專利名稱:檢測待測物的試劑及其方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的含有肝素的試劑以及制 備所述試劑的方法。本公開還提供了用所述試劑檢測待測物的方法。
背景技術(shù):
傷寒是一種由傷寒沙門氏菌(^//mweZ/fli^pAO引起的地方性發(fā)熱疾 病。傷寒癥是一個(gè)公共健康的關(guān)注重點(diǎn)。所述生物體通常通過食用被污染 的食物或水進(jìn)入體內(nèi)并穿過腸壁。之后,它進(jìn)行繁殖并在24-72小時(shí)內(nèi)進(jìn) 入血流,導(dǎo)致傷寒和菌血癥。潛伏10-14天之后,開始出現(xiàn)傷寒的早期癥 狀如頭痛、發(fā)熱、食欲減退、心動(dòng)過緩、脾腫大等癥狀。傷寒在大多數(shù)情 況下不致死。發(fā)達(dá)國家一般采用抗生素如氨千西林、氯霉素、甲氧爺啶-磺胺甲噁唑和環(huán)丙沙星來治療傷寒。及時(shí)采用抗生素對所述疾病進(jìn)行治療 將病死率降低到約1%。當(dāng)不進(jìn)行治療時(shí),傷寒熱會持續(xù)三周到一個(gè)月。 不進(jìn)行治療的病死率為10-30%。傷寒可通過血液培養(yǎng)或檢測其抗原或檢 測其在血液中的抗體診斷。
通過肥達(dá)試驗(yàn)(widal test)診斷存在若干限制。肥達(dá)試驗(yàn)不是特異 性的,因?yàn)槠渑c其他發(fā)熱生物體和許多腸桿菌科的生物體都可發(fā)生交叉反 應(yīng)。而且,因?yàn)閭且环N地方性疾病,因此,在其發(fā)病地區(qū)總存在一定 背景水平的抗體,這會^J巴達(dá)試驗(yàn)得出錯(cuò)誤結(jié)果。因此,必須為每個(gè)地區(qū) 確定閾值滴度以排除假陽性的可能性。而且,肥達(dá)試驗(yàn)只能在開始發(fā)熱的 一或兩周后才能得到陽性結(jié)果。肥達(dá)試驗(yàn)是對采樣間隔至少 一周的成對血 清樣品的試驗(yàn),因?yàn)閱未畏蔬_(dá)試驗(yàn)是難以理解的和不確定的。
肥達(dá)試驗(yàn)的另一限制是在感染早期階段給予抗生素會抑制抗體的出 現(xiàn)并會因此得到假陰性結(jié)果。肥達(dá)試驗(yàn)的另一限制是,對于接種了 TAB 疫苗的正常健康人,由于人類系統(tǒng)中存在抗疫苗的循環(huán)抗體,因此會得出 假陽性反應(yīng)結(jié)果。肥達(dá)試驗(yàn)的另 一 限制是其給出的是傷寒感染的非直接證 據(jù)。肥達(dá)試驗(yàn)的又一限制是所述試驗(yàn)具有低靈敏度和低特異性。
4其他傷寒診斷的已知技術(shù)是基于病原體的分離和鑒定。此方法被稱為 黃金法則。在此技術(shù)中,通過顯微和生化試驗(yàn)從血液中分離出傷寒沙門氏 菌并對其鑒定。然而,此技術(shù)具有4艮多限制。上述技術(shù)的限制之一是耗時(shí),
因?yàn)槠湫枰?-14天的長時(shí)間培育并需要完善的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。上述技術(shù)的 另一限制是它的進(jìn)行需要大量血液樣品(10 ml/患者)。上述技術(shù)的又一 限制是其需要大量培養(yǎng)基即100 ml (血液樣品的10倍)。上述技術(shù)的另 一限制是其低靈敏度(40-80%),因?yàn)檠h(huán)中只存在低至1/ml的極少生物 體,itit成了假陰性結(jié)果。
上述方法的另一限制是培養(yǎng)細(xì)菌的生長被血液中的血清殺菌劑抑制, 這會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
血液培養(yǎng)的另一限制是感染早期的抗生素處理可能會抑制培養(yǎng)細(xì)菌 的生長,這也會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
WO2004047721專利提供了 一種制備用于快速檢測傷寒的凝集劑的 方法。WO2007034508提供了 一種檢測和/或定量樣品中的待測物的超靈 敏方法。
其他已知方法如放射性免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸收試驗(yàn)等基于對 體液中循環(huán)抗體的檢測,但這些技術(shù)具有許多限制。這些技術(shù)的限制之一 是它們需要復(fù)雜和完善的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。RIA的另一限制是其需要危害健 康的放射性材料并需要技術(shù)人員來處理所M射性材料。上迷技術(shù)的另一 限制是試劑非常昂貴。這些技術(shù)的另 一 限制是進(jìn)行這些試驗(yàn)至少需要4-5 小時(shí)。大量基于乳膠顆粒的免疫試驗(yàn)用于診斷。抗原的存在經(jīng)常通過^皮其 抗體包被的顆粒的凝集確定。所述試驗(yàn)對最高達(dá)有限濃度的抗原是可靠 的。抗原低于某一濃度時(shí),凝集反應(yīng)不會發(fā)生。所述凝集反應(yīng)是一種以擴(kuò) 散為主的過程,因此相當(dāng)緩慢。為了加快凝集速度和提高試驗(yàn)的靈敏度, 尤其是在皮摩爾和飛摩爾范圍的低濃度下,人們嘗試了許多技術(shù),其中有 一些在下文有討論。
非空化駐波超聲可迫使抗體包被的顆粒進(jìn)入壓力節(jié)點(diǎn)區(qū)域從而造成 顆粒碰撞的速度加快,因此已被用于增加不同乳膠凝集試驗(yàn)的靈敏度 (Grundy et al, J of Immunological Methods, vol 165, p 47, (1993)和Ellis et al, J Med. Microbiol., vol 49, p 853, (2000))。小體積液流得到控制的微流 體系統(tǒng)是另 一加強(qiáng)抗原和抗體之間相互作用的方法(Verpoorte, Electrophoresis, vol. 23, p 677, (2002)和Kricka, Clinical Chemistry, vol 44p 2008, (1998))。
共面電場也已被用于形成膠粒鏈,從而加快乳膠凝集反應(yīng)的速度 (Song et al, Analytical Chemistry, vol. 66, p. 778, (1994))。
所有上述現(xiàn)有^L術(shù)方法都有其內(nèi)在的限制。例如,在共面場中,所述 顆粒形成了鏈。在一條鏈中,相鄰顆粒的最大數(shù)目為2。換言之,只可能 形成所述顆粒的陣列。因此,即4吏在所述抗體包凈皮顆粒上有更多的結(jié)合位 點(diǎn)的情況下,也不可能再進(jìn)一步提高其特異性和靈敏度。微流體系統(tǒng)需要 許多不總是隨手可得的精細(xì)工程。因此,本領(lǐng)域中需要提供一種方法和系 統(tǒng),藉此,所述試驗(yàn)的靈敏度得到提高,并且樣品中的材料即使在4艮低的 濃度下也可被檢出。
然而,很清楚地,本文通過引用的方式納入的任何文獻(xiàn)都沒有教導(dǎo)或 公開本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容
本公開提供一種檢測樣品中待測物的試劑,所述試劑包含肝素和被待 測物配對物包被的基質(zhì),其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結(jié)合。
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的方法,所述方法包括用所 述試劑接觸所述樣品。所述試劑包含肝素和被一種待測物配對物包被的基 質(zhì)。所述待測物通過所述待測物和所述待測物配對物形成復(fù)合物來檢測, 所述復(fù)合物在下文中稱為待測物-待測物配對物復(fù)合物。
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒,所述試劑盒包含 所述試劑和說明書。
;^&開提供一種用于制備所述試劑的方法,所述試劑包含肝素和祐L待 測物配對物包被的基質(zhì),其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結(jié)合。 制備所述試劑的方法包括制備一種基質(zhì)的懸浮液,用一種待測物配對物 包被所述基質(zhì)并加入肝素。
圖1示出待測物被待測物配對物所附著的基質(zhì)捕獲從而使它們凝集。 圖2示出一種用于實(shí)施本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)裝置。圖3示出在存在和不存在電場的情況下待測物(傷寒沙門氏菌抗原) 與被傷寒沙門氏菌特異性抗體包被的基質(zhì)(乳膠顆粒)的凝集。 圖4示出像素強(qiáng)度偏差相對陽性對照濃度的變化。 圖5示出使用ELISA檢測樣品中待測物的本方法的改進(jìn)方法的圖解。 圖6示出用于檢測和定量樣品中待測物的反應(yīng)裝置。
具體實(shí)施例方式
本公開提供一種檢測樣品中待測物的試劑,所述試劑包含肝素和被所 述待測物配對物包被的基質(zhì),其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結(jié) 合。
本公開提供一種用于制備所述試劑的方法,所述方法包括制備一種 基質(zhì)的懸浮液;用一種待測物配對物包被所述基質(zhì);并加入肝素。
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的方法,所述方法包括用所 述試劑接觸所述樣品。所述試劑包含肝素和被一種待測物配對物包被的基 質(zhì)。所述待測物通過所述待測物和所述待測物配對物形成復(fù)合物來檢測, 所述復(fù)合物在下文中稱為待測物-待測物配對物復(fù)合物。
本公開提供了一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒,所述試劑盒包含 所述試劑和i兌明書。
抗原(抗體自其生成)即免疫原是一種有時(shí)會激發(fā)免疫反應(yīng)的分子。 抗原通常是蛋白或多糖。這包括細(xì)菌、病毒和其他微生物的某些部分(外 殼、莢膜、細(xì)胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)。脂質(zhì)和核酸只有在與蛋白和多 糖結(jié)合時(shí)才具有抗原性。非微生物外源(非自身的)抗原可包括花粉、蛋 清以及來自移植組織和器官的蛋白或輸入血細(xì)胞表面上的蛋白。
在本公開中,術(shù)語待測物包括微生物、酶、蛋白、糖、毒素、半抗原 以及其他外來顆粒。因此,術(shù)語待測物也包括抗原。本文所用術(shù)語"待測 物"可包括給定樣品中希望被檢測的任何物質(zhì)。它可以是抗原、抗體、糖、 半抗原、毒素或任何其他類似物質(zhì)。在本公開中,術(shù)語待測物以抗原傷寒 沙門氏菌抗原為例。
在本公開中,除上下文另有清楚說明的以外,單數(shù)形式的"一"、"一 種,,和"該"都包括復(fù)數(shù)指代對象。因此,例如,提及"一種基質(zhì)"時(shí)包括多 種這樣的基質(zhì),提及"一種抗體"時(shí)指一種或多種抗體或其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的等同物。類似的語法規(guī)則也適用于其他例子,如待測物、顆粒、 免疫球蛋白、待測物配對物和分子。
用于檢測待測物的"樣品,,包括尿液、唾液、血液、滑液、腦脊液和任 何其他天然或合成的生物材料。
所得結(jié)果可通過任何可檢測信號讀取或檢測,并采用諸如化學(xué)發(fā)光、 比色法、放射、反射、熒尤復(fù)光、雙折射、(在特定波長或波段處的)光 密度變化、透射光吸收度的測量(比濁法)、在前向小角度處的散射光的 測量(稱為散射比濁法)、掃描激光顯微技術(shù)、目測和數(shù)字成像等技術(shù)觀 察。
抗體,也稱為免疫球蛋白,是存在于脊推動(dòng)物的血液或其他體液中的 蛋白,其被免疫系統(tǒng)使用以識別和中和外來物,如稱為抗原的細(xì)菌和病毒。 在本公開中,術(shù)語抗體和免疫球蛋白在下文可交換使用。術(shù)語"待測物配 對物"用于代表任何能夠識別所述待測物的材料。例如,如杲所述待測物 是一個(gè)抗原,則所述待測物配對物可以是一個(gè)抗體。"結(jié)合伴侶"即基質(zhì)是 所述待測物配對物通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵附著的任何顆?;虿牧稀K?乳膠、聚苯乙烯、金、銀、鈀或任何其他可供所述待測物配對物附著的聚 合或纖維顆粒。
本公開的一個(gè)實(shí)施方案提供一種檢測樣品中待測物的試劑,所述試劑 包含被待測物配對物包被的基質(zhì),和肝素,其中所述待測物配對物能夠與 所述待測物結(jié)合。本公開采用肝素來將樣品例如血清和血漿樣品中的非特 異性反應(yīng)最小化。
^^開的一個(gè)實(shí)施方案提供了 一種用于制備所述試劑的方法,所述方
法包括制備一種基質(zhì)的懸液,用一種待測物配對物包被所述基質(zhì),并加 入肝素。
在本公開的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述試劑選自尿液、唾液、血液、滑 液、腦脊液和其他生物材料。
在本公開的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述基質(zhì)選自乳膠顆粒、金屬顆粒、 聚合物顆粒、碳顆粒和硅顆粒。
此外,在本公開的一個(gè)實(shí)施方案中,所述乳膠顆粒是羧化乳膠顆粒。
在本公開的一個(gè)實(shí)施方案中,所述乳膠顆粒是大小為0.88-0.卯jim的 羧化乳膠顆粒。
在本公開的另一實(shí)施方案中,所述待測物是一種生物大分子。在本公開的另 一實(shí)施方案中所提供的所述待測物是一種抗原。 本公開的另一實(shí)施方案所提供的所述抗原是傷寒沙門氏菌抗原。 本公開的另 一 實(shí)施方案所提供的所述待測物配對物是一種抗體。 本公開的另一實(shí)施方案所提供的所述抗原選自微生物、酶、蛋白、糖、
毒素、半抗原和其他外來顆粒。
本公開的另一個(gè)實(shí)施方案所提供的所述待測物配對物選自蛋白和碳
水化合物。
本公開的另 一個(gè)實(shí)施方案提供一種檢測樣品中待測物的方法,所述方 法包括用所述試劑接觸所迷樣品,并檢測待測物和所迷待測物配對物之間 復(fù)合物的形成,以下所述復(fù)合物稱為待測物-待測物配對物復(fù)合物。所述 試劑包括被一種待測物配對物包被的基質(zhì),和肝素,其中所述待測物配對 物能夠與所述待測物結(jié)合。
此外,本公開的另一實(shí)施方案提供通過檢測待測物-待測物配對物復(fù) 合物的形成來檢測樣品中待測物的方法。檢測所述待測物-待測物配對物 復(fù)合物所采用的檢測技術(shù)選自化學(xué)發(fā)光、比色法、放射、反射、熒光發(fā)光、 雙折射、光密度變化、比濁法、散射比濁法、掃描激光顯微技術(shù)、目測和 數(shù)字成像。
本公開的另 一 實(shí)施方案提供了檢測樣品中待測物的方法,所述方法利 用在與插入所述樣品中的電極平面垂直的方向上施加電場。
在本公開的另 一個(gè)實(shí)施方案中,可檢測存在于所述樣品中的最低達(dá)皮 摩爾濃度的待測物。
本公開的另一實(shí)施方案提供了一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒, 所述試劑盒包括試劑和說明書。所述試劑包括肝素和凈皮所述待測物配對物 包被的基質(zhì),其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結(jié)合。
本公開的另 一實(shí)施方案所提供的試劑盒被用于檢測待測物,所述待測 物以傷寒沙門氏菌為例。
本公開的另 一實(shí)施方案所提供的試劑盒還包括電極、在垂直方向上對 所述樣品施加電能的工具和用于檢測讀出信號的工具。
本公開的另 一 實(shí)施方案涉及檢測樣品中待測物傷寒沙門氏菌抗原的 方法。本公開還提供一種檢測樣品中目的待測物的高度特異和靈敏的方
法。表5提供了用于檢測樣品中待測物的凝集反應(yīng)。
本公開還在Z方向上施加電場以檢測樣品 待測物。所述電場加強(qiáng)了用于檢測待測物(本文以沙門氏菌抗原為例)的凝集反應(yīng)的靈敏度。
本公開中檢測待測物例如傷寒沙門氏菌的方法包括用本公開的試劑 接觸待測樣品的步驟。所述試劑包括被抗目標(biāo)待測物的抗體包被的基質(zhì), 例如乳膠顆粒。所述試劑還包括肝素。用所述試劑接觸所述樣品一段充分 的時(shí)間以使所述待測物配對物與待測物結(jié)合。樣品中的待測物與所述待測 物配對物的結(jié)合導(dǎo)致待測物-待測物配對物復(fù)合物的形成。該復(fù)合物導(dǎo)致 反應(yīng)混合物中形成簇,所述簇隨后可被檢測到。此外,檢測所述待測物-待測物配對物復(fù)合物所采用的檢測技術(shù)選自化學(xué)發(fā)光、比色法、放射、反 射、熒光發(fā)光、雙折射、光密度變化、比濁法、散射比濁法、掃描激光顯 微技術(shù)、目測和數(shù)字成像。
本公開中檢測待測物例如傷寒沙門氏菌的方法任選地利用在與所述 樣品的平面垂直的方向上施加電場以產(chǎn)生可檢測信號。施加電場導(dǎo)致可檢 測到樣品中微量的、不施加電場就檢測不到的待測物。施加電場導(dǎo)致可檢 測到最低達(dá)皮摩爾量的待測物。
本^^開提供一種檢測樣品中待測物例如傷寒沙門氏菌抗原的高度特 異的方法。樣品,例如從臨床傷寒疑似患者收集的血清樣品,在試驗(yàn)中表 現(xiàn)出非特異性的凝集反應(yīng)。將肝素加入被待測物配合物包被的乳膠顆粒使 這種非特異性相互作用最小化并使特異性增加數(shù)倍。
本公開提供了一種方法,藉此,可檢測樣品中乃至最少量待測物的存
在。在z方向上(與所述樣品的平面垂直)施加電場時(shí),所述待測物和
待測物配對物在電場范圍內(nèi)趨向形成較大的簇,從而可檢測出給定樣品中 乃至最小量的待測物。
在本公開中,在垂直電場的影響下,所述待測物配對物所附著的基質(zhì) 發(fā)生凝集,因此所述待測物被捕獲于所述基質(zhì)之間。圖l顯示了所述作用 機(jī)理的圖解。因?yàn)樵谝粋€(gè)簇中,相鄰顆粒的數(shù)量更多,因此該方法可更好 地促進(jìn)待測物與待測物配對物鍵的形成并因此得到優(yōu)異的和很高的靈敏 度。
樣品中待測物的檢測方法可通過若干不同的實(shí)施方案實(shí)施,例如在z 方向上施加電場。所述電場可通過使用 一種專門針對待測物制備的待測物 配對物來檢測出樣品中乃至最少量的所述待測物。例如,如果所述待測物 是一個(gè)抗原,則制備該抗原的抗體并備用。此后,制備被所述待測物配對
物包被的基質(zhì)例如聚合材料或乳膠體,然后制備一種包括所述包被材料和樣品中待測物的混合物。如此制備的混合物是一種膠體分散液,將其置于
固態(tài)表面上(所述表面被一種導(dǎo)體材料預(yù)先包被)并對其(在z方向上) 施加一個(gè)電場,從而待測物配對物與所述待測物結(jié)合,再通過一種合適的 讀出信號檢測結(jié)果。
任選地,未結(jié)合的乳膠體和反應(yīng)溶液可在一段時(shí)間后被清洗掉,從而 只留下固定的復(fù)合物以觀察讀出信號。
另 一改進(jìn)方法可以是ELISA (酶聯(lián)試驗(yàn)),其中第一待測物配對物附
著于第一基質(zhì)。并且提供附著于第二基質(zhì)的第二待測物配對物和酶。將所 述第一待測物配對物加入樣品中, 一段時(shí)間后再加入第二待測物配對物,
然后施加充分時(shí)間的垂直于所述樣品平面的電場以引起所述第一待測物 配對物和第二待測物配對物(帶有酶)凝集并產(chǎn)生一個(gè)可檢測的讀出信號。 圖5和6顯示所述ELISA改進(jìn)方法的圖解。
在一個(gè)改進(jìn)方法中,可將患者的樣品收集在小管中,再將附著于所述 基質(zhì)上的待測物配對物加入該小管中。然后將兩個(gè)電極浸入所述小瓶中, 使其能有效形成待測物配對物和待測物復(fù)合物并給出讀出信號。
在前述實(shí)施方案中,所施加的電場可以由交流電、直流電或電池供電。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,^^開提供一種可用于檢測樣品中待測物存在 的裝置,所述裝置包括一個(gè)導(dǎo)電電極和一個(gè)電源,還包括一種將電能在垂 直于所述電極的方向上施加到所述電極的工具。圖2和6顯示所述反應(yīng)裝 置的圖解。抗體包被的基質(zhì)和含有所述待測物的樣品夾在兩塊被導(dǎo)電銦錫 氧化物(ITO) 18包被的玻璃板17之間。所述兩板由75 nm厚的絕緣隔離 片隔開,并且此小室被密封以防止所述懸浮液蒸發(fā)和流出。 一個(gè)與電位計(jì) 連接的信號函氣t生器25可用于調(diào)節(jié)所施加的正弦電壓的強(qiáng)度,所述電 壓可在萬用表16上被讀出。與CCD攝像機(jī)40連接的偏振光顯微鏡30 (透射模式)可用于拍攝所述顆粒。觀察結(jié)果被記錄在錄^^L45上。所 述裝置還具有計(jì)算機(jī)50,其可以每秒25幀的速度將圖像數(shù)字化。可通過 分析捕獲的圖像來定量凝集程度。
在另 一實(shí)施方案中,本公開提供用于檢測樣品中待測物存在的試劑 盒。所述試劑盒會才艮據(jù)采用的試驗(yàn)類型而有所變化。然而,通常,所述試 劑盒可包括導(dǎo)電表面以用作電極;用于在垂直于待測物配對物和待測物復(fù) 合物的方向上向所述樣品施加電能的電源和工具;能夠識別樣品中與待測 物配對物結(jié)合的待測物的待測物配對物,其中所述待測物復(fù)合物被包被在基質(zhì)如乳膠顆粒上;用于檢測讀出信號的工具;和說明書。
本公開的一個(gè)實(shí)施方案在實(shí)施例1中提供用于檢測待測物傷寒沙門氏菌的試劑的制備方法。
在實(shí)施例l和2中,本公開的另一實(shí)施方案提供在使用和不使用肝素的情況下對樣品中待測物即傷寒沙門氏菌抗原的檢測。實(shí)施例1和2還說明,在檢測待測物即傷寒沙門氏菌抗原中對新鮮和存放的試驗(yàn)樣品所觀察到的凝集不同。實(shí)施例2還說明施加垂直于插入所述樣品中的電極平面的電場時(shí)檢測靈敏度加強(qiáng)。在Z方向上施加電場時(shí)的凝集反應(yīng)的強(qiáng)度比不施加電場時(shí)要大。
本公開的另一實(shí)施方案說明肝素以外的抗凝血?jiǎng)┎粫乐箤?dǎo)致假陽性信號的非特異性相互作用。實(shí)施例3說明,使用肝素以外的抗凝血?jiǎng)┤鏓DTA和檸檬酸鈉檢測樣品中的待測物時(shí)不能防止非特異性相互作用。
4^>開的另 一實(shí)施方案說明,由于非特異性相互作用而在新鮮試驗(yàn)樣品中觀察到的凝集反應(yīng)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此,要精確檢測樣品中的待測物,必須防止導(dǎo)致凝集反應(yīng)的非特異性相互作用以消除假陽性信號。防止非特異性相互作用可通過向被針對目標(biāo)待測物的待測物配對物包被的基質(zhì)例如乳膠顆粒中加入肝素來實(shí)現(xiàn)。通過使用肝素防止樣品中的非特異性相互作用是本公開一個(gè)意外的結(jié)果。
盡管本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方案和/或各個(gè)特征已經(jīng)被說明和描述,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可知在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下還可進(jìn)行各種其他改變和改動(dòng)。技術(shù)人員還明顯可知,前述公開教導(dǎo)的實(shí)施方案和特征的全部結(jié)合都是可能的,并可產(chǎn)生本公開優(yōu)選的實(shí)施方案。
實(shí)施例
給出下面的實(shí)施例是為了向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就如何制造和使用本發(fā)明提供完整的公開和描述,而不是意圖限制發(fā)明者認(rèn)定的本發(fā)明的范圍,也不意圖表示以下實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行的所有的和唯一的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例l:傷寒沙門氏菌抗原的檢測A.傷寒沙門氏菌抗原的抗體的制備
對傷寒沙門氏菌特異的鞭毛蛋白的基因序列使用基因特異引物通過多聚^式反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的載體中被克隆并稍后被表達(dá)。所表達(dá)的蛋白通過Ni-NTA親和柱色鐠純化。所純化產(chǎn)物的蛋白含量通過Bradford法測定。在兔中培育此蛋白的超免疫血清。^Jt疫血清的免疫球蛋白部分通過硫酸銨沉淀被分離。所沉淀的免疫球蛋白被懸浮于1.0 ml PB (50 mM, pH 7.2)中,對其進(jìn)行透析并測定其蛋白含量。
B. 含有乳膠顆粒的懸浮液的制備
取1.0 ml的1%羧化乳膠顆粒和1.0 ml的40 mM MES緩沖液(pH5.8-6.3)置于2.0 ml微量離心管中并在震蕩混合器上混合60秒再在4°C下以10000 rpm離心10-12分鐘。再將所述乳膠顆粒在2.0 ml 20 mM MES緩沖液(pH 6.1)中通過在震蕩混合器上混合60秒再在4。C下以10000 rpm離心10-12分鐘洗滌兩次。最后一次洗滌后,將所述乳膠顆粒懸浮于1.0 mlMES緩沖液(20 mM, pH 6.1)中并用末端超聲機(jī)在5瓦特下超聲處理60-120秒。稍后逐滴加入1.0 ml新鮮制備的0.1 M 1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)的MES緩沖液(20 mM, pH 6.1)溶液,同時(shí)緩慢震蕩該溶液。使所述離心管在20-25。C下以頭尾相覆的形式緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)3小時(shí),然后用MES緩沖液(20 mM, pH 6.1)通過在4。C下以10000rpm離心10-12分^l中洗滌3次。然后將所述乳膠顆粒重懸浮于0.7 ml MES緩沖液(20 mM, pH 6.1)中并用末端超聲機(jī)在5瓦特下超聲處理60-120秒。
C. 乳膠試劑的制備
乳膠試劑包含包被有對待測物(在本申請中為傷寒沙門氏菌)特異的抗體的乳膠顆粒和肝素。
將0.6 mg的免疫球蛋白加入到如上制備的此乳膠顆粒懸浮液中并將體積用MES緩沖液(20 mM, pH 6.1)補(bǔ)足到1 mL。然后將此混合物在20-25。C下以頭尾相覆的形式緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)18-20小時(shí),以用所述抗體包被所述乳膠顆粒。然后通過加入0.06 ml的1M氨基乙酸(pH ll.O)終止所述包被反應(yīng)。所述轉(zhuǎn)動(dòng)在20-25-C下持續(xù)30分鐘。所述包,皮有抗體的乳膠顆粒通過在4'C下以10000 rpm離心而形成沉淀。用2.0 ml洗'條緩沖液(50mM氨基乙酸,pH 8.5, 0.03% triton X-100和0.05%疊氮化鈉)在4'C下以10000 rpm離心10-12分鐘將所述沉淀洗滌三次。將包,皮有抗體的經(jīng)洗滌的乳膠顆粒重懸浮于儲存緩沖液中(50 mM氨基乙酸,pH 8.5, 0.03%tritonX-100和0.1。/o疊氮化鈉)以獲得終濃度為1%的被抗體包被的乳膠,然后將其用末端超聲機(jī)在5瓦特下超聲處理60秒并儲存于4°C。將肝素加入到上述儲存緩沖液中,使?jié)舛葹槊縨l儲存緩沖液50單位。
D. 在所述乳膠試劑中加入測試樣品
將20-40 jil (l-2滴)新鮮測試樣品、儲存測試樣品、陽性對照和陰 性對照置于一張玻片上的不同位置。
新鮮測試樣品是從受試者獲得的并立即對待測物(傷寒沙門氏菌抗 原)的存在進(jìn)行檢測的樣品。
儲存測試樣品是長時(shí)間(7天以上)儲存在約4°C或更低的低溫下的 樣品。
將10-20 pl (1-2小滴)所述乳膠試劑加入所述新鮮測試樣品和儲存 測試樣品、陽性和陰性對照中。用不同的木棒將所述反應(yīng)物小心混合以避 免置于玻片上不同位置的反應(yīng)物的任何混雜。通過轉(zhuǎn)動(dòng)玻片l-2分鐘使所 述>^應(yīng)物進(jìn)一步混合。
E. 特異性測定
用不含肝素的乳膠試劑對上述樣品中的抗原進(jìn)行檢測。所有樣品都顯 示1+級凝集反應(yīng)。然而,當(dāng)使用含有肝素的乳膠試劑時(shí),在所有樣品中 都未觀察到凝集(非特異性反應(yīng))。
使用傳統(tǒng)傷寒檢測方法確認(rèn)所述結(jié)果時(shí),發(fā)現(xiàn)新鮮和儲存測試樣品中 都不含有傷寒沙門氏菌抗原。因此,結(jié)論是在新鮮測試樣品和陰性對照中 觀察到的凝集反應(yīng)是由于非特異性反應(yīng)所致。因此,要精確檢測樣品中的 待測物,必須防止導(dǎo)致凝集反應(yīng)的非特異性相互作用以消除假陽性信號。 防止非特異性相互作用可通過向被抗傷寒沙門氏菌抗原的抗體包被的乳 膠顆粒的懸浮液中加入肝素來實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例2:在Z方向上施加電場檢測傷寒沙門氏菌抗原 制備傷寒沙門氏菌抗原的抗體、制M有乳膠顆粒的懸浮液、制備乳
膠試劑和向所述乳膠試劑中加入測試樣品的步驟如實(shí)施例1中所討論的
進(jìn)行,
對于在Z方向上施加電場, 一個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置的實(shí)例示于表2。所述乳膠 顆粒的懸浮液和所述待測物測試樣品的混合物夾在兩塊被導(dǎo)電銦錫氧化 物(ITO)18包被的玻璃板17之間。所述兩板由75 pm厚的絕緣隔離片隔 開,并且此小室被密封以防止所述懸浮液蒸發(fā)和流出。 一個(gè)與電位計(jì)連接 的信號函IUL生器25可用于調(diào)節(jié)所施加的正弦電壓的強(qiáng)度,所述電壓可在萬用表16上被讀出。與CCD攝像機(jī)40連接的偏振光顯微鏡30 (透射模式)可用于拍攝所述顆粒。觀察結(jié)果被記錄在錄像機(jī)45上。所述裝置還包括帶有黑白影像采集卡PCI-1411 (National Instruments, USA)的計(jì)算機(jī)50,其可以每秒25幀的速度將圖像數(shù)字化。可通過分析用此卡捕獲的圖像來定量凝集程度。為研究電場的影響,將一體積(3 nL)被抗體包,皮的乳膠顆粒與一體積(3 nL)不同稀釋度的待測物混合物混合,并將此混合物夾在兩塊被導(dǎo)電銦錫氧化物(ITO)包被的由75 jim厚的隔離片隔開的玻璃板之間。所述小室用蠟密封以防止水分蒸發(fā)。 一個(gè)與電位計(jì)連接的信號函數(shù)發(fā)生器用于調(diào)節(jié)所施加的電場的強(qiáng)度。首先測定在不存在任何抗原時(shí)顆粒凝集的電場閾值。在存在抗原時(shí),施加強(qiáng)度為所述電場的大約0.85倍的電場來進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。對施加電場的這一選擇可使假陽性信號(沒有抗原的情況下發(fā)生凝集)最小化,同時(shí)使識別的敏感度和速度最大化。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)最佳電壓為1.5 V。為了比較存在和不存在所述電場時(shí)的影響,還在不施加任何電場的情況下在相同的條件下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。用與CCD攝像機(jī)和影像釆集卡連接的偏振光顯微鏡(透射模式,物鏡為40 x )對所述顆粒成像。用免費(fèi)軟件ImageJ處理這樣獲得的影像。應(yīng)用合適的濾光片,然后調(diào)整所述閾值,之后,所述影傳3皮轉(zhuǎn)變?yōu)槎?象,其中所述顆粒/蔟為黑色而背景為白色。然后,使用ImageJ的工具中的創(chuàng)建來計(jì)算每簇的平均面積。進(jìn)行用于檢測樣品中待測物的凝集反應(yīng)的反應(yīng)裝置示于圖6。圖6顯示了用兩個(gè)電極浸在含有所述測試樣品的小瓶中,能夠有效地進(jìn)行凝集(傷寒沙門氏菌抗原-抗體復(fù)合物的簇形成)反應(yīng)。然后通過4吏用讀出信號工具對所述待測物進(jìn)行檢測和定量。
在對所述反應(yīng)混合物(測試樣品和含有肝素的乳膠顆粒懸浮液)施加電場時(shí),在所述樣品中觀察到凝集反應(yīng)。在Z方向上施加電場時(shí)凝集的強(qiáng)度比不施加電場時(shí)要大。存在和不存在電場時(shí)的陽性對照的凝集示于圖3。在圖3中,左圖為不存在電場的情況,右圖為存在電場的情況。顯示了陽性對照在兩個(gè)不同濃度下的凝集反應(yīng)。
此外,通過每簇平均面積的方法對傷寒沙門氏菌抗原的存在進(jìn)行定量。每簇平均面積相對陽性對照濃度的變化圖示于圖4。
用不含肝素的乳膠試劑進(jìn)行上述樣品中的抗原檢領(lǐng)'J。所有樣品都顯示1+級凝集反應(yīng)。然而,在使用含有肝素的乳膠試劑時(shí),在所有的樣品中均未觀察到凝集反應(yīng)(非特異性反應(yīng))。使用傳統(tǒng)傷寒檢測方法確認(rèn)所述結(jié)果時(shí),發(fā)現(xiàn)新鮮和儲存測試樣品中 都不含有傷寒沙門氏菌抗原。因此,結(jié)論是在新鮮和儲存測試樣品和陰性
對照中觀察到的凝集反應(yīng)是由于非特異性反應(yīng)所致。因此,要精確檢測樣 品中的待測物,必須防止導(dǎo)致凝集反應(yīng)的非特異性相互作用以消除假陽性 信號。防止非特異性相互作用可通過向被傷寒沙門氏菌抗原包被的乳膠顆 粒的懸浮液中加入肝素來實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例3:在存在Z方向電場和其他抗凝血?jiǎng)r(shí)新鮮測試樣品和儲存 測試樣品中傷寒沙門氏菌抗原的檢測
重復(fù)實(shí)施例2中提到的步驟。然而,用EDTA代替肝素。用不含肝 素的乳膠試劑在新鮮和儲存樣品,陽性和陰性對照中進(jìn)行抗原檢測。所有 樣品都顯示1+級凝集反應(yīng)。當(dāng)在用于檢測傷寒沙門氏菌抗原的乳膠試劑 中加入EDTA時(shí),在所有樣品中都觀察到了凝集反應(yīng)(非特異性反應(yīng))。
使用傳統(tǒng)傷寒檢測方法確認(rèn)這一結(jié)果時(shí),發(fā)現(xiàn)新鮮和儲存測試樣品中 都不含有傷寒沙門氏菌抗原。因此,結(jié)論是在新鮮和儲存測試樣品和陰性 對照中觀察到的凝集反應(yīng)是由于非特異性反應(yīng)所致。因此,EDTA不能象 肝素一樣防止導(dǎo)致凝集的非特異性相互作用。
使用檸檬酸鈉代替EDTA進(jìn)行相同的檢測方法。相同的結(jié)果表明檸 檬酸鈉不能象肝素一樣防止導(dǎo)致凝集的非特異性相互作用和假陽性信號。
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中待測物的試劑,所述試劑包含肝素和被待測物配對物包被的基質(zhì),其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結(jié)合。
2. 如權(quán)利要求l要求的試劑,其中所述樣品選自尿液、唾液、血液、滑液、腦脊液和其他生物材料。
3. 如權(quán)利要求l要求的試劑,其中所述基質(zhì)選自乳膠顆粒、金屬顆粒、聚合物顆粒、碳顆粒和珪顆粒。
4. 如權(quán)利要求3要求的試劑,其中所述乳膠顆粒是大小為0.88-0.90 fim的羧化乳膠顆粒。
5. 如權(quán)利要求l要求的試劑,其中所述待測物是一種生物大分子。
6. 如權(quán)利要求l要求的試劑,其中所述待測物是一種抗原。
7. 如權(quán)利要求6要求的試劑,其中所述抗原是傷寒沙門氏菌(妙A(yù)/)抗原o
8. 如權(quán)利要求l要求的試劑,其中所述待測物配對物是一種抗體。
9. 如權(quán)利要求6要求的試劑,其中所述抗原選自微生物、酶、蛋白、糖、毒素、半抗原和其他外來顆粒。
10. 如權(quán)利要求l要求的試劑,其中所述待測物配對物選自蛋白和碳7JC化合物。
11. 一種檢測樣品中待測物的方法,所述方法包括用如權(quán)利要求l要求的試劑接觸所述樣品,并檢測待測物-待測物配對物復(fù)合物的形成。
12. 如權(quán)利要求11要求的方法,其中檢測所述復(fù)合物所采用的檢測技術(shù)選自化學(xué)發(fā)光、比色法、放射、反射、熒光發(fā)光、雙折射、光密度變 化、比濁法、散射比濁法、掃描激光顯微技術(shù)、目測和數(shù)字成像。
13. 如權(quán)利要求11要求的方法,還包括在與插入所述樣品中的電極平面垂直的方向上施加電場。
14. 如權(quán)利要求13要求的方法,可檢測所述樣品中最低達(dá)皮摩爾濃度的待測物。
15. —種用于檢測樣品中待測物的試劑盒,所述試劑盒包括如權(quán)利要求1要求的試劑和說明書。
16. 如權(quán)利要求15要求的試劑盒,其中所述待測物是傷寒沙門氏菌抗原。
17. 如權(quán)利要求15要求的試劑盒,還包含電極、在垂直方向上對所述樣品施加電能的工具和用于檢測讀出信號的工具。
18. —種用于制備如權(quán)利要求l要求的所述試劑的方法,所述方法包括(a) 制備一種基質(zhì)的懸浮液;(b) 用一種待測物配對物包被所述基質(zhì);并(c) 將肝素加入上述反應(yīng)體系。
全文摘要
本公開提供了一種用于檢測樣品中待測物的試劑以及制備所述試劑的方法。所述試劑包含肝素和被待測物配對物包被的基質(zhì)。所述試劑的待測物配對物能夠與所述待測物結(jié)合。本公開還提供一種通過用所述試劑接觸所述樣品并檢測待測物-待測物配對物復(fù)合物的形成來檢測樣品中待測物的方法。本公開還提供一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒。
文檔編號G01N33/569GK101680894SQ200880015415
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者A·K·蘇德, A·S·尼吉, G·P·雷, G·S·阿加沃, K·瑟卡拉, S·M·P·雷杰 申請人:國防研究與發(fā)展組織總干事;印度理學(xué)院