專利名稱：一種基于熒光dUTP的自動檢測SSR分子標記的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種基于熒光dUTP在測序儀上自動檢測 SSR分子標記的方法。
背景技術：
SSR(Simple sequence r印eats，簡單序列重復，也稱微衛(wèi)星)是一類由幾個堿基 串聯(lián)重復而成的DNA序列，其長度一般較短(每單元長度在1 6bp之間)，廣泛分布于基 因組的不同位置。不同遺傳材料重復次數(shù)的可變性，導致了 SSR標記產生的基礎。SSR標記 是當今流行的分子標記技術之一，其原理為根據(jù)SSR兩端的保守的單拷貝序列設計一對 特異引物，通過PCR技術將其間的核心SSR序列擴增出來，利用電泳分析技術就可以獲得其 長度多態(tài)性。為了滿足高通量和準確性的需要，目前有條件的實驗室都是通過測序儀進行 自動化的電泳檢測。通過測序儀進行SSR分子標記自動檢測的一大障礙是PCR產物必須具 有熒光，以便激光探頭自動識別熒光信號。利用熒光dUTP進行SSR分子標記實驗在教科書中尚未提及，至今只見報道 有 4 篇文獻(文獻 1 :Patrick K. Ε. M 等，“ Analysis of loss of heterozygosity inmicrodissected tumor cells from Cervical carcinoma using fluorescent dUTP IabelingofPCR products", BioTechniques 21:844—847;文 ^ 2 :MacAvoy E. S.等, "Geneticvariation island populations of tuatara inferred from microsatellite markers”，Conservatioin Genetics 8 :305_318 ；文獻 3 :Woolbright S. A.等，“A dense linkagemap of hybrid cottonwood contributes to long-term ecological research andcomparison mapping in a model forest tree”， Heredity 100 :59_70 ；文獻 4 : BuschJ. D.等，"Development of polymorphic tetranucleotide microsatellites for Pinyonjays”，Conservation Genetics 10 :689_691)。但上述文獻中熒光信號偏弱，大大影 響了譜帶判讀的準確性。其中除文獻2中涉及的dNTP濃度為10(^1(降落？0 ，PCR反應 體系為25 μ L)之外，文獻1、3和4中報道的dNTP濃度均為200 μ M( —般PCR，PCR反應體 系為15 50 μ L)。由此可見，行業(yè)內技術人員利用熒光dUTP進行SSR分子標記時幾乎均 釆用濃度為100 200 μ M的dNTP。此外，分子生物學領域技術人員在進行一般PCR反應時使用的dNTP濃度為 200 μ Μ，可參考C. W.迪芬巴赫等人著的《PCR技術實驗指南》(科學出版社，1998，第1頁)寸。

發(fā)明內容
為解決上述現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明提供了一種新的既能提高目的片段的熒光 信號，從而提高標記判讀的準確性，又能合理節(jié)約反應原料，降低成本、提高實驗通量的方 法。本發(fā)明提供了一種基于熒光dUTP的自動檢測SSR分子標記的方法，包括以下步驟(1)配制 PCR 反應體系取 l.OyL 10Xbuffer、dNTP 25 50 μ M、MgCl22. OmM、前 向引物0.5“] 、后向引物0.5“]\^39酶1個單位、熒光(1^13 IOpmol和基因組DNA 5ng混 合，加超純水補至IOyL ；(2)進行降落PCR :94°C4min ；20 個循環(huán)94°C 30s、70 60°C或者 66°C 56°C 30s 且每個循環(huán)降低 0. 5°C、72°C Imin ；再 26 個循環(huán)94°C 30s、60 或者 56°C 30s,72°C Imin ；最 后 72 °C lOmin，得 PCR 產物；(3)取PCR產物1. O μ L加入9. 34 μ L超純甲酰胺、0. 16 μ L分子量內標，95°C 5min 后放置冰上快速冷卻，在測序儀上進行標記檢測。步驟(1)中，dNTP為三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate)的縮寫。是dATP、dGTP、dTTP和dCTP的統(tǒng)稱，在生物DNA合成以及PCR聚 合酶鏈反應中起原料作用。步驟(1)中使用的dNTP濃度為25 50μΜ，其濃度之低顯而易見，只占行業(yè)內技 術人員通常使用量(200 μ Μ)的12. 5% 25%，大幅降低了反應原料成本；并且可顯著提高 熒光信號的強度。基因組DNA不限。前向引物和后向引物取決于SSR標記對應的DNA片段，按常規(guī) 分子學方法制備。步驟(2)中，降落PCR (touchdown PCR)是指隨著循環(huán)的增多，退火溫度每個循環(huán) 依次降低的一種PCR技術，基本原理就是在退火溫度較高的時候能夠保證引物結合反應的 特異性，而隨著退火溫度的降低，擴增效率可以適當增加。其程序中退火溫度的選擇(70 60°C或者66°C 56°C，以及60或者56°C )取決于DNA序列的Tm值(DNA的解鏈溫度)。步驟(3)利用測序儀是為了進行自動化的電泳檢測，具體步驟參考儀器使用指 南。優(yōu)選地，步驟(1)中使用的dNTP濃度為25 μ M，做到在保障PCR產物量足夠，提高 熒光信號強度的情況下，使用最低的dNTP濃度，將原料成本降至最低。本發(fā)明顯著提高了目的片段的熒光信號強度，大大增強了在測序儀上自動檢測的 準確性，也有利于1個樣品的多個SSR標記混合后多重檢測、降低測序儀檢測的實驗成本。 其可能的原理是PCR反應中，熒光dUTP會與dNTP中的dTTP競爭結合到DNA鏈(PCR產物) 上，dNTP濃度降低、相當于降低dTTP的量，從而減弱了 dTTP的競爭力、提高了熒光dUTP結 合到PCR產物的能力，因此熒光信號強度增加。但另一方面，dNTP是DNA鏈合成的原料，不 能降得太低，否則其他三種dNTP (dATP、dCTP和dGTP)濃度太低、DNA鏈合成的原料不夠，導 致總的PCR產物偏少，進而熒光信號也會偏弱，不利于熒光檢測。因此，本發(fā)明提供了在保 障PCR產物量足夠的情況下使用的dNTP最低濃度，能夠保證最大的熒光信號強度。綜上，本發(fā)明滿足了社會需要，其廣泛的推廣將會帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。


圖1為不同dNTP濃度和PCR程序對桉樹(Eucalyptus) SSR標記Embral89的PCR 產物的熒光信號強度的影響。
圖2為不同dNTP濃度和PCR程序對桉樹SSR標記Embral47的PCR產物的熒光信 號強度的影響。圖3為利用本發(fā)明對藥用植物-五味子(Schisandra chinesis) SSR標記 WWZ-AC25的檢測結果。圖4為利用本發(fā)明對經(jīng)濟林樹種_錐栗(Castanea henryi)的SSR標記GsCAT3 的檢測結果。
具體實施例方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為 本發(fā)明的保護范圍。實施例一一種基于熒光dUTP的檢測桉樹SSR標記Embral89的方法，包括以下步驟(1)配制 PCR 反應體系取 LOyL 10 X buffer、dNTP 25 μ Μ、MgCl22. OmM、前向引 物(5，-CGTGCTTTTGAGGCTCT-3，)0· 5 μ Μ、后向引物(5，-GATTGAGGATGAGTGGTC-3，)0· 5 μ Μ、 Taq酶1個單位(上海申能博彩公司)、熒光dUTP IOpmol (加拿大Fermentas公司)和1 株尾葉桉(E. urophylla)個體的基因組DNA 5ng混合，加超純水補至10 μ L ；(2)進行降落PCR :94°C 4min ；20個循環(huán)94°C 30s,70 60°C 30s且每個循環(huán)降 低 0. 5°C、72°C Imin ；再 26 個循環(huán)94°C 30s、60°C 30s、72°C Imin ；最后 72°C lOmin，得 PCR 產物；(3)取PCR產物1. 0μ L加入9. 34 μ L超純甲酰胺、0. 16 μ L分子量內標GeneScan 500LIZ (美國AB公司)，95°C 5min后放置冰上快速冷卻，在測序儀(美國AB 3130x1)上進 行標記檢測，檢測結果如附圖1的H所標識。附圖1中，I峰為分子量內標，II (a)和II (b) 峰為目的片段，峰的高低代表了熒光信號的強弱。桉樹為2倍體，II (a)和II (b)峰表示該 個體在該SSR標記上的2個等位基因的長度不同，分別為IlObp和118bp。實施例二一種基于熒光dUTP的檢測桉樹SSR標記Embral47的方法。具體步驟基 本同上“實施例一”，只是前向引物(5’ -GCACGGTACTCGATCATAGA-3’)和后向引物 (5，-TGAGATAGGATTGCGCGT-3，)不同，且降落 PCR 中 70 60°C改為 66 56"C、26 個循環(huán) 中60。C改為56°C。檢測結果如附圖2的H所標識。I峰為分子量內標，II (a)和II (b)為 目的片段，峰的高低代表了熒光信號的強弱。桉樹為2倍體，II (a)和II (b)峰表示該個體 在該SSR標記上的2個等位基因的長度不同，分另為178bp和184bp。實施例三一種基于熒光dUTP的檢測藥用植物-五味子SSR標記WWZ-AC25的方法。具體 步驟基本同上“實施例一”，只是前向引物(5 ’ -CATCGGAAAAATCAGAGAAG-3 ’)和后向引物 (5，-CCTATCAAAACTCCCCTCTT-3，)不同，降落 PCR 中 70 60°C改為 66 56"C、26 個循環(huán) 中60°C改為56°C，且尾葉桉改為五味子。檢測結果如附圖3。I (a)和I (b)峰為分子量 內標，II峰為目的片段。五味子為2倍體，II峰表示該個體在該SSR標記上的2個等位基因 的長度相同，為20Ibp。
實施例四一種基于熒光dUTP的檢測經(jīng)濟林樹種-錐栗的SSR標記GsCAT3的方法。具體步 驟基本同上“實施例一”，只是前向引物和后向引物不同(因引物尚未發(fā)表，暫略)，降落PCR 中70 60°C改為66 56°C、26個循環(huán)中60°C改為56°C，且尾葉桉改為錐栗。檢測結果如 附圖4。I (a)和I (b)峰為分子量內標，II (a)和II (b)峰為目的片段。錐栗為2倍體， II (a)和II (b)峰表示該個體在該SSR標記上的2個等位基因的長度不同，分別為164bp 和 166bp。效果實施例不同dNTP濃度和PCR程序對桉樹SSR標記(Embral89和Embral47) PCR產物的熒 光信號強度的影響實驗材料植物材料為1株尾葉桉，采嫩葉進行DNA提取。SSR標記選取Embral89 和Embral47，引物序列見上“實施例一”和“實施例二”。實驗過程針對各SSR標記，實驗過程見上“實施例一”和“實施例二”。試驗結果及分析結果如附圖1和附圖2所示，dNTP 25 50mM和降落PCR程序 下，檢測的信號峰值明顯高于其他條件，具有良好的檢測效果，其中尤以dNTP 25mM和降落 PCR程序下，具有最佳的檢測效果。
權利要求
一種基于熒光dUTP的自動檢測SSR分子標記的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)配制PCR反應體系取1.0μL 10×buffer、dNTP 25～50μM、MgCl22.0mM、前向引物0.5μM、后向引物0.5μM、Taq酶1個單位、熒光dUTP 10pmol和基因組DNA 5ng混合，加超純水補至10μL；(2)進行降落PCR94℃4min；20個循環(huán)94℃30s、70～60℃或者66℃～56℃30s且每個循環(huán)降低0.5℃、72℃1min；再26個循環(huán)94℃30s、60℃或者56℃30s、72℃1min；最后72℃10min，得PCR產物；(3)取所述PCR產物1.0μL加入9.34μL超純甲酰胺、0.16μL分子量內標，95℃5min后放置冰上快速冷卻，在測序儀上進行標記檢測。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述dNTP為25μ M。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于熒光dUTP的自動檢測SSR分子標記的方法，包括以下步驟(1)配制PCR反應體系取1.0μL 10×buffer、dNTP 25～50μM、MgCl22.0mM、前向引物0.5μM、后向引物0.5μM、Taq酶1個單位、熒光dUTP10pmol和基因組DNA 5ng混合，加超純水補至10μL；(2)進行降落PCR94℃4min；20個循環(huán)94℃30s、70～60℃或者66～56℃30s且每個循環(huán)降低0.5℃、72℃1min；再26個循環(huán)94℃30s、60或者56℃30s、72℃1min；最后72℃10min，得PCR產物；(3)取PCR產物1.0μL加入9.34μL超純甲酰胺、0.16μL分子量內標，95℃5min后放置冰上快速冷卻，在測序儀上進行標記檢測。
文檔編號G01N21/64GK101899520SQ201010239919
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權日2010年7月28日
發(fā)明者于曉麗, 周長品, 李發(fā)根, 李梅, 甘四明, 翁啟杰 申請人:中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所