述固相是磁性粒子。本發(fā)明的效果本發(fā)明的檢測(cè)HIV抗原用試劑及其檢測(cè)方法是用人單克隆抗體檢測(cè)HIV抗原。因 此，即使樣本中含有HAMA也可以減少假陽(yáng)性的結(jié)果。而且可以比傳統(tǒng)方法更敏感地檢測(cè) HIV-lp24。從而可以減少檢測(cè)HIV抗原所需的樣本量。進(jìn)而即使不對(duì)樣本進(jìn)行前處理也可 以提供高精度結(jié)果。由此得以減少檢查的煩瑣。


圖1為本發(fā)明的包含第一試劑、第二試劑和第三試劑的檢測(cè)HIV抗原用試劑的示 意圖；圖2為本發(fā)明HIV抗原檢測(cè)方法的反應(yīng)過(guò)程的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的檢測(cè)HIV抗原用試劑含有用標(biāo)記物標(biāo)記了識(shí)別HIV_lp24抗原的第一人 單克隆抗體的第一抗體、固相和將能與該固相結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合到識(shí)別HIV-lp24抗原的第 二人單克隆抗體的第二抗體。本發(fā)明的檢測(cè)HIV抗原用試劑包含由單一試劑和數(shù)種試劑構(gòu) 成的試劑盒。在本發(fā)明的檢測(cè)HIV抗原用試劑中，第一抗體、固相和第二抗體可以分別含在 各試劑中，也可以第一抗體、固相和第二抗體中任意二個(gè)或全部含在同一試劑中。比如有的 試劑盒包括含第一抗體的試劑和含固相及第二抗體的另一種試劑。此時(shí)，第二試劑中的第 二抗體也可以與固相結(jié)合。也有的試劑第一抗體、固相和第二抗體全都包括。此時(shí)，試劑中 的第二抗體也同樣可以結(jié)合在固相中。本發(fā)明的檢測(cè)HIV抗原用試劑最好是各試劑分別含有第一抗體、固相和第二抗體的 試劑盒。在此，作為包含在試劑中的固相可以列舉出后述粒子。即，試劑盒最好包括含有上述 第一抗體的第一試劑、含有上述固相粒子的第二試劑和含有上述第二抗體的第三試劑。圖1顯示的是該試劑盒的第一試劑、第二試劑和第三試劑的示意圖。第一試劑含 有第一抗體，第二試劑含有作為固相的粒子，第三試劑含有第二抗體。本發(fā)明使用的識(shí)別HIV_lp24抗原的第一和第二人單克隆抗體只要是能夠識(shí)別 HIV-lp24抗原的人單克隆抗體即可，無(wú)特別限定?？贵w的類型無(wú)特別限定，包含IgG、IgM 等。該抗體只要能識(shí)別HIV-lp24抗原，也可以是抗體的片段及其衍生物。作為抗體的片段 可列舉出Fab片段、F(ab，)片段、Fab，片段和sFv片段等。這些片段可以通過(guò)用諸如胃蛋 白酶(Pepsin)處理等眾所周知的傳統(tǒng)方法對(duì)抗體進(jìn)行處理獲得。識(shí)別HIV_lp24抗原的人單克隆抗體可以用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法獲得。比如可 以列舉出以下方法(1)使感染HIV患者的淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。再選擇產(chǎn)生目標(biāo)單克隆 抗體的雜交瘤。用所選雜交瘤培養(yǎng)，獲得抗體；(2)用HIV_lp24抗原對(duì)能產(chǎn)生人類免疫球蛋白的哺乳動(dòng)物(如基因小鼠 (XEN0M0USE，注冊(cè)商標(biāo)))進(jìn)行免疫，獲得目標(biāo)抗體；(3)使從HIV感染患者的血液采集的B淋巴細(xì)胞感染皰疹病毒(Epstein-Barr virus)。再篩選產(chǎn)生目標(biāo)抗體的B淋巴細(xì)胞。將克隆所篩選B淋巴細(xì)胞獲得的產(chǎn)生目標(biāo)抗 體的基因植入CH0(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞，獲得目標(biāo)抗體。也可購(gòu)買(mǎi)市售產(chǎn)品。具體地說(shuō)有Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86， PP. 1624-1628，1989上登載的識(shí)別HIV_lp24抗原的人單克隆抗體和可以從比利時(shí)生物醫(yī) 藥公司(BioMARIC，比利時(shí))購(gòu)買(mǎi)的識(shí)別HIV-lp24抗原的人單克隆抗體等。在本發(fā)明中最好使用從比利時(shí)生物醫(yī)藥公司(BioMARIC，比利時(shí))購(gòu)買(mǎi)的人單抗 體作為上述第一和第二人單克隆抗體。上述第一和第二人單克隆抗體分別是可以識(shí)別抗原不同部位(表位)的抗體。
上述第一抗體用可檢出的標(biāo)記物標(biāo)記。該標(biāo)記物無(wú)特別限定，是普通免疫測(cè)定方 法中可用的標(biāo)記物即可。比如可以是酶、熒光物質(zhì)、放射性同位素等。作為酶如有堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等。作 為熒光物質(zhì)如有異硫氰酸熒光素(FITC)、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、螢光素等。作為放射性同 位素如有125I、14C、32P等。上述標(biāo)記物最好是酶，尤以堿性磷酸酶(ALP)為宜。標(biāo)記物標(biāo)記第一人單克隆抗體的方法用該領(lǐng)域常用的方法即可，如眾所周知的用 抗體中的硫醇基(-SH基)使標(biāo)記物與抗體結(jié)合的方法。具體而言，使導(dǎo)入了可與硫醇基 反應(yīng)的官能基如馬來(lái)酰亞胺基的標(biāo)記物與第一人單克隆抗體反應(yīng)，標(biāo)記物即可標(biāo)記上述抗 體。上述第二抗體可與固相結(jié)合。第二抗體和固相的結(jié)合最好是第二抗體上可結(jié)合到 固相的物質(zhì)(以下有時(shí)稱“固相結(jié)合物”)與固定在固相上的結(jié)合物之間的結(jié)合。上述固相結(jié)合物與結(jié)合物在運(yùn)用HIV_lp24抗原檢測(cè)方法的條件下，只要是能特 異性結(jié)合的物質(zhì)組合即可，無(wú)特別限定。作為這些組合，如有生物素與親和素或鏈霉親和 素、半抗原和抗半抗原抗體、鎳和組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等。作為半 抗原和抗半抗原抗體如有二硝基酚(DNP)和抗DNP抗體。上述第二抗體與固相之間的結(jié)合最好是生物素與親和素或鏈霉親和素的結(jié)合。因 此，固相結(jié)合物與結(jié)合物的組合最好是生物素與親和素或鏈霉親和素的組合。在此，固相結(jié)合物與結(jié)合物的組合從可進(jìn)行上述特異性結(jié)合的物質(zhì)組合中選擇即 可，無(wú)特別限定。比如，當(dāng)固相結(jié)合物包含生物素時(shí)，結(jié)合物是親和素或鏈霉親和素。反之， 當(dāng)固相結(jié)合物包含親和素或鏈霉親和素時(shí)，結(jié)合物是生物素。在此，最好固相結(jié)合物含生物 素，結(jié)合物是親和素或鏈霉親和素。換言之，最好第二抗體是結(jié)合生物素的抗體，固相是固 定有親和素或鏈霉親和素的固相。讓上述固相結(jié)合物結(jié)合到第二人單克隆抗體、獲得可與固相結(jié)合的第二抗體的方 法在該領(lǐng)域是眾所周知的。比如，可以用含有對(duì)抗體中的一級(jí)氨基(-NH2基)和硫醇基等 有反應(yīng)的官能基使磁性粒子結(jié)合物附加到第二人單克隆抗體上。作為與一級(jí)氨基有反應(yīng)的 官能基如有琥珀酰亞胺基(NHS基)等，作為與硫醇基有反應(yīng)的官能基如有馬來(lái)酰胺基等。上述固相材料是免疫測(cè)定用的普通固相材料即可，無(wú)特別限定。比如可以是膠乳、 橡膠、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯 酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、丙烯醛一 乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏氟乙烯(PVDF)、硅等聚合物材料；瓊脂糖；明膠；紅細(xì) 胞；硅膠、玻璃、無(wú)活性礬土、磁體等無(wú)機(jī)材料等。也可以將其中的一種或二種以上組合起來(lái) 使用。固相的形狀只要是用于免疫測(cè)定的普通固相形狀，無(wú)特別限定，可以是微量滴定 板、試管、粒子等。在此，作為試劑中所含的固相最好是粒子。固相是粒子容易添加到試劑 中。作為粒子如有磁性粒子、膠乳粒子、紅細(xì)胞、明膠粒子等。讓上述結(jié)合物也可以直接固定到固相上。還可以固定到事先包被在固相表面的物 質(zhì)上。比如，固相表面有氨基、羧基等親水基時(shí)，通過(guò)讓結(jié)合物以化學(xué)反應(yīng)結(jié)合到該親水基， 即可固定到固相上。當(dāng)固相表面被聚合物和蛋白質(zhì)等物質(zhì)包被時(shí)，通過(guò)用化學(xué)結(jié)合和分子間力使結(jié)合物結(jié)合到該物質(zhì)即可固定到固相上。本發(fā)明的固相最好是磁性粒子。該磁性粒子是以有磁性的材料為基材的粒子。這 種磁性粒子在該技術(shù)領(lǐng)域已周知，作為基材已知使用Fe2O3及/或Fe3O4、鈷、鎳、鐵酸鹽、磁 鐵礦等。作為理想的磁性粒子可列舉出以下幾種(1)磁性粒子表面被聚合物和蛋白質(zhì)等包被的磁性粒子；(2)磁性粒子表面露出羧基的磁性粒子；(3)有磁性的基材分散在樹(shù)脂中的磁性粒子。這些磁性粒子能夠輕松地固定上述 結(jié)合物。讓上述結(jié)合物固定在磁性粒子的方法為在該技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法。如可采用 物理吸附法、共有結(jié)合法、離子結(jié)合法和這些方法的組合等。比如，當(dāng)讓親和素或鏈霉親和素固定到磁性粒子時(shí)，可以用表面露出羧基的磁性 粒子，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使親和素或鏈霉親和素固定在磁性粒子上。更具體地說(shuō)，在有水溶性碳 二亞胺等脫水縮合劑參與的情況下，使親和素或鏈霉親和素分子中的氨基與露出粒子表面 的羧基反應(yīng)形成氨基化合物，以此使親和素或鏈霉親和素固定到磁性粒子。當(dāng)磁性粒子表 面被聚合物和蛋白質(zhì)等物質(zhì)包被時(shí)，可以用化學(xué)結(jié)合和分子間力使親和素或鏈霉親和素結(jié) 合到該物質(zhì)來(lái)固定到固相上。當(dāng)磁性粒子的結(jié)構(gòu)是有磁性的基材分散在樹(shù)脂中時(shí)，可以用 化學(xué)結(jié)合和分子間力使親和素或鏈霉親和素結(jié)合到該樹(shù)脂來(lái)固定到固相上。本發(fā)明的檢測(cè)HIV用試劑除第一抗體、固相和第二抗體外，還可以包含不影響 HIV-lp24抗原檢測(cè)及/或能促進(jìn)檢測(cè)的其他成分。所謂其他成份有表面活性劑、防腐劑、血 清蛋白質(zhì)等。比如當(dāng)試劑盒包括含第一抗體的第一試劑、含固相粒子的第二試劑和含第二 抗體的第三試劑時(shí)，組成試劑盒的各試劑可以包含上述其他成份。本發(fā)明的檢測(cè)HIV用試劑可以將第一抗體、作為固相的粒子和第二抗體與上述其 他成份一起懸濁或溶解在適當(dāng)溶劑中形成液體的狀態(tài)。也可以經(jīng)冷凍干燥等處理將該液體 轉(zhuǎn)為固體狀態(tài)。本發(fā)明的檢測(cè)HIV用試劑最好是液體。比如當(dāng)試劑盒包括含第一抗體的第 一試劑、含固相粒子的第二試劑和含第二抗體的第三試劑時(shí)，最好試劑盒的第一試劑、第二 試劑和第三試劑均為液體。所謂適當(dāng)?shù)娜軇┲灰遣环恋KHIV_lp24檢測(cè)的溶劑，沒(méi)有特別限制。比如可 以使用磷酸鹽緩沖液(PBS)、三乙醇胺緩沖液(TEA)、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液 (Tris-HCl)等。第一試劑、第二試劑和第三試劑的pH最好為6. 0 10. 0左右。上述第一抗體和第二抗體，當(dāng)然也因所用抗體的種類不同而各異，但這些抗體與 樣本中可能存在的抗原發(fā)生反應(yīng)時(shí)，最好對(duì)于該抗原來(lái)說(shuō)數(shù)量過(guò)剩。即，與抗原反應(yīng)時(shí)的第 一和第二抗體的濃度以0.01 lOyg/ml為宜，最好是0. 1 Syg/ml。當(dāng)上述檢測(cè)HIV用試劑中的固相為磁性粒子時(shí)，檢測(cè)HIV用試劑以含有0. 1 20mg/ml的磁性粒子為宜，最好含有1 10mg/ml磁性粒子。當(dāng)標(biāo)記上述第一抗體的標(biāo)記物是酶時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)HIV用試劑最好是有含該酶 相應(yīng)底物的其他試劑的試劑盒。比如當(dāng)試劑盒包括含第一抗體的第一試劑、含固相粒子的 第二試劑和含第二抗體的第三試劑時(shí)，最好還有含該酶相應(yīng)底物的第四試劑。該酶相應(yīng) 的底物可根據(jù)上述作為標(biāo)記物例示的酶，使用一直為人所知的化學(xué)發(fā)光底物和生物發(fā)光堿性磷酸酶為上述酶時(shí)，作為底物如有AMPPD(注 冊(cè)商標(biāo))(3- (2，-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3，，-磷氧酰)-苯基-1，2- 二氧環(huán)乙烷)、 CDP-star (注冊(cè)商標(biāo))(4-氯-3-(甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2，-(5，-氯)三環(huán) [3.3. 1. I3'7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二鈉)、CSPD (注冊(cè)商標(biāo))(3-(4_甲氧基螺{1，2_ 二氧 雜環(huán)丁烷_(kāi)3，2-(5，-氯)三環(huán)[3. 3. 1. I3'7]癸烷}-4_基)苯基磷酸二鈉)等化學(xué)發(fā)光底 物和P-硝基苯基磷酸鹽、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)、硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、碘硝基 四唑(INT)等顯色底物。本發(fā)明的檢測(cè)HIV用試劑還可以含有清洗液。比如當(dāng)試劑盒包括含第一抗體的 第一試劑、含固相粒子的第二試劑和含第二抗體的第三試劑時(shí)，最好作為另一試劑還含有 清洗液。該清洗液最好是PH6.0 10.0左右的緩沖液，如有2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液 (MES)、磷酸鹽緩沖液(PBS)等。本發(fā)明還提供檢測(cè)HIV_lp24抗原的方法(以下也簡(jiǎn)稱為“檢測(cè)方法”)。本發(fā)明的檢測(cè)方法是在固相上形成包括樣本中所含的HIV_lp24抗原、第一抗體 和第二抗體的復(fù)合物，根據(jù)此復(fù)合物中所含有的標(biāo)記物檢測(cè)HIV抗原，其中第一抗體是用 標(biāo)記物標(biāo)記能識(shí)別HIV-lp24抗原的第一人單克隆抗體形成的抗體，第二抗體是將能與固 相結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合到識(shí)別HIV-lp24抗原的第二人單克隆抗體形成的抗體。即，本發(fā)明的檢 測(cè)方法只要能運(yùn)用第一抗體和抗原及在固相上形成的第二抗體和抗原的利用抗原_抗體 反應(yīng)的夾心檢測(cè)法檢測(cè)目標(biāo)抗原(HIV-lp24抗原)即可，無(wú)特別限定。比如當(dāng)檢測(cè)所用試劑盒包括含第一抗體的第一試劑、含固相粒子的第二試劑和含 第二抗體的第三試劑時(shí)，可能含HIV-lp24抗原的樣本、第一試劑、第二試劑和第三試劑按 各種順序混合皆可。本發(fā)明的檢測(cè)方法最好先進(jìn)行混合HIV_lp24抗原和第一抗體的步驟。上述抗原 和第一抗體在此步驟中接觸，形成由HIV-lp24抗原和第一抗體構(gòu)成的復(fù)合物。然后再用第 二抗體在固相上形成包括HIV-lp24抗原、第一抗體和第二抗體的復(fù)合物，根據(jù)該復(fù)合物所 含上述標(biāo)記物檢測(cè)HIV抗原。按此順序檢測(cè)HIV抗原，可以更敏感地檢測(cè)出目標(biāo)抗原。圖 2示意性地顯示了按此順序用第一和第二抗體捕捉HIV抗原的過(guò)程。比如，當(dāng)使用的試劑盒有含第一抗體的第一試劑、含固相粒子的第二試劑和含第 二抗體的第三試劑時(shí)，理想的檢測(cè)方法包括以下步驟(a)步驟混合HIV_lp24抗原和第一試劑，形成由HIV_lp24抗原和第一抗體構(gòu)成 的復(fù)合物；(b)步驟用第三試劑中所含的第二抗體使在(a)步驟獲得的復(fù)合物形成到第二 試劑中所含的固相粒子上；(c)步驟檢測(cè)出在(b)步驟在上述粒子上形成的上述復(fù)合物中第一抗體的標(biāo)記 物。用此檢測(cè)方法可以更敏感地檢測(cè)HIV抗原。關(guān)于混合抗原和第一抗體步驟之后進(jìn)行的用上述第二抗體在固相上形成包括 HIV-lp24抗原、第一抗體和第二抗體的復(fù)合物的步驟，可以列舉出以下(1) (4)種(1)混合在混合步驟中獲得的混合物、上述作為固相的粒子和上述第二抗體在混合步驟獲得的混合物中包括第一抗體_抗原構(gòu)成的復(fù)合物(以下有時(shí)稱“第 一抗體_抗原復(fù)合物”)。在(1)的情況下，第一抗體_抗原復(fù)合物同時(shí)與第二抗體和粒子
9接觸。第二抗體與該復(fù)合物結(jié)合形成由第一抗體-抗原-第二抗體構(gòu)成的復(fù)合物(有時(shí)稱 “第一抗體-抗原-第二抗體復(fù)合物”)后，與粒子結(jié)合?；蛘叩诙贵w與粒子結(jié)合后，與第 一抗體_抗原復(fù)合物結(jié)合。結(jié)果在粒子上形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物。(2)將在混合步驟獲得的混合物和上述作為固相的粒子混合后，再混入第二抗 體在(2)的情況下，混合物中的第一抗體-抗原復(fù)合物先與粒子接觸。第一抗體-抗 原復(fù)合物沒(méi)有與粒子的結(jié)合位點(diǎn)。因此，第一抗體-抗原復(fù)合物不與粒子結(jié)合。接著讓第 二抗體與抗原_第一抗體復(fù)合物和粒子接觸。于是，第二抗體與抗原_第一抗體復(fù)合物結(jié) 合，形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物后，與粒子結(jié)合?；蛘?，第二抗體與粒子結(jié)合后， 與抗原_第一抗體復(fù)合物結(jié)合。從而在粒子上形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物。(3)將在混合步驟獲得的混合物和上述第二抗體混合后，再混入上述作為固相的 粒子在(3)的情況下，混合物中的第一抗體-抗原復(fù)合物先與第二抗體接觸。以此形成 第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物。然后，第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物再與粒子接 觸。以此第一抗體-抗原-第二抗體復(fù)合物與粒子結(jié)合。結(jié)果在粒子上形成第一抗體-抗 原-第二抗體復(fù)合物。(4)將上述作為固相的粒子和上述第二抗體混合后形成的混合物與混合步驟獲得 的混合物混合在(4)的情況下，首先第二抗體與粒子接觸。從而，第二抗體與粒子結(jié)合。再讓混 合物中的第一抗體-抗原復(fù)合物與結(jié)合在粒子上的第二抗體接觸。以此結(jié)合在粒子上的第 二抗體與第一抗體一抗原復(fù)合物。結(jié)果在粒子上形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物。 有時(shí)未結(jié)合到粒子的第二抗體與抗原_第一抗體復(fù)合物結(jié)合，形成第一抗體_抗原一第二 抗體復(fù)合物后，在粒子上形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物。當(dāng)檢測(cè)方法所用試劑盒包括含第一抗體的第一試劑、含作為固相的粒子的第二試 劑和含第二抗體的第三試劑時(shí)，上述步驟(b)或者采取(bl)方式，即混合在步驟(a)形成 的復(fù)合物、第二試劑和第三試劑；或者采取(b2)方式，即混合在步驟(a)形成的復(fù)合物和第 二試劑后再混入第三試劑；或者采取(b3)方式，即混合在步驟(a)形成的復(fù)合物和第三試 劑后，再混入第二試劑；或者采取(b4)方式，即混合第二試劑和第三試劑后再混入在步驟 (a)形成的復(fù)合物。上述各種情況下可出現(xiàn)的反應(yīng)如下當(dāng)采取(bl)方式混合在步驟(a)形成的復(fù)合物、第二試劑和第三試劑時(shí)在步驟(a)形成的抗原-第一抗體復(fù)合物與第三試劑中的第二抗體和第二試劑中 的粒子同時(shí)接觸。第二抗體與抗原-第一抗體復(fù)合物結(jié)合形成第一抗體-抗原-第二抗體 復(fù)合物后，與粒子結(jié)合?；蛘叩诙贵w與粒子結(jié)合后，與抗原-第一抗體復(fù)合物結(jié)合。結(jié)果 可在粒子上形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物。當(dāng)采取(b2)方式混合在步驟(a)形成的復(fù)合物和第二試劑后再混入第三試劑 時(shí)在步驟(a)形成的抗原-第一抗體復(fù)合物先與粒子接觸。此時(shí)，第一抗體和抗原 都沒(méi)有與粒子的結(jié)合位點(diǎn)。因此，抗原-第一抗體復(fù)合物不與粒子結(jié)合。接著讓含在第三
10試劑中的第二抗體與抗原-第一抗體復(fù)合物和粒子接觸。于是，第二抗體與抗原-第一抗 體復(fù)合物結(jié)合，形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物后，與粒子結(jié)合?；蛘撸诙贵w與 粒子結(jié)合后，與抗原_第一抗體復(fù)合物結(jié)合。從而得以在粒子上形成第一抗體-抗原-第 二抗體復(fù)合物。當(dāng)采取(b3)方式混合在步驟(a)形成的復(fù)合物和第三試劑后，再混入第二試劑 時(shí)在步驟(a)形成的抗原-第一抗體復(fù)合物先與第三試劑中的第二抗體接觸。以此 形成第一抗體-抗原-第二抗體復(fù)合物。然后，再讓第二試劑中所含的粒子與第一抗體-抗 原_第二抗體復(fù)合物接觸。結(jié)果能夠在粒子上形成第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物。當(dāng)采取(b4)方式混合第二試劑和第三試劑后再混入在步驟(a)形成的復(fù)合物 時(shí)先讓第三試劑中的第二抗體與第二試劑中的粒子接觸，于是，第二抗體的全部或 部分與粒子結(jié)合。再讓在步驟(a)形成的抗原-第一抗體復(fù)合物與第二試劑和第三試劑的 混合物混合。以此結(jié)合在粒子上的第二抗體與該復(fù)合物結(jié)合，在粒子上形成第一抗體-抗 原_第二抗體復(fù)合物。或者，未結(jié)合到粒子的第二抗體與抗原_第一抗體復(fù)合物結(jié)合，形成 第一抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物，此復(fù)合物與粒子結(jié)合。結(jié)果也能在粒子上形成第一抗 體-抗原-第二抗體復(fù)合物。在本發(fā)明的方法中，上述第一抗體和第二抗體雖然因所用抗體的種類不同而各 異，但最好對(duì)于樣本中可能含有的抗原以過(guò)剩量發(fā)生反應(yīng)。即，與抗原反應(yīng)時(shí)第一抗體和第 二抗體的濃度以0. 01 10 μ g/ml為宜，最好是0. 1 5 μ g/ml。上述檢測(cè)HIV用試劑最好 含有的第一和第二抗體的濃度能夠滿足如此量的抗體。當(dāng)上述固相為磁性粒子時(shí)，磁性粒子的濃度以0. 1 20mg/ml為宜，最好以1 10mg/ml的濃度存在。根據(jù)上述標(biāo)記物檢測(cè)HIV抗原的方法可依標(biāo)記物種類適當(dāng)選擇。即，標(biāo)記物是放 射性同位素時(shí)，可以用測(cè)定放射能的方法，該方法應(yīng)用閃爍計(jì)數(shù)器等眾所周知的儀器。當(dāng)標(biāo) 記物為熒光物質(zhì)時(shí)，可以使用用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀等眾所周知的儀器測(cè)定熒光的方法。最好 上述標(biāo)記物是酶，使該酶與上述第四試劑中的酶的底物發(fā)生反應(yīng)，檢測(cè)所得發(fā)光或顯色。發(fā) 光或顯色的檢測(cè)可以用分光光度計(jì)、化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀等眾所周知的儀器進(jìn)行。當(dāng)上述標(biāo)記物是酶時(shí)，上述檢測(cè)方法還具有將該酶的底物和在粒子上形成的第一 抗體_抗原_第二抗體復(fù)合物混合的步驟。上述檢測(cè)步驟根據(jù)上述酶和上述底物發(fā)生的反 應(yīng)檢測(cè)HIV抗原。在此，作為底物有上述發(fā)光底物和顯色底物。當(dāng)用發(fā)光底物或顯色底物 作為底物時(shí)，通過(guò)檢測(cè)酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光或顯色即可檢測(cè)出HIV抗原。在此，所謂檢測(cè)是一種也包含測(cè)定的概念。與標(biāo)準(zhǔn)物檢測(cè)一樣，標(biāo)記物的測(cè)定也可 以根據(jù)標(biāo)記物的種類使用眾所周知的傳統(tǒng)裝置進(jìn)行。用測(cè)定的值通過(guò)從含有已知濃度的 HIV-lp24抗原的溶液獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以定量樣本中的HIV-lp24抗原含量。
實(shí)施例下面用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不受以下實(shí)施例限制。先就實(shí)施例1 7以及比較例1中所用試劑的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。
(1)生物素標(biāo)記抗p24人單克隆抗體的制備從比利時(shí)生物醫(yī)藥公司(BioMARIC，比利時(shí))購(gòu)買(mǎi)了識(shí)別位點(diǎn)不同的二種抗p24人 單克隆抗體。使所購(gòu)兩種抗P24人單克隆抗體中的一種與按傳統(tǒng)方法制備的生物素_馬來(lái) 酰亞胺反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記抗P24人單克隆抗體。(2)生物素標(biāo)記抗p24鼠單克隆抗體的制備從比利時(shí)生物醫(yī)藥公司(BioMARIC，比利時(shí))購(gòu)買(mǎi)抗p24鼠單克隆抗體。將抗p24 鼠單克隆抗體與按常法制備的生物素_馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記抗P24鼠單克隆 抗體。(3)堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記抗p24人單克隆抗體的制備將購(gòu)自比利時(shí)生物醫(yī)藥公司(BioMARIC，比利時(shí))的識(shí)別位點(diǎn)不同的兩種抗p24人 單克隆抗體中與在(1)中進(jìn)行生物素標(biāo)記的抗體不同的另一抗P24人單克隆抗體與按常法 制備的ALP-馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)，獲得ALP標(biāo)記抗p24人單克隆抗體。(4)堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記抗p24Fab，的制備將與上述(3)為進(jìn)行ALP標(biāo)記而選擇的抗體相同的抗p24人單克隆抗體按常法 進(jìn)行胃蛋白酶消化，制備Fab’后，和(3) —樣與ALP-馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)，獲得ALP標(biāo)記抗 p24Fab'。按以下三種測(cè)定順序，用夾心檢測(cè)法測(cè)定HIV-1P24抗原。在以下步驟中，抗體經(jīng)抗體緩沖液(0. IM MES (2-氮氧六環(huán)乙磺酸)(ρΗ 6. 0)U% 牛血清白蛋白、0. 15M氯化鈉(NaCl), 0. 疊氮化鈉)稀釋。測(cè)定順序11)在反應(yīng)容器中加入堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記抗p24單克隆抗體或ALP標(biāo)記抗 p24Fab，(0. lU/mL) 50 μ L作為標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體，加入HIV_lp24抗原溶液(濃度0或 325pg/mL、BioMARIC公司制)50 μ L作為試樣，42°C反應(yīng)2分鐘。2)添加鏈酶親和素磁性粒子(平均粒子2 μ m、在20mM磷酸鈉緩沖液(ρΗ 7. 5)中 濃度為5mg/mL)30y L，42°C反應(yīng)2. 5分鐘。3)作為能與磁性粒子結(jié)合的第二抗體添加上述生物素標(biāo)記抗p24人單克隆抗體 (0. 8μ g/mL)50y L，42°C反應(yīng)2. 5分鐘后，進(jìn)行磁分離。4)加入清洗液(0.01M 2-氮氧六環(huán)乙磺酸(ρΗ 6. 5)、0. 1 %疊氮化鈉)100 700 μ L攪拌，進(jìn)行磁分離。此清洗操作共進(jìn)行4次。5)加入分散液(0.01Μ 2-氮氧六環(huán)乙磺酸(ρΗ 6. 5)、0. 1 %疊氮化鈉)50 μ L攪
拌，分散鏈酶親和素磁性粒子。6)加入發(fā)光底物液(CDP-Star, Applied Biosystems 公司)100 μ L 攪拌，42°C反 應(yīng)5分鐘，用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定順序21)在反應(yīng)容器中，作為能與磁性粒子結(jié)合的第二抗體添加生物素標(biāo)記抗p24人單 克隆抗體(0. 8 μ g/mL) 50 μ L，加入HIV_lp24抗原溶液(濃度0或325pg/mL) 50 μ L作為試 樣，42°C反應(yīng)2分鐘。2)添加鏈酶親和素磁性粒子(平均粒子2 μ m、在20mM磷酸鈉緩沖液(ρΗ 7. 5)中 濃度 5mg/mL) 30 μ L，42°C 反應(yīng) 2. 5 分鐘。
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3)添加堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記抗p24單克隆抗體或ALP標(biāo)記抗p24Fab’ (0. IU/ mL) 50 μ L作為標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體，42°C反應(yīng)2. 5分鐘后，進(jìn)行磁分離。4)加入清洗液100 700μ L攪拌，進(jìn)行磁分離。此清洗操作共進(jìn)行4次。5)加入分散液50 μ L攪拌，分散鏈酶親和素磁性粒子。6)加入發(fā)光底物液(CDP-Star, Applied Biosystems 公司)100 μ L 攪拌，42°C反 應(yīng)5分鐘，用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定順序31)在反應(yīng)容器中，作為能與磁性粒子結(jié)合的第二抗體添加生物素標(biāo)記抗p24單克 隆抗體(0. 8 μ g/mL) 50 μ L，加入HIV_lp24抗原溶液(濃度0或325pg/mL) 50 μ L作為試樣， 42 °C反應(yīng)2分鐘。2)添加鏈酶親和素磁性粒子(平均粒子2 μ m、在20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 5)中 濃度為5mg/mL) 30 μ L，42°C反應(yīng)2. 5分鐘后，進(jìn)行磁分離。3)加入清洗液100 700μ L攪拌，進(jìn)行磁分離。此清洗操作共進(jìn)行4次。4)添加ALP標(biāo)記抗ρ24單克隆抗體或ALP標(biāo)記抗p24Fab，(0. lU/mL) 50 μ L作為 標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體，42°C反應(yīng)2. 5分鐘后，進(jìn)行磁分離。5)加入清洗液100 700μ L攪拌，進(jìn)行磁分離。此清洗操作共進(jìn)行4次。6)加入分散液50 μ L攪拌，分散鏈酶親和素磁性粒子。7)加入發(fā)光底物液(CDP-Star, Applied Biosystems 公司)100 μ L 攪拌，42°C反 應(yīng)5分鐘，用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。實(shí)施例1用上述(1)制備的生物素標(biāo)記抗p24抗原人單克隆抗體(0. 8 μ g/mL)和上述(3) 制備的ALP標(biāo)記抗p24抗原人單克隆抗體按測(cè)定順序1進(jìn)行測(cè)定。比較例1用上述⑵制備的生物素標(biāo)記抗p24鼠單克隆抗體(0. 8,4. 0,8.0 μ g/mL)取代實(shí) 施例1的生物素標(biāo)記抗P24抗原人單克隆抗體，按測(cè)定順序1測(cè)定。根據(jù)上述實(shí)施例1和比較例1獲得的結(jié)果，求出用含HIV_lp24抗原的試樣(抗原 溶液)獲得的結(jié)果(特異性信號(hào))與不含HIV-lp24抗原的試樣獲得的結(jié)果(非特異性信 號(hào))之比(信/噪比；S/N比)。結(jié)果見(jiàn)表1。[表1]比較例1實(shí)施例1p24抗原濃 度 (p g/mL)抗體用量(μ g/mL)8 4 0.80.8發(fā)光強(qiáng)度發(fā)光強(qiáng)度發(fā)光強(qiáng)度發(fā)光強(qiáng)度02,0442,0252,0502,387325320,192643,855232,6171,220,458S/N比157318113511從上述結(jié)果得知，按照本發(fā)明使用抗p24人單克隆抗體，在抗體用量同樣 (0. 8 μ g/mL)的情況下，HIV-lp24抗原測(cè)定中的S/N比及特異性信號(hào)比抗p24鼠單克隆抗 體高出近5倍。還可以看出，連抗p24鼠單克隆抗體表現(xiàn)出最高特異性信號(hào)的4. 0 μ g/mL其 特異信號(hào)都在一半以下，因此，使用抗P24人單克隆抗體可以高敏感度地檢測(cè)出HIV-lp24 抗原。實(shí)施例2用與實(shí)施例1同樣的抗體、即上述(1)制備的生物素標(biāo)記抗P24人單克隆抗體和 上述⑶制備的ALP標(biāo)記抗p24人單克隆抗體(以下稱“ IgG-ALP”)按測(cè)定順序1進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例3用與實(shí)施例2同樣的抗體，按測(cè)定順序2進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例4用與實(shí)施例2同樣的抗體，按測(cè)定順序3進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例5用上述⑷制備的ALP標(biāo)記抗p24Fab，(Fab，-ALP)取代實(shí)施例2的ALP標(biāo)記抗 P24人單克隆抗體，按測(cè)定順序1進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例6用與實(shí)施例5同樣的抗體，按測(cè)定順序2進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例7用與實(shí)施例5同樣的抗體，按測(cè)定順序3進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)上述實(shí)施例2 7所得結(jié)果，求出用含HIV_lp24抗原的試樣(抗原溶液)獲 得的結(jié)果(特異性信號(hào))與不含HIV-lp24抗原的試樣獲得的結(jié)果(非特異性信號(hào))之比 (信/噪比；S/N比)。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。[表2]
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[表 3] 從上述結(jié)果得知，按照本發(fā)明，使用抗p24人單克隆抗體，無(wú)論以測(cè)定順序1 3 的哪一種反應(yīng)順序，也無(wú)論抗體是IgG-ALP還是Fab’ -ALP，都能看到特異性信號(hào)。還可以 知道，其中使用測(cè)定順序1，S/N比更高，使用IgG-ALP可以比使用Fab’ -ALP更敏感地檢測(cè) 抗原。實(shí)施例8及比較例2用上述(4)制備的ALP標(biāo)記抗p24抗原人單克隆抗體作為第一抗體、上述(1)制備 的生物素標(biāo)記抗P24抗原人單克隆抗體(0. 8 μ g/mL)作為第二抗體、市售HIV血清轉(zhuǎn)化盤(pán) 樣本[HIV Seroconversion panel BB(PRB925) (BBI 公司)]，按測(cè)定順序 1 檢測(cè) HIV_lp24 抗原。按照實(shí)施例8的順序檢測(cè)HIV抗原的結(jié)果見(jiàn)表4。作為比較例2，用市售HIV_lp24 抗原檢測(cè)用試劑LumipulseI HIV_lp24(注冊(cè)商標(biāo)，富士 REBIO公司制)，測(cè)定上述HIV 血清轉(zhuǎn)化盤(pán)樣本，結(jié)果如LumipulseI HIV_lp24的附屬文件上所述。在此，LumipulseI HIV-lp24作為檢測(cè)HIV-lp24抗原用抗體使用的是抗p24抗原鼠單克隆抗體。而且，在運(yùn) 用Lumipulsel HIV_lp24時(shí)，試樣的前處理是在試劑中添加含表面活性劑聚氧乙烯辛基苯 酚醚(Polyoxyethylene octyl phenol ether)的樣本處理液進(jìn)行攪拌。[表 4] 正如從表4看出，在運(yùn)用LumipulseI HIV_lp24時(shí)，從初次采血起的第10天檢測(cè) 出HIV-lp24抗原。與此相比，用本發(fā)明的抗p24人單克隆抗體檢測(cè)HIV抗原時(shí)，從初次采 血的第7天即可檢測(cè)出HIV-lp24抗原。即，使用本發(fā)明的抗p24人單克隆抗體檢測(cè)HIV抗 原可以比Lumipulsel HIV_lp24早3天檢測(cè)出HIV_lp24抗原。顯然，在本發(fā)明的檢測(cè)HIV 抗原中，即使不像Lumipulsel HIV_lp24那樣進(jìn)行試樣的前處理也可以高敏感度地檢測(cè)出 HIV-lp24 抗原。本申請(qǐng)與2007年12月28日申請(qǐng)的日本國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)卦?007-340370號(hào)相關(guān)，此 專利要求范圍、說(shuō)明書(shū)、附圖及摘要均可作為本說(shuō)明書(shū)的參考。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)HIV抗原用試劑，包括第一抗體，用標(biāo)記物標(biāo)記的識(shí)別HIV 1p24抗原的第一人單克隆抗體抗體；固相；第二抗體，與能結(jié)合到所述固相上的物質(zhì)結(jié)合的識(shí)別HIV 1p24抗原的第二人單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)HIV抗原用試劑，其特征在于還包括含有所述第一抗 體的第一試劑、含有作為所述固相的粒子的第二試劑和含有所述第二抗體的第三試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)HIV抗原用試劑，其特征在于所述標(biāo)記物是酶，所述試 劑還包括含有所述酶的底物的第四試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)HIV抗原用試劑，其特征在于所述固相能夠固定抗生 物素蛋白或鏈霉親和素，能夠與所述固相結(jié)合的物質(zhì)是生物素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)HIV抗原用試劑，其特征在于所述固相是磁性粒子。
6.一種HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于在固相上形成包含有第一抗體、第二抗體和樣 本中所含的HIV-lp24抗原的復(fù)合物，其中所述第一抗體為標(biāo)記物標(biāo)記的識(shí)別HIV-lp24抗 原的第一人單克隆抗體，所述第二抗體為結(jié)合了能與所述固相結(jié)合的物質(zhì)的識(shí)別HIV-lp24 抗原的第二人單克隆抗體；根據(jù)所述復(fù)合物中所含的所述標(biāo)記物檢測(cè)HIV抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法包括以下步驟混合所述抗原和所述第一抗體；混合所述混合步驟獲得的混合物、所述固相粒子和所述第二抗體，在所述粒子上形成 所述復(fù)合物；及根據(jù)在所述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含的所述標(biāo)記物，檢測(cè)HIV抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法包括以下步驟第一混合步驟，混合所述抗原和所述第一抗體；第二混合步驟，混合所述第一混合步驟獲得的混合物和作為所述固相的粒子； 復(fù)合物形成步驟，混合所述第二混合步驟獲得的混合物和所述第二抗體，在所述粒子 上形成所述復(fù)合物；檢測(cè)步驟，根據(jù)在所述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含的所述標(biāo)記物，檢測(cè)HIV抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法包括以下步驟第一混合步驟，混合所述抗原和所述第一抗體； 第二混合步驟，混合所述第一混合步驟獲得的混合物和所述第二抗體； 復(fù)合物形成步驟，混合所述第二混合步驟獲得的混合物和作為所述固相的粒子，在所 述粒子上形成所述復(fù)合物；檢測(cè)步驟，根據(jù)在所述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含的所述標(biāo)記物，檢測(cè)HIV抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法包括以下步驟第一混合步驟，混合所述抗原和所述第一抗體；第二混合步驟，混合作為所述固相的粒子和所述第二抗體；復(fù)合物形成步驟，混合所述第一混合步驟獲得的混合物和所述第二混合步驟獲得的混 合物，在所述粒子上形成所述復(fù)合物；檢測(cè)步驟，根據(jù)在所述粒子上形成的所述復(fù)合物中所含的所述標(biāo)記物，檢測(cè)HIV抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述標(biāo)記物是酶，所述檢 測(cè)方法還包括使所述酶的底物與在所述粒子上形成的所述復(fù)合物混合的步驟，所述檢測(cè)步 驟根據(jù)所述酶與所述底物的反應(yīng)檢測(cè)HIV抗原。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述底物是發(fā)光底物或顯 色底物，所述檢測(cè)步驟是通過(guò)檢測(cè)所述酶與所述底物發(fā)生反應(yīng)所發(fā)出的光或顯現(xiàn)的顏色來(lái) 檢測(cè)HIV抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV抗原檢測(cè)方法，其特征在于所述固相是磁性粒子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)HIV抗原用試劑，其含有第一抗體、固相和第二抗體，其中第一抗體是用標(biāo)記物標(biāo)記了的識(shí)別HIV-1p24抗原的第一人單克隆抗體，第二抗體是與可結(jié)合到上述固相上的物質(zhì)結(jié)合的識(shí)別HIV-1p24抗原的第二人單克隆抗體。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101910843SQ20088012273
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者大木卓, 宮地峰輝 申請(qǐng)人:希森美康株式會(huì)社