專利名稱：一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于感染性疾病檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及到一種丙型肝炎病毒及其表面包 膜抗原E2的試劑盒，同時還涉及一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2試劑盒的檢測方 法，它適用于丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒抗原的檢測。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播的疾病，丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV)慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌 (HCC)，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴(yán)重的社會和公共衛(wèi)生問題。丙型肝炎呈全 球性流行，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV 的感染率約為3%，估計約1. 7億人感染了 HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3. 5萬例。丙型 肝炎目前尚無有效疫苗，也沒有有效的治愈方法。因此，控制丙型肝炎只能從傳染源和傳播 途徑入手，早期準(zhǔn)確診斷和發(fā)現(xiàn)HCV感染者就是防控丙型肝炎傳染源、阻斷傳播途徑最為 有效的手段。所以，世界各國都不遺余力的研究丙型肝炎的診斷新技術(shù)。自從1989年建立了丙肝病毒抗-HCV檢測方法以來，丙型肝炎的檢測技術(shù)就處于 不斷發(fā)展中。到目前為止，丙型肝炎檢測技術(shù)主要有抗-HCV檢測、HCV-RNA核酸擴增檢測、 和HCV核心抗原的檢測。目前用于臨床HCV感染檢測的主要指標(biāo)僅為抗HCV和HCV-RNA，但 兩者在丙肝診斷中均存在一定的局限性，如對于免疫功能不正常、或“窗口期”的HCV感染 者，則不能檢出抗-HCV，有一定的漏檢率；HCV RNA其操作復(fù)雜，而且儀器特殊、檢測費用昂 貴，在一般實驗室不易開展。作為HCV感染的檢測手段，HCV表面抗原檢測丙型肝炎病毒的 感染具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的是在于提供了一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒，該 試劑可以檢測丙型肝炎病毒的感染，檢測速度快，操作方便安全，省時效率高，而且價格低 廉，檢測靈敏度和精確度都很高，應(yīng)用前景廣闊。發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑 盒檢測丙型肝炎病毒的方法，該試劑盒優(yōu)于HCV抗體檢測法，本方法可以檢測窗口期，即病 毒感染的早期或潛伏期，有利于早期對病人的防治；另外在成本和操作上也優(yōu)于HCV-RNA 核酸擴增檢測法，比HCV-RNA核酸擴增檢測法成本低，操作更簡便，檢測靈敏度和精確度 高。本發(fā)明試劑盒對丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2檢測的方法是利用一種能特異性 結(jié)丙型肝炎病毒表面包膜抗原E2的單鏈DNA適配子作為探針，采用丙型肝炎病毒及其表面 包膜抗原E2多克隆抗體包被孔板，生物素標(biāo)記的該DNA適配子作為探針，類似夾心ELISA 法，用于檢測血清或體液中丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施—種丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體，酶標(biāo)板(購自海門市三和新華玻璃實驗儀器廠)，生物素 標(biāo)記核酸適配子ZE18，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(購自北京博奧生物技術(shù)有限公 司)及其顯色底物3’，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公 司)。所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體(或抗血清)的制備將 丙型肝炎病毒包膜抗原E2的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1A-E2 (來源于Vaccine，2007，25 1544-1551)，肌肉多點注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫注射100 200微克質(zhì) 粒DNA，注射三次，用基因電導(dǎo)入儀(購自寧波新芝生物科技有限公司)在注射部位電極 導(dǎo)入DNA，第三次注射后2周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重組蛋自(來源于Vaccine， 2007,25 :1544-1551)加強免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100微克蛋白，兩周后心臟取 血，IOOOrpm離心分離血清，即為丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體(或抗血清)。保 存于-80°C。所述的核酸適配子觀18為本發(fā)明者通過SELEX篩選技術(shù)，通過篩選到的能特異性 結(jié)合丙型肝炎病毒包膜抗原E2的單鏈DNA適配子，命名為觀18(具體步驟見發(fā)明專利申 請?zhí)?200810197315. 4，發(fā)明人章曉聯(lián)，陳芳)。所述的生物素標(biāo)記核酸適配子觀18 將觀18序列送公司合成，公司合成生物素標(biāo) 記觀18的5，端(命名為bio-ZE18)。并用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。 新型生物素標(biāo)記的DNA適配子具有SEQIDN0. 1，所示的核苷酸序列；一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒檢測丙型肝炎病毒的方法，檢測步驟是1、將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效價為1 12800， PBS稀釋)包被酶標(biāo)板(如96孔)，4度過夜。2、含有 5/10000 吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至IOOOml，調(diào)pH至7. 4，15磅滅菌20min,置4°C 保存)，洗滌六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封閉96孔板，100 μ 1/孔，37度封 閉1小時。4、加入待檢樣品、包括HCV病毒(來源于Cell Mol Immunol. 2009,6(4) :235-44)、 HCV病毒陽性血清、或?qū)φ諛悠罚?00 μ 1/孔，37度孵育1小時。5、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。6、加入 bio4E18G00nM/孔，PBS 稀釋)，37 度孵育 1 小時。7、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。8、加入加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀釋)，100 μ 1/孔，37度孵育1小時。9、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。10、加入底物顯色劑(TMB) (TMB干粉10mg，溶于5ml無水乙醇中Qmg/ml)。pH5. 0 顯色液IOml中，加入ang/ml TMB 0.5ml，再加入2μ1 30% H2O2，臨用前配制)顯色2min， 用2M濃硫酸中止顯色。本發(fā)明中所用的底物顯色劑配方包括A底物是TMB 20mg(固體)， 先用無水乙醇IOml溶解，充分振蕩(試劑瓶要干凈，干燥)，加雙蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底物是取1水檸檬酸2. lg，無水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的過氧化氫0. 6細(xì)1，雙 蒸水定容至100ml (無須調(diào)pH值，應(yīng)在4. 5-5. 0范圍)，此即是B底物。使用時，A底物與B 底物各取5ml混勻。11、1小時內(nèi)在Themo scientific Multskan mk3多功能酶標(biāo)儀450nM下檢測吸 光度。檢測結(jié)果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒E2抗原或HCV感染陽性病人及其丙型肝炎 病毒E2抗原陽性病人的0D450值均大于設(shè)定的臨界值(cutoff值)，而陰性樣品或正常健 康人的0D450值均小于臨界值(cutoff值)，cutoff值=0. 1 X陽性對照的平均0D450值 +陰性對照的平均0D450值。說明本試劑盒的檢測結(jié)果能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、或 HCV感染感染患者與正常健康人或非丙型肝炎病毒感染感染患者的不同。本發(fā)明的優(yōu)點是核酸適配子體外容易合成，且能特異性與丙型肝炎病毒包膜抗 原結(jié)合，而不與其他病毒等病原體結(jié)合，同時對于丙型肝炎病人陽性的血清，都能表現(xiàn)出高 于臨界值(cutoff值)的OD值，而對于陰性的，OD值都在臨界值(cutoff值)以下，說明 核酸適配子檢測有較高的靈敏性。因此，對于核酸適配子在丙型肝炎病人的早期診斷方面， 在臨床上有很大的應(yīng)用前景。


圖1本試劑盒檢測HCV、HCVE2抗原特異性的鑒定丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及與HCV陽性病人血清的結(jié)合OD值 明顯高于對健康正常人血清的OD值，有顯著差別，*p < 0. 05，有很高的特異性。圖2本發(fā)明試劑盒檢測HCV、以及不同病人特異性的鑒定本發(fā)明試劑盒分別檢測丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙或丙肝 陽性病人血清、結(jié)核(TB)陽性病人血清等，檢測結(jié)果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜 抗原E2、以及與丙肝(HCV)陽性病人血清的結(jié)合OD值明顯高于對其他病人血清的OD值， 有顯著差別，*P < 0.05。說明本法能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原 E2、以及丙肝(HCV)陽性病人與其他病人間的不同。圖中HBV patients 代表HBV陽性病 人血清；TB patients 代表結(jié)核TB陽性病人血清；HCV patients 代表HCV陽性病人血清； Healthy donors 代表健康正常人血清。
具體實施例方式實施例1 本試劑盒檢測HCV病人特異性的鑒定本試劑盒檢測丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及IM份HCV陽性病人 血清和135份健康正常人血清。對象丙型肝炎病毒來源于Cell Mol Immunol. 2009,6 ) :235-44 ；丙型肝炎 病毒包膜抗原 E2 來源于 Vaccine，2007，25 :1544-1551 ；HCV 感染者:2007-03/2008-08 在 武漢大學(xué)中南醫(yī)院、武漢市傳染病醫(yī)院等臨床診斷明確為丙型肝炎病毒(HCV)感染的患 者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲。部分患者使用干擾素 進行抗病毒治療；非HCV感染者同期在武漢大學(xué)中南醫(yī)院就醫(yī)、臨床已排除HCV感染的患 者，平均年齡35 (8 79)歲。一種丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體，酶標(biāo)板(購自海門市三和新華玻璃實驗儀器廠)，生物素 標(biāo)記核酸適配子ZE18，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(購自北京博奧生物技術(shù)有限公 司)及其顯色底物TMB(購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。生物素標(biāo)記核酸適配子觀18 將觀18序列送公司合成，合成生物素標(biāo)記觀18的 5，端(命名為bio-ZE18)。并用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒檢測丙型肝炎病毒的方法，其檢測步驟如下1、將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效價為1 12800， PBS稀釋)包被96孔ELISA板，4度過夜。2、含有 5/10000 吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至IOOOml，調(diào)pH至7. 4，15磅滅菌20min,置4°C 保存)，洗滌六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (lmg/mLPBS 溶解)封閉 96 孔板，100 μ 1/孔，37 度封閉1小時。4、加入待檢樣品，100 μ 1/孔，37度孵育1小時。2. 5.含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。6、加入 bio4E18G00nM/孔，PBS 稀釋)，37 度孵育 1 小時。7、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍.8、加入加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀釋)，100 μ 1/孔，37度孵育1小時。9、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍.10、加入底物顯色劑(TMB) (TMB干粉10mg，溶于5ml無水乙醇中Qmg/ml)。pH5. O 顯色液IOml中，加入ang/ml TMB 0.5ml，再加入2μ1 30% H2O2，臨用前配制)顯色2min，
用2M濃硫酸中止顯色。11、1小時內(nèi)在Themo scientific Multskan mk3多功能酶標(biāo)儀450nM下檢測吸光 度。檢測結(jié)果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及HCV感染陽性病人及其丙型 肝炎病毒E2抗原陽性病人的0D450值均大于設(shè)定的臨界值(cutoff值)，而正常健康人及 陰性樣品的0D450值均小于臨界值(cutoff值)，cutoff值=0. IX陽性對照的平均0D450 值+陰性對照的平均0D450值。說明本試劑盒的檢測結(jié)果能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患者與正常健康人或非丙型肝炎病毒 感染感染患者的不同。結(jié)果見圖1。實施例2 本發(fā)明試劑盒檢測丙型肝炎病毒、以及不同病人特異性的鑒定分別檢 測丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙肝或丙肝陽性病人血清、結(jié)核陽性病人血清。對象丙型肝炎病毒來源于Cell Mol Immunol. 2009，6 G) :235-44 ；丙型肝炎病 毒包膜抗原 E2 來源于 Vaccine，2007，25 :1544-1551 ；HCV 感染者:2007-03/2008-08 在武 漢大學(xué)中南醫(yī)院、武漢市傳染病醫(yī)院等臨床診斷明確為丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者， 并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲。部分患者使用干擾素進 行抗病毒治療；結(jié)核病人樣本來源于武漢市醫(yī)療救治中心住院病人確診為僅結(jié)核陽性病人；乙肝病人來源于武漢大學(xué)中南醫(yī)院，明確為乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者，并排除 其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲；非HCV感染者同期在武漢大學(xué)中 南醫(yī)院就醫(yī)、臨床已排除HCV，HBV, HIV感染的患者，平均年齡35(8 79)歲。一種丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2 的多克隆抗體，酶標(biāo)板(購自海門市三和新華玻璃實驗儀器廠)，生物素標(biāo)記核酸適配子 觀18，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(購自北京博奧生物技術(shù)有限公司)及其顯色底 物TMB(購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。生物素標(biāo)記核酸適配子觀18的制備將觀18序列送公司合成，合成生物素標(biāo)記 ZE18的5，端(命名為bio-ZE18)。并用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒檢測丙型肝炎病毒的方法，其檢測步驟如下1.將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效價為1 12800， PBS稀釋)包被96孔ELISA板，4度過夜；2.含有5/10000吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS溶液NaCl 8g，KCl 0. 2g， Na2HPO4L 44g, KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至1000ml,調(diào)pH至3. 4. 15磅滅菌 20min,置4°C保存)，洗滌六遍；3. 1 % (g/mL)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封閉96孔板，100 μ 1/孔，37度封 閉1小時；4.加入待檢樣品，100 μ 1/孔，37度孵育1小時；5.含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；6.加入 bio-ZE18 (400nM/ 孔，PBS 稀釋)，37 度孵育 1 小時;7.含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；8.加入加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀釋)，100 μ 1/孔，37度孵育1小時；9. 5/10000 吐溫-20 的 PBS，洗滌六遍.10.加入底物顯色劑，顯色2分鐘，用2Μ濃硫酸中止顯色。本發(fā)明中所用的底物TMB顯色劑配方包括Α底物是TMB 20mg (固體)，先用無水 乙醇IOml溶解，充分振蕩(試劑瓶要干凈，干燥)，加雙蒸水定容到IOOml，此即是A底物； B底物是取1水檸檬酸2. lg，無水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的過氧化氫0. 6細(xì)1，雙蒸水定容 至100ml (無須調(diào)pH值，應(yīng)在4. 5-5. 0范圍)，此即是B底物。使用時，A底物與B底物各取 5ml混勻。11. 1小時內(nèi)在Themo scientific Multskan mk3多功能酶標(biāo)儀450nM下檢測吸光 度。檢測結(jié)果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及丙型肝炎病毒感染陽性病人 及其丙型肝炎病毒E2抗原陽性病人的0D450值均大于設(shè)定的臨界值(cutoff值)，而正常 健康人及陰性樣品、結(jié)核陽性病人，乙肝病人的0D450值均小于臨界值(cutoff值)，cutoff 值=0.1 X陽性對照的平均0D450值+陰性對照的平均0D450值。說明本試劑盒的檢測結(jié) 果能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患 者與乙肝病毒感染患者、結(jié)核病人等的不同。結(jié)果見圖2。實施例3
本發(fā)明試劑盒與HCV-RNA、HCV-Ab檢測相比較對象丙型肝炎病毒；HCV感染者2007-03/2008-08在武漢大學(xué)中南醫(yī)院、武漢市 傳染病醫(yī)院等臨床診斷明確為丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和 HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲。部分患者使用干擾素進行抗病毒治療。②非HCV 感染者同期在武漢大學(xué)中南醫(yī)院就醫(yī)、臨床已排除HCV感染的患者，平均年齡35 (8 79)
歲οHCV-RNA檢測FQ2PCR方法，采用Roche公司LightCycler熒光定量PCR擴增儀 及數(shù)據(jù)處理軟件。檢測試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的丙型肝炎病毒(HCV) Taqman探針法核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒。抗-HCV檢測采用上?？迫A生物技術(shù)工程有限公司提供的酶聯(lián)免疫法原理 (ELISA)抗-HCV檢測試劑盒(主要組分HCV核心抗原和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原包被的微孔板和酶 標(biāo)記特異性抗人IgG)；在意大利SEAC公司生產(chǎn)的Alisei全自動酶免分析系統(tǒng)上檢測，相 關(guān)參數(shù)按試劑說明書設(shè)置。本試劑盒檢測將抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被ELISA板后，洗 后，加入不同病人血清和健康正常人血請對照，經(jīng)反復(fù)洗滌，未結(jié)合的病毒被洗去，結(jié)合在 板上的HCV再用生物素標(biāo)記的適配子捕獲，再經(jīng)反復(fù)洗滌后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈 霉親和素，最后加入底物顯色，顯色終止后，在酶標(biāo)儀450nm的吸收波長上測其OD值。檢測 結(jié)果本試劑盒檢測的OD值高低與病毒含量呈正相關(guān)性；本試劑盒與HCV-RNA、HCV-Ab檢 測結(jié)果相比較呈正相關(guān)性。以上檢測結(jié)果見表一。 麥一本發(fā)明試劑盒與HCV-RNA檢測方法、HCV-Ab抗體檢測相比較
權(quán)利要求
1.一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒，其特征在于試劑盒包括抗丙型肝炎 病毒包膜抗原E2的多克隆抗體；酶標(biāo)板；生物素標(biāo)記核酸適配子觀18 ；辣根過氧化物酶標(biāo) 記的鏈霉親和素及其顯色底物3’，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺；所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體的制備將丙型肝炎病毒包膜抗原 E2的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1A-E2，肌肉多點注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫 注射200g質(zhì)粒DNA，注射三次，用基因電導(dǎo)入儀在注射部位電極導(dǎo)入DNA，第三次注射后2 周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重組蛋白加強免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100 μ g 蛋白，兩周后心臟取血，IOOOrpm離心分離血清，為丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗 體，保存于-80°C ；所述的生物素標(biāo)記核酸適配子觀18 將觀18序列合成，合成生物素標(biāo)記觀18的5’端 為bio-ZE18，用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。
2.權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒檢測 丙型肝炎病毒的方法，其步驟是A、將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被酶標(biāo)板，4度過夜；B、含有5/10000吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，PBS溶液=NaCl8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至IOOOml，調(diào)pH至7. 4，15磅滅菌20min,置4°C 保存，洗滌六遍；CU% g/ml牛血清白蛋白，PBS溶解，封閉96孔板，100 μ 1/孔，37度封閉1小時；D、加入待檢樣品包括HCV病毒HCV病毒陽性血清、或?qū)φ諛悠罚?00μ 1/孔，37度孵育 1小時；Ε、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；F、加入bio-ZE18,400nM/孔，PBS稀釋，37度孵育1小時;G、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；H、加入加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，1 1000，PBS稀釋，100μ 1/孔，37度孵 育1小時；J、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；K、加入底物顯色劑，顯色2分鐘，用2Μ濃硫酸中止顯色；LU小時內(nèi)在多功能酶標(biāo)儀450ηΜ下檢測吸光度；所述的底物顯色劑配方包括Α底物是TMB 20mg，先用無水乙醇IOml溶解，充分振蕩， 加雙蒸水定容到IOOml ；B底物是取1水檸檬酸2. Ig,無水Na2HP042. 82g，0. 75 %的過氧化 氫0. 6細(xì)1，雙蒸水定容至100ml，使用時，A底物與B底物各取5ml混勻。
3.權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒，其特征在于所述的 生物素標(biāo)記核酸適配子ZE18，其序列為SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒及檢測方法。包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體，酶標(biāo)孔板，生物素標(biāo)記單鏈DNA適配子ZE18，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素及其顯色底物。將抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體包被酶標(biāo)孔板，加入丙型肝炎病毒或待檢血清或血液樣品以及對照樣品，經(jīng)洗滌六次，結(jié)合在板上的丙型肝炎病毒或包膜抗原E2再用生物素標(biāo)記的適配子ZE18捕獲，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，加入底物顯色，顯色終止后，在酶標(biāo)儀的吸收波長上測其OD值。本試劑盒檢測速度快，操作方便安全，省時效率高，有效地對丙型肝炎病毒進行檢測。試劑盒價格低廉，檢測靈敏度和精確度很高，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號G01N33/543GK102081093SQ20091027304
公開日2011年6月1日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者章曉聯(lián), 胡藝蘭 申請人:武漢大學(xué)