專利名稱：一種基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境類雄激素檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)污染加劇，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物成為繼工業(yè)革命帶來的煤煙污染及汽車工業(yè)帶來的光化學(xué)煙霧污染之后的第3代環(huán)境污染物，將對人類健康產(chǎn)生重要影響。環(huán)境類雄激素(environmental antiandrogen， EA)就是這樣一類重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，他們可模擬體內(nèi)天然的雄激素，與雄激素受體(androgen rec印tor， AR)競爭性結(jié)合，阻止體內(nèi)雄激素與AR的結(jié)合，充當(dāng)AR拮抗劑，從而抑制雄激素活性，發(fā)揮類雄激素作用，動物胚胎期暴露可導(dǎo)致生殖器官發(fā)育不全或缺失(特別是副睪)、外生殖器畸形(尿道下裂)、隱睪、肛門與生殖器距離縮短等生殖毒性和畸形。目前報道的EA主要涉及一些非甾體藥物如氟他胺(flutamide， FLU)、非那雄胺(finasteride, FIN)，農(nóng)藥中的殺蟲劑、殺菌劑和除草劑及其代謝產(chǎn)物，如合成除蟲菊酯類(pyrethroids) 、 DDT的代謝產(chǎn)物p， p' -DDE、甲氧滴滴涕(methoxychlor)、殺菌禾U (procymidone)、烯菌酮(vinclozolin， V)及其代i射產(chǎn)物M丄禾口M2等。 因為環(huán)境類雄激素以痕量的形式存在于污水、土壤等環(huán)境中，其檢測常常受到諸多限制，成為近年來研究熱點之一。 傳統(tǒng)的檢測方法中多以GC和GC-MS法作為檢測EA的標準方法。但由于EA通常以痕量混合物的形式存在，各種物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)差異很大，且環(huán)境中存在著大量化學(xué)物，采用傳統(tǒng)的萃取富集、高效液相色譜/質(zhì)譜/氣相色譜等方法分離出單一成分并測定含量，其分析手段復(fù)雜、操作繁瑣、費時費力、設(shè)備昂貴、需要專門高級訓(xùn)練，并且很難達到所有痕量成分的完全解析；雖然免疫學(xué)技術(shù)檢測靈敏度和通量較高，但僅能檢測具備特異抗體的部分物質(zhì)；而傳統(tǒng)的受體結(jié)合試驗因為需要放射性同位素標記而使其應(yīng)用受到了很大的限制。所以必須探索快速、高通量、靈敏度高且重復(fù)性好的廉價篩選方法。 實際上，評估痕量混合物的綜合生物學(xué)效應(yīng)及累加毒性當(dāng)量(TEQ)更有意義。目前基于受體配體結(jié)合的篩選方法，既可以反映EA的結(jié)合量，又能綜合反映EA的類雄激素樣累加毒性當(dāng)量，且易于實現(xiàn)高通量，是最近幾年EA高通量篩選和監(jiān)測的新方向。Gaido等(GaidoK W， et al. Toxicol A卯l Pharmacol, 1997， 143 (1) :205-212)采用重組酵母測評體系評價環(huán)境類雄激素誘導(dǎo)的酵母細胞內(nèi)結(jié)合效應(yīng)，但此方法檢出在P M nM水平，靈敏度和準確性尚不理想。 經(jīng)典雄激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論認為，內(nèi)源性雄激素作為配體與雄激素受體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚體化變構(gòu)并暴露DNA結(jié)合區(qū)，使特異的DNA序列即雄激素效應(yīng)元件(Androgen response elements, ARE)與之結(jié)合，剌激靶基因轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出各種生理效應(yīng)(Foradori C. D. ， et al. FrontNeuroendocrinol. 2008 ;29 (2) :169-181)。 ARE的核心序列
3為5' -GGAACAnnnTGTATC-3' (n為任意核苷酸)。環(huán)境類雄激素，也即EA，主要以與內(nèi)源 雄激素如雙氫睪酮(DHT)類似的形式，通過AR介導(dǎo)而產(chǎn)生相應(yīng)的病理性效應(yīng)?；诖诵奂?素受體介導(dǎo)原理可檢測環(huán)境類雄激素的綜合累加毒性當(dāng)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種廉價、快速、高通量的基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測 環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的ELISA試劑盒。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的，即一種基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類
雄激素毒性當(dāng)量的ELISA試劑盒，其特征在于其組成包括探針，雄激素受體蛋白，結(jié)合緩
沖液， 一抗包被的聚苯乙烯酶標板，酶混合液，底物顯色液，終止液，10 X濃縮洗滌液，標準
品，質(zhì)控品；所述探針為5'端用生物素標記的雙鏈DNA，該序列含有至少一個雄激素反應(yīng)
元件核心序列5 ' -GGAACAmnTGTATC-3 '，其中n為任意核苷酸，能特異結(jié)合配體_AR 二
聚體；所述結(jié)合緩沖液每升由1. 2 12. 5g Tris-HCl，O. 1 1. 5g EDTA，7. 5 35g KC1，
0. 1 2g二硫赤蘚糖醇，1 5g牛血清白蛋白，50 100ml甘油及余量為去離子水組成；
所述一抗包被的聚苯乙烯酶標板所包被的一抗為雄激素受體單克隆抗體；所述標準品為
1X10—6mol/L的睪酮或雙氫睪酮；質(zhì)控品為5ng/ul的所述探針。 本發(fā)明的一個非限定性的實施例中，探針的核苷酸正鏈序列為SEQ Nol。 上述酶混合液為含有鏈親和素標記的辣根過氧化物酶的PBS緩沖液。 10 X濃縮洗滌液每升由80gNaCl， 11. 5g Na2HP04 2H20， 2g KH2P04，2g KC1、
5mlTween-20、0. 5g poly(dl:dC)及余量為去離子水組成的混合液。 底物顯色液分為A、 B兩種，分別含有過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺TMB。 終止液為lmol/L的硫酸。 本試劑盒中重組人雄激素受體蛋白組分保存于-70 °C ，探針保存于-20 °C ，盡量減 少反復(fù)凍融，其余組分保存于4°C 。 本發(fā)明利用配體-受體生物學(xué)激活效應(yīng)的高效、特異性，生物素-親和素的放大效 應(yīng)和辣根過氧化酶催化底物顯色的靈敏性，以及ELISA操作的便捷性，構(gòu)建了痕量環(huán)境類 雄激素(EA)累加毒性當(dāng)量(TEQ)的快速ELISA檢測試劑盒，實現(xiàn)痕量環(huán)境類雄激素TEQ的 廉價、快速、高通量監(jiān)測。 本發(fā)明試劑盒使用方法包括以下步驟 (1)標準品用結(jié)合緩沖液稀釋為1 X 10—6mol/L 1 X 10—12mol/L共7個梯度；雄激 素受體蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋為2X10—9mol/L ;10X濃縮洗滌液用去離子水稀釋為IX洗 滌液； (2)受體配體體外結(jié)合總體積lOOul，其中含50ul標準品或含環(huán)境類雄激素的 待檢樣品，50ul稀釋后的雄激素受體，于4t:振搖孵育1小時，然后37t:孵育30分鐘，再加 入探針lul， 37t:反應(yīng)10分鐘，成生物素DNA探針-雄激素受體-環(huán)境類雄激素復(fù)合物；以 50ul不含樣品或不含標準品的結(jié)合緩沖液作為本底對照；所有反應(yīng)均做復(fù)孔；
(3)ELISA反應(yīng)將步驟(2)的復(fù)合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶標板中，室溫 孵育1小時，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入50ul鏈親和素標記的辣根過氧 物酶， 37t:孵育0. 5-1小時，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入顯色液A和B各50ul， 37。C孵育15分鐘，加入50ul終止液；同時做ELISA的質(zhì)控品和試劑空白對照； (4)酶標儀檢測在ELISA檢測儀上，以試劑空白對照調(diào)零，以630nm波長做校正， 于450nm波長處，測定各孔吸光度值； (5)結(jié)果計算相對結(jié)合量=樣本或標準品吸光度值_本底對照吸光度值，與以睪 酮或雙氫睪酮為標準品所作的標準曲線作比對，確定待測樣品中類雄激素物質(zhì)相對于睪酮 或雙氫睪酮的累計當(dāng)量。 本發(fā)明試劑盒操作簡便、快捷，技術(shù)平臺要求不高，普通實驗室即可開展；在1-2 天內(nèi)能出具結(jié)果、試驗周期極短；靈敏度高，檢測限可達到PM級?？蓮V泛用于食品、環(huán)境檢 測等領(lǐng)域。


附圖1為以雙氫睪酮(DHT)為標準品作的標準曲線示意圖；
附圖2顯示了各種EA與ARE的結(jié)合能力。
具體實施例方式
下面的實施例意在說明實施本發(fā)明的現(xiàn)已知的一個最佳的實施方案，但是不應(yīng)該 認為本發(fā)明局限于這些實施例。 實施例l 一抗包被的聚苯乙烯酶標板的制備 用包被緩沖液將AR的單克隆抗體成10ug/ml，混勻。向酶標板孔內(nèi)加入10ug/ml的 抗體溶液100ul，酶標板膜封后fC過夜。棄包被的抗體溶液，洗滌液洗板5次，每次3分鐘。 在紙巾上將酶標板拍干，每孔加入封閉液200ul，4t:封閉過夜。棄封閉液，用洗滌液洗滌5 次，每次3分鐘，將酶標板真空干燥，密封入帶干燥劑的金屬箔袋內(nèi)，fC保存。其中，包被緩 沖液為pH9.6的碳酸緩沖液，含有15mmol/L碳酸鈉(Na2C03) ， 35mmol/L碳酸氫鈉(NaHC03); 封閉液為含5% BSA和0. 05%吐溫-20的PBS溶液；洗滌液為pH7. 4的磷酸鹽緩沖液含有 0. 05 %吐溫-20， 0. 05mg/mlpoly (dl: dC) ， 1. 5,1/L磷酸二氫鉀(KH2P04) ， 8,1/L磷酸氫 二鈉(Na2HP04) ， 140mmol/L氯化鈉(NaCl) ， 2. 5mmol/L氯化鉀。
實施例2生物素標記的雙鏈DNA探針的制備合成5'端用生物素標記的DNA探針正鏈5' -Biotin-AGACCTACTCTGGAGGAACATA
CAGAGTAGGTCT-3'，用SEQ No2表示。序列由上海生物工程有限公司標記和合成。用退火 緩沖液(10mM Tris-HCl，50mMNaCl， ImM EDTA，pH = 8.0)溶解DNA探針正鏈及其互補鏈，使 其終濃度為20 100umol/L。將二條鏈等摩爾混合，于94。C保溫5分鐘后、45。C保溫5分 鐘，冷卻至室溫，SDS-PAGE純化雙鏈DNA探針，測定濃度后，用TE稀釋探針至濃度為5ng/ ul，裝入1. 5ml朔料離心管，-20。C保存。
實施例3生物素標記的雙鏈DNA探針的制備合成5'端用生物素標記的DNA探針正鏈5' -Biotin-GGCACTACTCTGGAGGAACACG
5CAGAGTAGTGCC-3'，用SEQ No4表示。序列由上海生物工程有限公司標記和合成。用退火 緩沖液(10mM Tris-HCl，50mMNaCl， ImM EDTA，pH = 8.0)溶解DNA探針正鏈及其互補鏈，使 其終濃度為20 10Oumol/L。將二條鏈等摩爾混合，于94。C保溫5分鐘后、45。C保溫5分 鐘，冷卻至室溫，SDS-PAGE純化雙鏈DNA探針，測定濃度后，用TE稀釋探針至濃度為5ng/ ul，裝入1. 5ml朔料離心管，-20。C保存。
實施例4待檢樣品和標準品的ELISA檢測 以具有代表性的雄激素和環(huán)境類雄激素，如睪酮(T)、羥基氟他胺(OH-FLU)、孕激 素(Pro)和p， p' -DDE作為待檢樣品，以及以雙氫睪酮(DHT)為標準品，使用本發(fā)明試劑 盒進行檢測，觀察不同雄激素/類雄激素與AR的結(jié)合能力，并測定本發(fā)明試劑盒的靈敏度 (檢測下限)和準確性(回收率)。包括以下步驟 (1)標準品用結(jié)合緩沖液稀釋為IX 10—6mol/L IX 10—12mol/L共7個梯度。其 中，結(jié)合緩沖液每升由5g Tris-HCl，O. 5g EDTA，30g KCl，O. 3g 二硫赤蘚糖醇，2g牛血清白 蛋白，50ml甘油及余量為去離子水組成。 (2)雄激素受體蛋白用上述結(jié)合緩沖液稀釋為2X 10—9mol/L。 (3) 10 X濃縮洗滌液為每升由80gNaCl， 11. 5g Na2HP04 2H20，2g KH2P04，2g KC1、
5ml Tween-20、0. 5g poly(dl:dC)及余量為去離子水組成的混合液；用去離子水稀釋為IX
洗滌液。 (4)受體配體體外結(jié)合總體積100ul，其中含50ul標準品或含環(huán)境類雄激素的待 檢樣品，50ul稀釋后的雄激素受體，于4t:振搖孵育1小時，然后37t:孵育30分鐘，再加入 實施例2得到的探針lul， 37t:反應(yīng)10分鐘，成生物素DNA探針-雄激素受體-環(huán)境類雄 激素復(fù)合物；以50ul不含樣品或不含標準品的結(jié)合緩沖液作為本底對照；所有反應(yīng)均做復(fù) 孔。 (5)ELISA反應(yīng)將步驟(4)的復(fù)合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶標板中，室溫 孵育1小時，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入50ul鏈親和素標記的辣根過氧化物酶， 37t:孵育0. 5-1小時，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入顯色液A和B各50ul， 37。C孵育 15分鐘，加入50ul終止液。同時做ELISA的質(zhì)控品和試劑空白對照。 (6)酶標儀檢測在ELISA檢測儀上，以試劑空白對照調(diào)零，以630nm波長做校正， 于450nm波長處，測定各孔吸光度值，也即OD值。 (7)結(jié)果計算相對結(jié)合量=樣本或標準品OD值-本底對照OD值。用spss 13. 0 軟件擬合以雙氫睪酮(DHT)為標準品的標準曲線，見附圖1。待檢樣品與標準曲線作比對， 確定待測樣品中類雄激素物質(zhì)相對于DHT的累計當(dāng)量。 (8)結(jié)果結(jié)果顯示，結(jié)合能力順序為DHT " T > Pro > OH-FLU > p，p' -DDE，見 附圖2 。本技術(shù)可在1-2天內(nèi)出具結(jié)果，靈敏度可達pM級，以傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明試劑盒 具有快速、高效、高通量以及準確性、靈敏度高的優(yōu)點。
與本發(fā)明有關(guān)的核苷酸序列 〈110〉中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 〈120〉 一種基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的ELISA試劑
〈160>4
6
〈170〉 〈210>1 〈211>75 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221〉結(jié)合探針正鏈 〈223〉根據(jù)雄激素反應(yīng)元件而設(shè)計，含有兩個雄激素反應(yīng)元件，其5'端用生物素
標記，作為結(jié)合雄激素受體的特異序列。 〈400〉 1
TGTATCAAATCTGTTGT-3' 〈210>2 〈211>75 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221〉結(jié)合探針互補鏈 〈223〉為SEQ Nol的互補鏈 〈400>2
GAGTAGGTCT-3' 〈210>3 〈211>75 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221〉結(jié)合探針正鏈 〈223〉根據(jù)雄激素反應(yīng)元件而設(shè)計，含有兩個雄激素反應(yīng)元件，其5'端用生物素
標記，作為結(jié)合雄激素受體的特異序列。 〈400>3
TGTATCACATCTGCCTA-3' 〈210>4 〈211>75 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221〉結(jié)合探針互補鏈
〈223〉為SEQ No3的互補鏈
〈400>4
GAGTAGTGCC—3'
權(quán)利要求
一種基于介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的ELISA試劑盒，其特征在于其組成包括探針，雄激素受體蛋白，結(jié)合緩沖液，一抗包被的聚苯乙烯酶標板，酶混合液，底物顯色液，終止液，10×濃縮洗滌液，標準品，質(zhì)控品；所述探針為5′端用生物素標記的雙鏈DNA，該序列含有至少一個雄激素反應(yīng)元件核心序列5′-GAACAnnnTGTATC-3′，其中n為任意核苷酸，能特異結(jié)合配體-雄激素受體二聚體；所述結(jié)合緩沖液每升由1.2～12.5g Tris-HCl，0.1～1.5g EDTA，7.5～35g KCl，0.1～2g二硫赤蘚糖醇，1～5g牛血清白蛋白，50～100ml甘油及余量為去離子水組成；所述一抗包被的聚苯乙烯酶標板所包被的一抗為雄激素受體單克隆抗體；所述標準品為1×10-6mol/L的睪酮或雙氫睪酮；質(zhì)控品為5ng/ul的所述探針。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的 ELISA試劑盒，其特征是探針的核苷酸正鏈序列為SEQ Nol或SEQ No3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的 ELISA試劑盒，其特征是所述酶混合液為含有鏈親和素標記的辣根過氧化物酶的PBS緩沖 液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的 ELISA試劑盒，其特征是10X濃縮洗滌液每升由80gNaCl， 11. 5g Na^PC^ *2H20，2g KH2P04， 2g KCl、5ml Tween-20、0. 5g poly(dl:dC)及余量為去離子水組成的混合液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的 ELISA試劑盒，其特征是底物顯色液分為A、 B兩種，分別為過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的 ELISA試劑盒，其特征是終止液為lmol/L的硫酸。
7. —種采用權(quán)利要求1所述試劑盒進行檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的方法，包括以下 步驟(1) 標準品用結(jié)合緩沖液稀釋為1X10—6mol/L 1X10—"mol/L共7個梯度；雄激素 受體蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋為2X10—9mol/L ;10X濃縮洗滌液用去離子水稀釋為IX洗滌 液；(2) 受體配體體外結(jié)合總體積100ul，其中含50ul標準品或含環(huán)境類雄激素的待檢樣 品，50ul稀釋后的雄激素受體，于4t:振搖孵育1小時，然后37t:孵育30分鐘，再加入探針 lul，37t:反應(yīng)10分鐘，成生物素DNA探針-雄激素受體-環(huán)境類雄激素復(fù)合物；以50u 1不含樣品或不含標準品的結(jié)合緩沖液作為本底對照；所有反應(yīng)均做復(fù)孔；(3) ELISA反應(yīng)將步驟(2)的復(fù)合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶標板中，室溫孵育 1小時，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入50ul鏈親和素標記的辣根過氧化物酶，37t:孵 育0. 5-1小時，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入顯色液A和B各50ul， 37。C孵育15分 鐘，加入50ul終止液；同時做ELISA的質(zhì)控品和試劑空白對照；(4) 酶標儀檢測在ELISA檢測儀上，以試劑空白對照調(diào)零，以630nm波長做校正，于 450nm波長處，測定各孔吸光度值；(5) 結(jié)果計算相對結(jié)合量=樣本或標準品吸光度值_本底對照吸光度值，與以睪酮或 雙氫睪酮為標準品所作的標準曲線作比對，確定待測樣品中類雄激素物質(zhì)相對于睪酮或雙 氫睪酮的累計當(dāng)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于雄激素受體介導(dǎo)原理的檢測環(huán)境類雄激素毒性當(dāng)量的ELISA試劑盒。本發(fā)明試劑盒包含探針，雄激素受體蛋白，結(jié)合緩沖液，一抗包被的聚苯乙烯酶標板，酶混合液，底物顯色液，終止液，10×濃縮洗滌液，標準品，質(zhì)控品。所述探針為5′端用生物素標記的雙鏈DNA，該序列含有至少一個雄激素反應(yīng)元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，通過與以睪酮或雙氫睪酮為標準品所作的標準曲線作比對，確定待測樣品中類雄激素物質(zhì)相對于雙氫睪酮的毒性當(dāng)量。本發(fā)明試劑盒操作簡便、靈敏、通量高，檢測限可達pM級?？蓮V泛用于食品、環(huán)境檢測等領(lǐng)域。
文檔編號G01N21/31GK101726599SQ20091019191
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者毛青, 王莎莎, 章容, 譚文婷, 鄧國宏 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院