專利名稱：乙肝病毒核心抗原的免疫顯性hla-a3超型限制性ctl表位及其鑒定方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗原表位，特別涉及乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的免疫顯性 HLA-A3超型(supertype)限制性CTL (細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)表位，還涉及該超型CTL表位 的鑒定方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎Ofepatitis B)是由于感染了乙型肝炎病毒B Ofepatitis B virus, HBV) 引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。目前全球約有4億HBV攜帶者，主要集中在發(fā)展 中國家。在全球范圍內(nèi)，中國屬高流行區(qū)，HBV攜帶者約占總?cè)丝诘?0% (1.2億)，慢性肝 炎患者約3000萬。乙型肝炎多為圍產(chǎn)期傳播、青春期發(fā)病、青壯年惡化，因此其危害人群多 為青壯年。大部分患者感染后通過自然病程痊愈，而部分患者遷延不愈并發(fā)展為肝硬化、肝 癌。據(jù)估計(jì)，全球每年至少有50萬慢性感染患者死于肝硬化和肝癌。乙型肝炎已成為我國 最嚴(yán)重的公共健康問題之一。隨著對(duì)體液保護(hù)性免疫的深入認(rèn)識(shí)和預(yù)防性疫苗的使用，乙 型肝炎的特異性預(yù)防問題基本得到解決，但乙型肝炎的特異性治療至今一直未能突破。目前已證實(shí)=(I)HBV作為一種嗜肝病毒，并不能直接引起肝細(xì)胞損傷，其感染的 病理和臨床后果取決于免疫機(jī)制；(2)作為細(xì)胞內(nèi)感染，慢性持續(xù)性感染狀態(tài)主要與機(jī)體 抗感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答缺陷有關(guān)。其中，HBV特異性CTL反應(yīng)決定了 HBV感染的最終結(jié)果。 感染HBV后，CTL活性高者體內(nèi)病毒被清除而痊愈；CTL活性低或根本檢測(cè)不到的感染者則 發(fā)展為慢性持續(xù)感染狀態(tài)，并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化或/和肝癌。因此，在體啟動(dòng)HBV特異性 CTL反應(yīng)有望解決HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài)及其相關(guān)疾病的防治問題，研制乙型肝炎和乙肝 繼發(fā)性肝硬化、肝癌的治療性疫苗具有非常重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，引起CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)的并非完整的病毒抗原分子，而是抗原來 源的特異性CTL表位?？乖岢始?xì)胞將抗原加工處理成多肽片段，與主要組織相容性復(fù) 合體(MHC) I類分子結(jié)合形成多肽-MHC復(fù)合物(pMHC)，并最終將pMHC呈遞到細(xì)胞表面供 CD8+T細(xì)胞表面的T細(xì)胞抗原受體(TCR)識(shí)別，從而活化CTL，引發(fā)CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)。該 多肽片段即為CTL表位。因此，在HBV相關(guān)抗原中鑒定出免疫顯性CTL表位是慢性乙型肝 炎免疫治療的前提和基礎(chǔ)。CTL表位具有MHC I類分子限制性。既往研究發(fā)現(xiàn)的HBV相關(guān)抗原的免疫顯性 CTL表位多是單一 MHC分子限制性表位，這樣的表位雖然具有很好的免疫原性，但由于其適 用人群受限于單一的MHC等位基因背景，在臨床上作為乙型肝炎治療性多肽疫苗應(yīng)用時(shí)具 有明顯的局限性。因此，在HBV相關(guān)抗原中鑒定出能被多種MHC分子共同提呈的免疫顯性 CTL表位，是研制覆蓋更廣人群的乙型肝炎治療性多肽疫苗的關(guān)鍵。具有相同的肽結(jié)合特異性的人類白細(xì)胞抗原(HLA)分子屬于同一 HLA超家族， 這一超家族稱為HLA超型。目前已知的HLA超型有A2超型、A3超型、B7超型等。其中， HLA-A3 超型包括 HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*3101、HLA-A*3301 和 HLA_A*6801 共 5 個(gè)成員。這些成員在結(jié)合表位肽的過程中傾向于與表位肽第二位錨著殘基為A、L、I、V、S或T 以及C末端為R或K的表位肽結(jié)合。在我國，攜帶HLA-A3超型基因的人群占到了總?cè)巳旱?52. 7%，高于HLA-A2超型頻率45.9%，其中攜帶HLA-A*1101等位基因的人群占到了總?cè)?群的近三分之一；攜帶HLA-A2超型和HLA-A3超型個(gè)體的比例總和可達(dá)90%以上。目前已 經(jīng)鑒定出HBcAgl8-27為HBcAg的HLA-A2超型限制性CTL表位，且HBcAgl8_27已經(jīng)應(yīng)用于 乙型肝炎治療用多肽疫苗ε ΡΑ44的設(shè)計(jì)研發(fā)中。ε ΡΑ44摒棄了 HBcAg中抑制免疫反應(yīng)的 不利因素，并聯(lián)合了有利于激發(fā)細(xì)胞免疫的化學(xué)基團(tuán)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，εΡΑ44能夠有效 打破乙肝免疫耐受，重建針對(duì)HBcAgl8-27的特異性CTL免疫功能，有效抑制和清除乙肝病 毒。目前ε PA44已經(jīng)順利進(jìn)入臨床II b期試驗(yàn)，但其局限性在于適用人群只能是HLA-A2 超型個(gè)體。目前HBV來源的HLA-A3超型限制性CTL表位的研究局限于多聚酶，已有文獻(xiàn)報(bào) 道的HLA-A3超型限制性CTL表位僅從親和力方面得到初步證實(shí)，并未從激發(fā)CTL反應(yīng)上得 到證實(shí)。因此，從激發(fā)細(xì)胞免疫功能更為重要的HBV結(jié)構(gòu)蛋白核心抗原中鑒定出免疫顯性 HLA-A3超型限制性CTL表位，對(duì)于研制覆蓋更廣人群的乙型肝炎治療性多肽疫苗具有重要 的實(shí)際意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供HBcAg的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL 表位；目的之二在于提供所述超型CTL表位的鑒定方法，該方法同樣適用于其它抗原超型 CTL表位的鑒定；目的之三在于提供所述超型CTL表位的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案UHBcAg的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位，由以下氨基酸序列組成Leu-L eu__Asp_Thr__Ala_Ser__Ala_Leu_Tyr__Arg02、所述HBcAg的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位的鑒定方法，包括以下步 驟a、分別利用五個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站SYFEPITHI、BIMAS、IEDB, Epijen和SVMHC預(yù) 測(cè)HBcAg的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位；b、對(duì)步驟a所得五個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，獲得五個(gè)網(wǎng)站 預(yù)測(cè)結(jié)果較一致的候選表位；C、合成步驟b所得候選表位肽，用細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，即得HBcAg的免疫顯性 HLA-A3超型限制性CTL表位。3、所述HBcAg的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位在制備乙型肝炎治療性多 肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明鑒定了 HBcAg的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL 表位，其可單獨(dú)應(yīng)用或與其它免疫顯性表位聯(lián)合，用于制備乙型肝炎治療性多肽疫苗，具有 免疫原性強(qiáng)、特異性強(qiáng)、適用人群廣泛、易于合成和保存、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，有望打破乙肝免 疫耐受，重建細(xì)胞免疫功能，高效抑制和清除乙肝病毒。本發(fā)明的超型CTL表位鑒定方法， 通過整合預(yù)測(cè)能夠有效指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，減少肽合成與細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)的工作量，降低研究成 本，加快研究進(jìn)度。該方法同樣適用于其它抗原超型CTL表位的鑒定，可為治療性多肽疫苗 的設(shè)計(jì)和研究提供有用的工具。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為HLA-A3超型健康志愿者和慢性乙型肝炎患者的HLA-A位點(diǎn)分型電泳圖。圖2為Elispot法檢測(cè)候選表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN-γ的能力，其中 Blank為空白組，P18-27為陰性對(duì)照組，P30-39為候選表位組。圖3為胞內(nèi)因子染色檢測(cè)候選表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN-Y的能力， 其中PHA為陽性對(duì)照組，Blank為空白組，P18-27為陰性對(duì)照組，P30-39為候選表位組， IFN- y isotype為IFN- γ同型對(duì)照組。圖4為3H_TdR摻入法檢測(cè)候選表位肽誘導(dǎo)的PBMC增殖情況，其中Blank為空白 組，P18-27為陰性對(duì)照組，P30-39為候選表位組。
具體實(shí)施例方式
以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、HBcAg的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位的預(yù)測(cè)將GenBank登錄的HBcAg的氨基酸序列(P03138)利用五個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站 SYFEPITHI (http//www. syfpeithi. de/Scripts/MHCServer. dll/EpitopePrediction. htm) 、 BIMAS(http://www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind/)、 SVMHC(http:// www-bs. informatik.uni-tuebingen. de/Services/SVMHC)、IEDB (http://tools. immuneepitope. org/analyze/html/mhc_binding. html)禾口 EpiJen (http://www. darrenflower. info/EpiJen/)分別進(jìn)行免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位預(yù)測(cè)設(shè)定 MHC 分子限制性為 HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*3101、HLA-A*3301 和 HLA_A*6801，候選 表位長度為9肽和10肽；不同預(yù)測(cè)算法的截止值(cutoff)不同SYFPEITHI預(yù)測(cè)選取排名 在前20位或者評(píng)分> 18的肽序列；BIMAS預(yù)測(cè)選取排名在前5位或者評(píng)分> 100的肽序 列；其它算法按照IC50 < 500nM的標(biāo)準(zhǔn)限定。對(duì)五個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，結(jié)果顯示，五個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié) 果較一致的候選表位為HBcAg30-39 (表1)，其氨基酸序列為Leu-Leu-Asp-Thr-Ala-Ser-Al a-Leu-Tyr-Arg(SEQ ID No. 1)。表1五個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)HBcAg3tl,的預(yù)測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
乙肝病毒核心抗原的免疫顯性HLA A3超型限制性CTL表位，其特征在于由以下氨基酸序列組成Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg。
2.權(quán)利要求1所述的乙肝病毒核心抗原的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位的鑒 定方法，其特征在于包括以下步驟a、分別利用五個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站SYFEPITHI、BIMAS、IEDB,Epijen和SVMHC預(yù)測(cè)乙 肝病毒核心抗原的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位；b、對(duì)步驟a所得五個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，獲得五個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè) 結(jié)果較一致的候選表位；c、合成步驟b所得候選表位肽，用細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，即得乙肝病毒核心抗原的 免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位。
3.權(quán)利要求1所述的乙肝病毒核心抗原的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位在制 備乙型肝炎治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗原表位，特別涉及乙肝病毒核心抗原的免疫顯性HLA-A3超型限制性CTL表位，由以下氨基酸序列組成Leu-Leu-Asp-Thr-Ala-Ser-Ala-Leu-Tyr-Arg；以及該超型CTL表位的鑒定方法，該方法同樣適用于其它抗原超型CTL表位的鑒定，可為治療性多肽疫苗的設(shè)計(jì)和研究提供有用的工具；還涉及該超型CTL表位在制備乙型肝炎治療性多肽疫苗中的應(yīng)用，為高效乙肝治療性多肽疫苗的研制提供了新的策略和方法，有望打破乙肝免疫耐受，重建細(xì)胞免疫功能，高效抑制和清除乙肝病毒。
文檔編號(hào)G01N15/10GK101979405SQ20101026427
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者吳玉章, 王書峰, 王文博, 王莉 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)