專(zhuān)利名稱(chēng)：乳清蛋白的活性凝膠電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白電泳方法，具體的說(shuō)，涉及一種乳清蛋白的活性凝膠電泳方法。
背景技術(shù)：
乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，其中酪蛋白含量約為
83%，乳清蛋白含量約為17。/。。乳清蛋白是指在乳品在pH4.6的酸性條件下仍然可溶的蛋白(酪蛋白沉淀)，主要由牛血清蛋白(BSA)、a-乳白蛋白(a-La)、 (3-乳球蛋白(卩-Lg)、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、過(guò)氧化物酶和溶菌酶等組成。為保證乳品的品質(zhì)，乳產(chǎn)品都經(jīng)過(guò)不同的熱處理加工過(guò)程，在熱處理過(guò)程中，乳品的各種物質(zhì)發(fā)生明顯的變化，其中乳清蛋白的變化尤為明顯，乳清蛋白含量會(huì)隨著加熱溫度和時(shí)間的增加不斷減少，因此精準(zhǔn)分析各種乳清蛋白含量，能夠靈敏判斷乳產(chǎn)品的加工工藝和質(zhì)量狀況，特別是能夠準(zhǔn)確判斷出各種乳蛋白的含量，是 一 種可靠的辨別偽假乳蛋白的技術(shù)方法。
大量研究表明，在不同的熱處理強(qiáng)度下，各種乳清蛋白表現(xiàn)出不同的耐熱性。乳清球蛋白在6(TC以上開(kāi)始展開(kāi)，形成聚合物，各種乳清蛋白變性的溫度如下卩-Lg, 77°C; a-La, 67。C;乳鐵蛋白，65 ~93°C (根據(jù)不同鐵含量而異)；BSA， 64°C; IgGl， 79.4°C; IgG2，76.7°C; IgM， 80.3°C;同時(shí)，乳清蛋白的變性溫度受到 一系列因素的影響，如蛋白濃度、pH、溶劑和熱處理時(shí)間。因此，乳清蛋白的變性成為衡量熱處理程度的重要指標(biāo)。
國(guó)際乳品基金會(huì)曾推薦把P-Lg作為不同熱處理加工乳制品的分類(lèi)指標(biāo)；但同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)綜合考察主要乳清蛋白的變化，將其作為一個(gè)總的評(píng)價(jià)指標(biāo)更為有效。對(duì)于乳清蛋白組分的鑒定，不同分析方法的靈敏度、準(zhǔn)確性、效
率各不相同。目前，用于分析乳品各種蛋白含量的主要方法有①SDS 或尿素丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳；②高效液相色譜，類(lèi)型有
離子交換、疏水反應(yīng)、凝膠過(guò)濾和反相色譜；③免疫方法和毛細(xì)管電 泳方法。這些方法都具有各自的優(yōu)點(diǎn)，但所需設(shè)備費(fèi)用昂貴，分析成 本高，技術(shù)性強(qiáng)，影響檢測(cè)結(jié)果的因素多，而且免疫方法由于需要先 獲得相應(yīng)蛋白的抗體，所以在普通條件下通常難以實(shí)現(xiàn)，且重復(fù)性不 好；毛細(xì)管電泳方法還存在著樣品吸收的問(wèn)題；另外上述每一種方法 都不能全面概括熱處理乳品乳清蛋白的變化，因此需要尋找 一 種能簡(jiǎn) 便、有效、全面的檢測(cè)乳清蛋白變化的方法，以鑒定不同熱處理方式
的乳品。
另外，乳品摻假行為屢禁不止，甚至由此引發(fā)了大頭娃奶粉、三 聚氰胺奶粉的重大安全事件。用本發(fā)明所提出的乳清蛋白活性凝膠電 泳技術(shù)，不僅能夠通過(guò)監(jiān)測(cè)乳清蛋白發(fā)現(xiàn)這類(lèi)偽劣乳品，也能夠準(zhǔn)確 檢測(cè)出利用其它真蛋白(如大豆蛋白)造假的問(wèn)題。
本發(fā)明釆用了一種基礎(chǔ)、簡(jiǎn)單的活性凝膠電泳方法，全面追蹤熱 處理過(guò)程中的乳清蛋白變化，起到了有效的指示和鑒別作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳清蛋白的活性凝膠電泳方法。 本發(fā)明的另一目的是提供一種鑒定巿售乳品的方法。 本發(fā)明所述的乳清蛋白活性凝膠電泳方法，包括取樣，樣品制備、 活性凝膠電泳和數(shù)據(jù)處理分析。其中取樣，樣品制備和數(shù)據(jù)處理釆用 本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
l)樣品制備主要是指將乳品脫脂(如為脫脂乳，則直接去除 酪蛋白)，分離酪蛋白，得到乳清蛋白，包括i )將乳品在7500g 10000g 下離心12 20min脫脂；ii)用酸調(diào)整pH至4.6,靜置12 20min后離心 除去酪蛋白，所得上清液即為乳清蛋白。調(diào)節(jié)pH所用酸為食品工業(yè)常用的鹽酸、檸檬酸或乳酸等。
2) 活性凝膠電泳，包括
i)配置8 l"/。的分離膠(由試劑貯備液30% (w/v)丙烯酰胺-0.8。/o(w/v)甲叉雙丙烯酰胺(A); 1.5 MTris-HCl,pH 8.8(B) ; 10%過(guò)硫酸銨(AP); N，N,N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)及去離子水配置)，4 6%濃縮膠(由試劑貯備液30%(w/v)丙烯酰胺-0.8% (w/v)甲叉雙丙烯酰胺(A); 0.5M Tris-HCl, pH6.8 (C); 10%過(guò)硫酸銨(AP);N，N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)及去離子水配置)的活性丙烯酰胺凝膠，所有電泳材料中均不含有蛋白變性劑，如SDS等。
ii )將乳清蛋白與2倍活性蛋白上樣緩沖液(0.1 MTris-HCl, pH6.8;
20%(v/v)甘油；0.01%溴酚藍(lán))以l: 3 5的比例混合后離心，根據(jù)
凝膠上樣孔徑的大小，上樣量為7.5 12pL。
iii) 具體電泳條件參數(shù)為
電泳緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3 );
上樣量乳清蛋白2倍活性蛋白上樣緩沖液=1:3 5,
7.5 12jiL;
電壓75~150V; 25 75min;溫度2 4°C。
iv) 電泳結(jié)東后進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán)R250染色，染色后進(jìn)行快速脫色。
其中，乳清蛋白樣品與樣品緩沖液混合后直接進(jìn)行電泳分析，不需進(jìn)行加熱變性處理。
快速染色過(guò)程可由直接使用快速R250染色液實(shí)現(xiàn)，或?qū)ΤＲ?guī)R250染色進(jìn)行適度加熱，15 20min即可完成染色過(guò)程。
一般， 一塊凝膠可同時(shí)進(jìn)行15個(gè)樣品的檢測(cè)。
3) 數(shù)據(jù)處理分析以乳清蛋白中的指示蛋白為對(duì)象，對(duì)凝膠進(jìn)行凝膠成像分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)該方法，可得到不同乳品的乳清蛋白圖譜。
基于上述乳清蛋白的活性凝膠電泳方法，可將新鮮乳品用特定的熱處理方式處理后進(jìn)行活性凝膠電泳，得到標(biāo)準(zhǔn)圖譜，與釆用相同熱處理方式的巿售乳品的活性凝膠電泳圖譜比較，判定巿售乳品的乳清蛋白的變化是否與標(biāo)準(zhǔn)品 一致，從而鑒定巿售乳品的品質(zhì)。
本發(fā)明所述的鑒定巿售乳品的方法包括
1) 取樣分別取巿售乳品(待測(cè)樣品)和新鮮乳品(作為標(biāo)準(zhǔn)品)，根據(jù)巿售乳品的標(biāo)識(shí)和/或相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，確定巿售乳品的熱處理?xiàng)l件；
2) 樣品制備
i) 將新鮮乳品脫脂后，根據(jù)巿售乳品的特定熱處理?xiàng)l件(特定溫度、時(shí)間、pH條件)進(jìn)行熱處理，分離酪蛋白，得到乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；
ii) 將巿售乳品(如為脫脂乳，則直接去除酪蛋白)脫脂，分離酪蛋白，得到乳清蛋白待測(cè)樣品；
所述脫脂是將乳品在7500g 10000g下離心12 20min脫脂；所述分離酪蛋白是用酸調(diào)整pH至4.6，靜置12 20min后離心除去酪蛋白；調(diào)節(jié)p H所用酸為食品工業(yè)常用的鹽酸、檸檬酸或乳酸等。
3) 活性凝膠電泳
i) 制備8~12%的分離膠，4 6%濃縮膠的活性丙烯酰胺凝膠，所有電泳材料中均不含有蛋白變性劑，如SDS等。
ii) 將乳清蛋白與上述2倍活性蛋白上樣緩沖液以1: 3 5的比例混合后離心，根據(jù)凝膠上樣孔徑的大小，上樣量為7.5 12pL。
iii) 具體電泳條件參數(shù)為
電泳緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3);
上樣量乳清蛋白:上述2倍活性蛋白上樣緩沖液=1:3~5，
7.5 12|iL;電壓75V 150V， 25min ~ 75min;
溫度2 4°C。
iv)電泳結(jié)束后進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán)R250染色，染色后進(jìn)行快速 脫色。
其中，乳清蛋白樣品與樣品緩沖液混合后直接進(jìn)行電泳分析，不 需進(jìn)行加熱變性處理。
快速染色過(guò)程可由直接使用快速R250染色液實(shí)現(xiàn)，或?qū)ΤＲ?guī) R250染色進(jìn)行適度加熱，20min即可完成染色過(guò)程。
3)數(shù)據(jù)處理分析以乳清蛋白中的指示蛋白為對(duì)象，對(duì)凝膠進(jìn) 行凝膠成像分析，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
根據(jù)上述步驟，分別建立乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(與待測(cè)品相同熱處理 工藝)的標(biāo)準(zhǔn)活性凝膠電泳圖譜和待測(cè)品的活性凝膠電泳圖譜，將圖 譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，鑒定巿售乳品品質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明的方法，新鮮牛乳的活性凝膠電泳結(jié)果有 4條條帶清晰、分離效果明顯的乳清蛋白活性電泳條帶，經(jīng)切膠進(jìn)行 SDS-丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)Marker分子量和鮮乳乳清蛋白圖譜鑒定 這4條活性電泳條帶分別為牛血清蛋白(BSA)、 a-乳白蛋白(a-La)、 卩-乳球蛋白A (卩-LgA)和(3-乳球蛋白B ((3-LgB);而且這4條活性電 泳條帶隨著熱處理溫度、時(shí)間、pH的改變，呈現(xiàn)規(guī)律的變化。該特 點(diǎn)為鑒定乳制品產(chǎn)品品質(zhì)提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
當(dāng)然，該方法也可用于鑒定未知熱處理工藝的巿售乳品的熱處理 條件。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
1) 樣品用量少微量檢測(cè)是實(shí)施熱處理乳品鑒定檢測(cè)的關(guān)鍵， 本技術(shù)只需要10!iL乳清蛋白，并可進(jìn)行5次以上重復(fù)分析；另外，分 離的乳清蛋白可在-20°C長(zhǎng)期保存而不影響分離結(jié)果。
2) 多個(gè)樣品、多批樣本可同時(shí)進(jìn)行分離 一塊凝膠可最多有15個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分離， 一個(gè)電泳槽可最多有30個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分離。配備多個(gè)垂直電泳裝置，可實(shí)現(xiàn)多批樣本的同時(shí)分離。
3) 活性電泳模式分辨度、靈敏性高，易于應(yīng)用能夠找到4條條帶清晰、分離效果明顯的乳清蛋白活性電泳條帶，這4條活性電泳條帶隨著熱處理溫度、時(shí)間、pH的改變，呈現(xiàn)規(guī)律的變化。與相同電泳條件下的SDS凝膠電泳結(jié)果相比，分辨度、靈敏性均要高，而無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行上樣前的還原。
4) 重復(fù)性好利用上述活性凝膠電泳方法可以獲得較好的重復(fù)性分離，重復(fù)間遷移率和蛋白含量沒(méi)有明顯變化，無(wú)條帶拖尾現(xiàn)象。
5) 分析成本低分析設(shè)備使用的是最普通的垂直電泳裝置，可同時(shí)配備多個(gè)，部分使用試劑可適當(dāng)回收利用。
本發(fā)明利用乳清蛋白電泳條帶隨熱處理?xiàng)l件的變化，可精準(zhǔn)分析各種乳清蛋白含量，能夠靈敏判斷乳品的加工工藝和質(zhì)量狀況，是一種可靠的辨別偽假乳蛋白的技術(shù)方法；根據(jù)該方法，可建立乳品乳清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)活性蛋白變化圖譜，鑒定不同熱處理乳品的真?zhèn)危M(jìn)而形成對(duì)于不同熱處理加工乳制品品質(zhì)的直觀、方便、靈敏、準(zhǔn)確的鑒定體系；由于活性電泳條帶非常清晰，對(duì)于只有一個(gè)氨基酸差別的卩-乳球蛋白變異體A和B具有明顯的分離效果，可用于奶牛個(gè)體遺傳特性差異的鑒定。


圖l:相同樣品的活性凝膠電泳與SDS凝膠電泳比較，圖中所示樣品分別為鮮乳乳清蛋白、65tV30min熱處理牛乳乳清蛋白、85。C/20s熱處理牛乳乳清蛋白、-80°。冷凍牛乳乳清蛋白、巿售UHT(超高溫
瞬時(shí)加熱)鮮乳乳清蛋白。
圖2:不同加熱溫度的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜。加熱時(shí)間為10min 。
圖3:不同加熱時(shí)間的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜。
9加熱溫度為85。C。
圖4:不同pH的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜。加熱強(qiáng)度為85。C/15min, pH梯度為3.0、 5.0、 6.7、 7.0，其中6.7為鮮乳的原始pH。
圖5:不同熱處理方式巿售鮮乳乳清蛋白的活性凝膠電泳鑒定圖譜。所選擇的樣品分別是三元脫脂巴氏乳(巴氏l)、三元加鉤巴氏乳(巴氏2)和三種不同品牌(伊利、蒙牛、光明)的超高溫瞬時(shí)加熱鮮乳。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l活性凝膠電泳圖譜與SDS凝膠電泳電泳比較
取新鮮的牛乳和巿售UHT鮮牛奶，在4X: 8500g下離心15min脫脂，均勻分裝，分為活性凝膠電泳組和SDS凝膠電泳組，將上述兩組的新鮮牛乳樣品(巿售鮮UHT牛奶不進(jìn)行熱處理)分別按照下述工藝進(jìn)行熱處理l)不進(jìn)行熱處理；2) 65°C/30min; 3 ) 85°C/20s; 4)-80°C冷凍24h處理，將熱處理后的樣品冷卻至室溫。
將所有樣品用6。/。乳酸將pH調(diào)至4.6，靜置15min后4°C 8500g下離心15min除去酪蛋白，得到乳清蛋白，將乳清蛋白于-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 制備分離膠為12%、濃縮膠為4。/。的SDS聚丙烯酰胺凝膠。先制備5mL12。/。的分離膠(30% (w/v)丙烯酰胺-0.8% (w/v)甲叉雙丙烯酰胺(A液)2mL; 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8,含0.5。/。十二烷基硫酸鈉(SDS) (B液)，1.25 mL;去離子水，1.75 mL; 10%過(guò)硫酸銨(AP), 50//L;N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED), 10〃L)，過(guò)30min等分離膠凝固以后再制備SmL 4%的濃縮膠(30% (w/v)丙烯酰胺-0.8% (w/v)甲叉雙丙烯酰胺(A液)，0.265mL; 0.5 M Tris-HCl， pi-I 6.8,含0.5。/。SDS十二烷基硫酸鈉(C液)，0.5 mL;去離子水，1.235 mL; 10%過(guò)硫酸銨(AP), 20〃L; N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMEI))， 10//L)。將SDS凝膠電泳組的乳清蛋白樣品與2倍活性蛋白上樣緩沖液(0.1 M Tris-HCl, pH6.8;20。/。(v/v)甘油;2。/。(v/v)SDS;5。/o(v/v)"-巰基乙醇;0.01%溴酚藍(lán))以l: 3的比例混合后離心，上樣7.5iaL。具體電泳條件參數(shù)為
電泳緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3);
電壓75V， 25min; 150V, 45min;
溫度4°C。
在設(shè)定的條件下完成電泳后,將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán)R250染色及快速脫色。最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，制成牛乳乳清蛋白的SDS凝膠電泳圖譜(見(jiàn)圖l-l)。
制備分離膠為10%、濃縮膠為5%的活性丙烯酰胺凝膠。將活性凝膠電泳組的乳清蛋白樣品與2倍活性蛋白上樣緩沖液以1: 4的比例混合后離心，上樣10pL。
以上述同樣的電泳條件參數(shù)進(jìn)行電泳70min，將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán)R250染色及快速脫色。最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，制成牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜(見(jiàn)圖1 -2 )。
圖1 - 2的活性凝膠電泳圖譜中的四條乳清蛋白分別為牛血清蛋白(BSA)、 ot-乳白蛋白U-La)、 (3-乳球蛋白A (P-LgA)和卩-乳球蛋白B(卩-LgB)，顯然，乳清蛋白的分離效果明顯，條帶清晰，隨熱處理?xiàng)l件的不同，各條帶都有明顯的變化；而圖1-1的SDS凝膠電泳圖譜中的條帶雖然清晰，但P-LgA和P-LgB分離效果較差，而且各條帶(BSA、 a-La、 (3-LgA和(3-LgB )隨熱處理?xiàng)l件的變化非常不明顯，并且SDS電泳圖譜中的條帶較多，干擾因素較多，很難用于鑒定乳品品質(zhì)和判定熱處理?xiàng)l件。
實(shí)施例2不同加熱溫度，加熱時(shí)間，pH值下的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜
1)不同加熱溫度，相同加熱時(shí)間的熱處理牛乳乳清蛋白的活性新鮮的牛乳在4'C 8500g下離心15min脫脂，均勻分裝，分別在65"C、 75°C、 85°C、 95°C、 IO(TC進(jìn)行加熱，加熱時(shí)間為10min，加熱后樣品進(jìn)行迅速冷卻。冷卻至室溫后，用2。/。鹽酸將pH調(diào)至4.6,靜置15min后4i: 10000g下離心15min除去酪蛋白，所得上清液即為乳清蛋白。將乳清蛋白分裝于-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 制備分離膠為8%、濃縮膠為4%的活性丙烯酰胺凝膠。將乳清蛋白樣品與2倍活性蛋白上樣緩沖液(0.1 M Tris-HCl， pH6.8; 20% (v/v)甘油；0.01%溴酚藍(lán))以l: 3的比例混合后離心，上樣10pL。具體電泳條件參數(shù)為
電泳緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3);
電壓75V， 30min; 120V， 40min;
溫度 2 C o
在設(shè)定的條件下進(jìn)行電泳70min后,將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán)R250染色及快速脫色。最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，制成不同加熱溫度、相同加熱時(shí)間的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜(見(jiàn)圖2)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，隨著熱處理溫度的提高，活性凝膠電泳圖譜中的條帶都有明顯的變化，對(duì)熱處理溫度最為敏感的是牛血清蛋白(BSA)條帶，其次是(3-LgA和(3-LgB條帶，而oc-La條帶隨熱處理溫度的變化較小。
2)相同加熱溫度，不同加熱時(shí)間的熱處理牛乳乳清蛋白的活性
新鮮的牛乳在4匸7500g下離心20min脫脂，均勻分裝，在85。C、加熱，加熱時(shí)間為5min， 10min， 20min和30min，加熱后樣品進(jìn)行迅速冷卻。冷卻至室溫后，用2。/。鹽酸將pH調(diào)至4.6，靜置15min后4。C8000g下離心20min除去酪蛋白，所得上清液即為乳清蛋白。將乳清蛋白置于-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 制備分離膠為8%、濃縮膠為4%的活性丙烯酰胺凝膠。將乳清蛋白樣品與活性蛋白上樣緩沖液以l: 3的比例混合后離心，上樣10pL。
在上述設(shè)定的條件下進(jìn)行電泳70min后,將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán)R250染色及快速脫色。最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，制成相同加熱溫度、不同加熱時(shí)間的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜(見(jiàn)圖3)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，活性凝膠電泳圖譜中的條帶都有明顯的變化，對(duì)熱處理時(shí)間最為敏感的是牛血清蛋白(BSA)條帶，其次是P-LgA和(3-LgB條帶，而a-La條帶隨熱處理時(shí)間的變化較小，但顯然加熱時(shí)間增加到20min，牛乳乳清蛋白中的大部分活性蛋白就已經(jīng)滅活。
3 )不同pH的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜
取新鮮牛乳，以上述相同方式脫脂，均勻分裝，分為兩組，用5c/。的檸檬酸調(diào)整pH值，分別為3.0、 5.0、 6.7、 7.0,其中6.7為鮮乳的原始酸度(未加檸檬酸)， 一組在85。C加熱15min，另一組在75。C加熱15min，加熱后樣品進(jìn)行迅速冷卻至室溫。然后將兩組樣品都用2%鹽酸將pH調(diào)至4.6,靜置15min后4。C8500g下離心15min除去酪蛋白，所得上清液即為乳清蛋白。將乳清蛋白分裝于-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 用以上述相同方式進(jìn)行活性丙烯酰胺凝膠電泳，最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，得到相同加熱溫度、加熱時(shí)間，不同酸度熱處理的牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜(見(jiàn)圖4)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在75。C加熱處理15min的樣品中的乳清蛋白對(duì)酸度的敏感度小于在85"C加熱處理15min的樣品。顯然，牛乳熱處理方式中的酸度的變化對(duì)乳清蛋白有 一 定影響。
以上圖譜說(shuō)明了熱處理方式溫度，時(shí)間和酸度對(duì)乳清蛋白的影響，顯然本發(fā)明的活性電泳方法非常適于判定不同乳品的熱處理方式
13和鑒定巿售熱處理乳品的品質(zhì)。
實(shí)施例3不同加熱溫度、不同加熱時(shí)間的熱處理牛乳乳清蛋白的活 性凝膠電泳鑒定
新鮮的牛乳在4'C 8500g下離心15min脫脂，均勻分裝進(jìn)行65。C、 75°C、 85°C、 95°C、 IO(TC加熱，每一個(gè)溫度又分為不同的加熱時(shí)間 梯度，分別為5、 10、 20、 30min。加熱后樣品進(jìn)行迅速冷卻。冷卻至 室溫后，用6。/。乳酸將pH調(diào)至4.6,靜置15min后4。C8500g下離心15min
除去酪蛋白，所得上清液即為乳清蛋白。將乳清蛋白分裝于-20。C儲(chǔ)
存?zhèn)溆谩?br> 制備分離膠為10%、濃縮膠為4%的活性丙烯酰胺凝膠。將乳清 蛋白樣品與活性蛋白上樣緩沖液以1: 3的比例混合后離心，上樣12pL。 具體電泳條件參數(shù)為
電泳緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3);
電壓120V， 60min;
溫度 2 C 。
在設(shè)定的條件下進(jìn)行電泳60min后，將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán) R250染色及快速脫色。最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，制成不同加熱 溫度、加熱時(shí)間的熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜。
實(shí)施例4不同pH,不同溫度熱處理的牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳 圖譜鑒定
新鮮的牛乳在4t: 8500g下離心12min脫脂，均勻分裝后，將樣品 的pH分別調(diào)整到3.0、 5.0、 6.7、 7.0，進(jìn)行不同溫度(65°C、 75。C、 85°C、 95°C、 100°C )的加熱15min。加熱后樣品進(jìn)行迅速冷卻。冷卻 至室溫后'，用6。/。乳酸將pH調(diào)至4.6，靜置15min后于4。C8500g條件下離 心12min除去酪蛋白，所得上清液即為乳清蛋白。將乳清蛋白分裝于 -2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 制備分離膠為10%、濃縮膠為4%的活性丙烯酰胺凝膠。將乳清蛋白樣品與活性蛋白上樣緩沖液以l: 3的比例混合后離心，上樣 7.5|iL。電泳條件
電泳緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3 );
電壓100V， 25min; 150V, 40min;
溫度2°C。
在設(shè)定的條件下進(jìn)行電泳65min后,將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán) R250染色及快速脫色。最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，制成不同pH的 熱處理牛乳乳清蛋白的活性凝膠電泳圖譜。
實(shí)施例5不同熱處理方式加工的巿售鮮乳乳清蛋白的活性凝膠電泳 鑒定
所選擇的樣品分別是三元脫脂巴氏乳(巴氏i)、三元加4丐巴氏乳
(巴氏2)和三種不同品牌(伊利、蒙牛、光明)的超高溫瞬時(shí)加熱 鮮乳。
不同熱處理方式加工的巿售鮮乳在4i:8500g下離心15min脫脂， 用10。/。乳酸將pH調(diào)至4.6，靜置15min后于4"8500g條件下離心15min
除去酪蛋白，所得上清液即為乳清蛋白。將乳清蛋白分裝于-2(TC儲(chǔ)
存?zhèn)溆谩?br> 制備分離膠為10%、濃縮膠為4%的活性丙烯酰胺凝膠。將乳清 蛋白樣品與活性蛋白上樣緩沖液以l: 3的比例混合后離心，上樣 7.5pL，以新鮮牛乳乳清蛋白為對(duì)照。具體電泳條件參數(shù)為
電泳緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3);
電壓75V， 25min; 150V， 75min;
溫度3°C。
在設(shè)定的條件下進(jìn)行電泳70min后，將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán) R250染色及快速脫色。最后利用凝膠成像分析系統(tǒng)，制成不同熱處 理方式加工的巿售鮮乳乳清蛋白的活性凝膠電泳鑒定圖譜(見(jiàn)圖5 )。
顯然根據(jù)本發(fā)明的活性凝膠電泳方法得到的巿售的乳清蛋白活性電泳圖譜可明顯區(qū)別不同產(chǎn)品的加熱方式，為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜鑒定產(chǎn) 品的熱處理方式提供了理論基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1、一種乳清蛋白的活性凝膠電泳方法，包括樣品制備、活性凝膠電泳和數(shù)據(jù)處理分析，其特征在于，所述活性凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠分離膠的濃度為8～12％，所有電泳材料中均不含有蛋白變性劑；具體電泳條件參數(shù)為電泳緩沖液pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液；上樣量乳清蛋白2倍活性蛋白樣品緩沖液＝1∶3～5，7.5～12μL；電壓75～150V；時(shí)間25～75min；溫度2～4℃。
2、 如權(quán)利要求1所述的乳清蛋白的活性凝膠電泳方法，其特征 在于，乳清蛋白樣品與樣品緩沖液混合后直接進(jìn)行電泳分析，不需進(jìn) 行加熱變性處理。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的活性凝膠電泳方法，其特征在于，所 述活性凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃縮膠的濃度為4 6 % 。
4、 如權(quán)利要求1或3所述的活性凝膠電泳方法，其特征在于，所 述活性凝膠電泳步驟還包括將凝膠進(jìn)行快速考馬斯亮藍(lán)R250染色， 染色后再進(jìn)行快速脫色。
5、 如權(quán)利要求1所述的活性凝膠電泳方法，其特征在于，所述 樣品制備主要是指將乳品脫脂，分離酪蛋白，得到乳清蛋白。
6、 如權(quán)利要求5所述的活性凝膠電泳方法，其特征在于，所述 脫脂是將乳品在7500g 10000g下離心12 20min;所述分離酪蛋白是 用酸調(diào)整乳品的pH至4.6，靜置12 20min后離心除去酪蛋白。
7、 如權(quán)利要求6所述的活性凝膠電泳方法，其特征在于，所述 酸為鹽酸、杼檬酸或乳酸中的一種或多種。
8、 一種鑒定巿售乳品的品質(zhì)的方法，其特征在于，取新鮮乳品和巿售乳品，將新鮮乳品用與巿售乳品相同的熱處理方式處理，將熱 處理后新鮮乳品和巿售乳品進(jìn)行樣品處理，然后進(jìn)行權(quán)利要求1所述 的活性凝膠電泳，得到電泳圖譜，比較圖譜，鑒定巿售乳品的品質(zhì)。
9、 一種鑒定乳品的熱處理方式的方法，其特征在于，將待測(cè)乳 品進(jìn)行樣品處理和活性凝膠電泳，根據(jù)經(jīng)不同熱處理方式的新鮮乳品 的活性凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜，判定待測(cè)乳品的熱處理方式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳清蛋白的活性凝膠電泳方法，該方法利用活性丙烯酰胺凝膠，在下述條件下將乳清蛋白樣品與緩沖液混合后直接進(jìn)行電泳分析電泳緩沖液pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液；上樣量乳清蛋白∶2倍活性蛋白樣品緩沖液＝1∶3～5，7.5μL；電壓75～150V；25～75min；溫度2～4℃。本發(fā)明的活性電泳方法樣品用量少，分辨度、靈敏性高，重復(fù)性好；可精準(zhǔn)分析各種乳清蛋白含量，靈敏判斷乳品的加工工藝和質(zhì)量狀況。
文檔編號(hào)G01N27/447GK101477079SQ20091007651
公開(kāi)日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者姜微波, 林素菊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)