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      同時含有乙肝病毒和丙肝病毒核心抗原的雙重抗原的制作方法

      文檔序號:1062624閱讀:477來源:國知局

      專利名稱::同時含有乙肝病毒和丙肝病毒核心抗原的雙重抗原的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及利用基因重組技術(shù)獲得的肝炎病毒抗原,尤指乙肝病毒核心抗原和丙肝病毒核心蛋白基因的融合克隆,并表達(dá)獲得的雙重抗原?,F(xiàn)已查明丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)是引起輸血后傳染的非甲非乙肝炎的主要病原體。據(jù)統(tǒng)計,目前世界人口的1%已被HCV所感染,其中的25%為急性感染并出現(xiàn)黃疸,而其中的一半則將可能發(fā)展成慢性肝炎。而慢性感染者將發(fā)展演變?yōu)楦斡不透伟┑目赡苄愿哌_(dá)20%,因此危害性很大。同時,在世界范圍內(nèi)有3億人口已被乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)所感染,如果不作適當(dāng)預(yù)防和治療可能會有1.4億感染者將死于乙肝,同樣,危害性也是十分大的。因此乙肝和丙肝的預(yù)防和治療仍然是目前各國學(xué)者急待研究解決的重大課題。研制乙型肝炎疫苗、預(yù)防接種乙肝疫苗是目前預(yù)防乙肝流行的根本途徑。同時應(yīng)用疫苗于慢性乙肝的治療方面當(dāng)今已顯露出一些可喜的結(jié)果。乙肝疫苗已由應(yīng)用血源疫苗發(fā)展到基因工程重組乙肝表面抗原疫苗。而新型基因工程疫苗,即帶多重免疫決定簇的基因工程表面抗原疫苗也正在研制中。近來研究表明,乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中均能自行組裝成直徑為27nm的顆粒(Pasek,M.等,Nature1979,282,575;Roossinck,M.J.等,Mol.Cell.Biol.1986,6,1393)。顆粒具有良好的免疫原性和穩(wěn)定性,在體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生依賴T細(xì)胞和不依賴T細(xì)胞的高滴度的抗體(Milich,D.R.等,Science1986,234,1398)。利用乙肝核心抗原為免疫載體蛋白在合適的位點融合外源片段已有一些成功的例子,如口蹄疫病毒(Clake,B.E.等,Nature1987,330,381;Beeretag,K.M.等,Bio/Technology1990,8,644),脊髓灰質(zhì)炎病毒(Clake,B.E.等,J.Gen.Virol.1990,71,1109),乙肝病毒preSl(Schodel,F(xiàn).等,J.Virol.1992,66,106)等等。他們發(fā)現(xiàn)HBcAg在外源片段融合后仍能形成顆粒,被融合片段的免疫原性有一定的提高。HCV研究由于起步較晚,目前尚未有合適的體外培養(yǎng)增殖系統(tǒng),還不能直接研究其病毒蛋白。又由于HCV基因型變異多,而至今其保護(hù)性抗原尚未精確定位,因而目前HCV疫苗的研制仍未有重大突破。為防止HCV的傳播,應(yīng)加強(qiáng)對HCV感染的臨床診斷和血源的檢測。研制HCV疫苗、發(fā)展HCV的檢測技術(shù)顯得尤為重要。大量的研究者報道,不同來源的HCV核心蛋白基因被認(rèn)為是最為保守的區(qū)域,且受感染人群大多數(shù)都有核心蛋白抗體。HCV核心蛋白在HCV預(yù)防和治療中的作用受到人們的重視,但如何獲得具有良好免疫原性的HCV核心蛋白的問題尚未得到解決。各種表達(dá)體系中尚未成功地發(fā)現(xiàn)所獲得的HCV全核心蛋白形成顆粒結(jié)構(gòu)。為此,本發(fā)明的目的是提供一種同時含有乙型肝炎病毒核心抗原與丙型肝炎病毒核心蛋白的雙重抗原。該抗原是顆粒狀融合蛋白,可通過一個含有HBcAg主要抗原決定簇基因(對應(yīng)于1-144位氨基酸的乙肝病毒核心抗原基因)與HCV核心蛋白主要抗原決定簇基因(對應(yīng)于1-69位氨基酸或1-40位氨基酸的丙肝病毒核心蛋白基因)的融合,再通過融合基因在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)后獲得。本發(fā)明是一種同時含有乙肝病毒和丙肝病毒核心抗原的雙重抗原,該抗原是通過融合基因表達(dá)獲得的具有雙重抗原的融合蛋白顆粒,所述融合基因是乙肝病毒核心抗原中去除羧端精氨酸富集區(qū)后的主要抗原決定簇基因即對應(yīng)于1-144位氨基酸的乙肝病毒核心抗原基因與丙肝病毒核心蛋白主要抗原決定簇基因即與對應(yīng)于1-69位氨基酸或1-40位氨基酸的丙肝病毒核心蛋白基因的融合。本發(fā)明選用羧端精氨酸富集區(qū)去除的HBcAg主要抗原決定簇作為載體,它的去除不影響HBcAg裝配成顆粒的性質(zhì),也不影響其抗原性和免疫原性,然而,羧端被融合的外源片段長度可以增加,而且表達(dá)的融合蛋白的水溶性也可提高,有利于融合蛋白的純化和應(yīng)用。本發(fā)明選用包含HCV核心抗原主要抗原決定簇的氨端69個氨基酸或40個氨基酸作為被融合片段,在不影響HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性的基礎(chǔ)上,盡量縮短被融合片段的長度而使融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量提高,而且水溶性不受影響。本發(fā)明得到的這一新型雙重抗原,它包含HBcAg和HCV核心蛋白的主要抗原決定簇部位,且能自發(fā)裝配成顆粒,從而大大提高HCV核心蛋白的免疫原性,可以應(yīng)用于乙肝和丙肝的檢測,發(fā)展為乙肝和丙肝的預(yù)防和治療疫苗,具有較廣的應(yīng)用范圍和較高的應(yīng)用價值。本發(fā)明利用基因重組技術(shù),在HBcAg(全長共183個氨基酸)基因中原先就含有的兩個BspMII酶切點,用限制性內(nèi)切酶BspMII局部酶解,選擇單切開處于精氨酸富集區(qū)前第144位的BspMII切點,然后在去除了羧端富含精氨酸區(qū)后的相對應(yīng)于羧端第144位氨基酸的位置上引入一個EcoRI酶切位點,構(gòu)建了一個可在HBcAg的第144位氨基酸處與任何能對齊閱讀框架的外源基因片段融合的通用融合載體pBc144E(見圖1)。然后通過基因重組技術(shù)將HCV核心蛋白(全長共191個氨基酸)基因融合于構(gòu)建的通用融合載體上的EcoRI位點后,得到HBcAg(氨基酸1-144)基因與HCV核心蛋白(氨基酸1-191)全基因的融合重組質(zhì)粒pBc144Cc191(見圖2)。在其基礎(chǔ)上通過在HCV核心蛋白基因上對應(yīng)于第69位氨基酸處的StyI位點或?qū)?yīng)于第40位氨基酸處的ApaI位點經(jīng)相應(yīng)酶解后,再補平,回聯(lián)得到羧端已縮短的融合克隆,即HBcAg(氨基酸1-144)基因與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)基因的融合克隆得含融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc69或pBc144Cc49(見圖3),其中重組表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc69轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG-1中存放(由北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏,1997年4月14日,保藏編號為CGMCCNo0302。),該大腸桿菌經(jīng)過表達(dá),得到具有顆粒形狀,為水溶性,并具有雙重抗原性和良好的免疫原性的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)表明,表達(dá)的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40都同時具有乙肝病毒核心抗原和丙肝病毒核心蛋白的雙重抗原性。通過蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)(WesternBlot)的鑒定表明,融合蛋白Bc144Cc69和Bc144cc40既能與乙肝病毒核心抗原的抗體雜交反應(yīng),同時又能與丙肝病毒核心蛋白的抗體雜交反應(yīng)(見圖4)。這說明獲得的該融合蛋白為水溶性良好的具有乙肝核心抗原和丙肝核心蛋白雙重抗原性的融合抗原。另外,通過CsCl密度梯度超離心分析表明,Bc144Cc69具有1.31克/毫升和1.35克/毫升的密度峰,Bc144Cc40具有1.28克/毫升的密度峰(見圖5)。通過電子顯微鏡直接觀察表明(見圖6),經(jīng)過初步純化的該融合抗原能形成直徑約為27nm的顆粒,顆粒形狀與報道的HBcAg顆粒(Cohen,B.J.等,Nature,1982,296677)相似。該融合抗原免疫BALB/C小鼠能同時產(chǎn)生高滴度的抗HBcAg和抗HCc抗體,具有良好的雙重免疫原性,表明它可應(yīng)用于制造預(yù)防、治療、檢測乙肝和丙肝的藥物,還可用于抗體的制備。上述融合基因可插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體以后,如pcDNA3、pMPSVHE、pBHE等,直接以DNA形式用于乙肝和丙肝的DNA免疫和治療。下面實施例7和8將以pcDNA3為例說明。上述融合基因也能在哺乳動物細(xì)胞、酵母、重組痘苗、昆蟲細(xì)胞等真核系統(tǒng)中表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)應(yīng)和在大腸桿菌系統(tǒng)中的基本相同。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明構(gòu)建了一個通用的HBcAg可融合任何外源基因的通用融合載體,它是刪去了精氨酸富集區(qū)的核心抗原(氨基酸1-144),其羧端引入了限制酶EcoRI酶切位點后構(gòu)建而成。本發(fā)明提供了一個在EcoRI切點后與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)相融合,構(gòu)成一個同時含有HBcAg和HCV核心蛋白的融合基因。該融合基因可通過大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)獲得本發(fā)明雙重抗原,為水溶性的融合蛋白顆粒,具有雙重抗原性和良好的免疫原性,可應(yīng)用于制造對乙肝和丙肝的預(yù)防,治療及檢測藥物。含該融合基因的DNA也可插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體直接應(yīng)用于作為乙肝和丙肝的DNA免疫和治療的藥物。本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進(jìn)一步闡述,但并不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的如下圖1.含有HBcAg(氨基酸1-144)通用融合載體(pBc144E)的構(gòu)建示意圖。各種符號說明BcHBcAg(氨基酸1-183);pKK223-3,載體質(zhì)粒;E/N,EcoRI和NcoI補平后接點;H,HindIII;Bs,BspmII;E.linker(8mer),EcoRI接頭(8核苷酸);Klenow,大片段酶;lig.,連接酶;TAA,終止碼。圖2.含有HBcAg(氨基酸1-144)基因與HCV完整核心蛋白(氨基酸1-191)全基因的融合重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。CcHCV核心蛋白(氨基酸1-191);EHCV包膜蛋白;Bc144HBcAg(氨基酸1-144);5′5′端引物;3′,3′端引物;pGEM3zf,載體質(zhì)粒;PCR,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);E/N,EcoRI和NcoI補平后接點;lig.,連接酶;E,EcoRI;H,HindIII;B,BamHI;Bg,BglII。圖3.含有HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因的克隆構(gòu)建示意圖。Cc191HCV核心蛋白(氨基酸1-191);Bc144HBV核心抗原(氨基酸1-144);Cc69HCV核心蛋白(氨基酸1-69);Cc40HCV核心蛋白(氨基酸1-40);pKK223-3,載體質(zhì)粒;Ptac,tac啟動子;E/N,EcoRI和NcoI補平后接點;E,EcoRI;H,HindIII;B,BamHI;Bg,BglII;St,StyI;Ap,ApaI;Klenow,大片段酶;lig.,連接酶。圖4.含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡鑒定。a.用抗HBcAg多抗的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)1.pBc1442.重組表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc693.重組表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc40b.用抗HCV核心蛋白單抗的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。1.pBc1442.重組表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc693.重組表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc40注融合蛋白與未融合蛋白的位置用▲標(biāo)示,分子量略小的條帶為其降解產(chǎn)物,分子量大的條帶為其二聚體形式。圖5.含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因表達(dá)產(chǎn)物的CsCl密度梯度超離心分析。a.Bc144Cc69b.Bc144Cc40○,CsCl密度;▲,HBcAg的抗原性分布;■,HCV核心蛋白的抗原性分布。圖6.含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因表達(dá)產(chǎn)物的電子顯微鏡觀察(標(biāo)尺長度為100nm)。a.Bc144Cc69b.Bc144Cc40圖7.表達(dá)的Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫小鼠產(chǎn)生抗HBcAg抗體水平的示意圖。B144■B144C191□B144C69■B144C40圖8.表達(dá)的Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫小鼠產(chǎn)生抗HCcAg抗體水平的示意圖。B144■B144C191□B144C69■B144C40圖9.帶CMV啟動子的動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen公司)PCMV巨細(xì)胞病毒早期啟動子;T7T7噬菌體啟動子;SP6SP6噬菌體啟動子;Amp氨芐青霉素抗性基因;BGHPA牛生長因子多聚腺嘌呤核苷;nco新霉素抗性基因。圖10.含HBV的HBcAg(1-144)與HCV的HCc(1-69)或HCc(1-40)融合基因在pcDNA3上的重組克隆pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40結(jié)構(gòu)示意圖。pCMV巨細(xì)胞病毒早期啟動子;HBcAg(1-144)乙肝核心抗原基因(氨基酸1-144位);HCc(1-191)丙肝核心抗原基因(氨基酸1-191位);HCc(1-69)丙肝核心抗原基因(氨基酸1-69位);HCc(1-40)丙肝核心抗原基因(氨基酸1-40位);HHindIII酶切位點;EEcoRI酶切位點;GNSDP依次代表甘氨酸,天門冬酰胺,絲氨酸,天門冬氨酸,脯氨酸。圖11.pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生抗乙肝HBcAg抗體水平變化的示意圖。pcDNA3B144■pcDNA3B144C191□pcDNA3B144C69■pcDNA3B144C69圖12.pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生抗丙肝HCcAg抗體的水平變化的示意圖。pcDNA3B144■pcDNA3B144C191□pcDNA3B144C69■pcDNA3B144C69實施例1.含有HBcAg(氨基酸1-144)通用融合載體的構(gòu)建采用含有HBcAg基因的表達(dá)質(zhì)粒pBc183(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所提供)為起始質(zhì)粒。pBc183是在質(zhì)粒pKK223-3(Pharmacia產(chǎn)品)上重組有HBcAg基因的表達(dá)質(zhì)粒。主要構(gòu)建過程是將含有完整的HBcAg基因的NcoI-HindIII片段分出,并將NcoI酶切點末端用大片段酶補平,再將該片段插入先經(jīng)EcoRI和HindIII酶切開后,并將EcoRI切點末端用大片段酶補平的pKK223-3質(zhì)粒上,基因重組所用限制性內(nèi)切酶,連接酶,合成的EcoRI接頭皆為德國Boehringer公司產(chǎn)品,質(zhì)粒DNA制備按德國Qiagen公司提供的試劑和方法進(jìn)行。質(zhì)粒重組和細(xì)菌轉(zhuǎn)化參照Sambrork,J.等人的《分子克隆》上的常規(guī)方法進(jìn)行,所用受體菌為大腸桿菌TG-1。由于HBcAg中有兩個BspmII位點,故采用局部酶解法,選擇單切開相應(yīng)于第144位氨基酸位點的質(zhì)粒,經(jīng)電泳膠回收后用大片段酶補平后加入EcoRI接頭(GGAATTCC8mer),得到在HBcAg第144位氨基酸處加入了EcoRI切點的重組質(zhì)粒,構(gòu)建成可與HBcAg的第144位氨基酸融合的通用融合載體(pBc144E),該通用融合載體在EcoRI切點處可引入任何能對齊框架的含有終止碼的外源基因片段(見圖1)。上述質(zhì)粒若經(jīng)EcoRI酶切后,再用大片段酶補平后回連即可產(chǎn)生一個終止碼,得到重組質(zhì)粒pBc144,則可用于單獨表達(dá)乙肝核心抗原蛋白Bc144(HBcAg(氨基酸1-144))(見圖1)。實施例2.含有HBcAg(氨基酸1-144)基因與HCV核心蛋白(氨基酸1-191)全基因融合重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用含HCV核心蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pGEM3zf/HCV-CE(由上海醫(yī)科大學(xué)聞玉梅教授提供)為PCR合成的模板,PCR用試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。pGEM3zf/HCV-CE為質(zhì)粒pGEM3zf(Pharamcia產(chǎn)品)上重組有HCV核心蛋白和部分包膜蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒。為使在完整的HCV核心蛋白基因上便于操作,設(shè)計合成的23mer的5′端引物5′GCTCGGTGAATTCGGATCCCATG3′引入EcoRI和BamHI酶切點,3′端引物25mer5′GGAGTAAGCTTATAGATCTGCTGAC3′引入HindIII和BglII酶切點。在HindIII前還同時含有TAA終止碼。用PCR合成了全長1-191位的完整的HCV核心蛋白基因,用EcoRI和HindIII雙酶解后直接插入實施例1中的經(jīng)同樣酶解后的重組質(zhì)粒pBc144E中即可得到含有HBcAg(氨基酸1-144)基因與HCV核心蛋白(氨基酸1-191)全基因的融合重組質(zhì)粒pBc144Cc191(見圖2)。實施例3.含有HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因的克隆構(gòu)建將含有丙肝核心蛋白全基因的融合重組質(zhì)粒pBc144Cc191經(jīng)StyI(丙肝核心蛋白基因?qū)?yīng)69位氨基酸處)和BglII雙酶切,分去StyI-BglII所含HCV核心蛋白部分后(即刪除了HCV核心蛋白中自69位氨基酸后的部分),用大片段酶補平后回連,就構(gòu)建成了在pKK223-3上由tac啟動子控制下表達(dá)HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒(pBc144Cc69)(見圖3)。含有HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)融合基因的重組表達(dá)質(zhì)??赊D(zhuǎn)入大腸桿菌TG-1中存放。同樣,若在pBc144Cc191質(zhì)粒上用ApaI(40位氨基酸處)和BglII雙酶切,刪去HCV核心蛋白中第40位氨基酸以后的部分,即可構(gòu)建成表達(dá)含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-40)融合基因的重組質(zhì)粒(pBc144Cc40)(見圖3)。實施例4.含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的雙重抗原性的酶聯(lián)免疫吸附測定融合基因重組表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc69(或pBc144Cc40)在大腸桿菌TG-1中進(jìn)行表達(dá),37℃培養(yǎng)3小時后,用IPTG(異丙基硫代半乳糖苷,至終濃度為0.1mM/ml)誘導(dǎo),繼續(xù)培養(yǎng)6小時后收獲菌體。制備初步純化蛋白,HBcAg的酶聯(lián)免疫測定(ELISA),用上??迫A實業(yè)公司的核心抗原試劑盒和方法進(jìn)行。融合蛋白中的HCV核心蛋白的測定,采用科華測定HBeAg試劑盒中所提供的包被板,在與樣品反應(yīng)后,再用HCV核心蛋白單抗(針對氨基酸1-120,WAKE-CHEMIE,1∶50稀釋)結(jié)合,再用與兔抗鼠IgG酶聯(lián)結(jié)合物(DAKO,1∶1000稀釋)反應(yīng),最后再用顯色液顯色。對表達(dá)產(chǎn)物中HBcAg和HCV核心蛋白的抗原性進(jìn)行了ELISA測定,結(jié)果見表1。表1.含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的雙重抗原性的ELISA測定HBcAgHCcpBc1441.6080.041pBc144Cc691.3071.288pBc144Cc401.3711.217</table>HBcAg,HBV核心抗原;HCc,HCV核心蛋白。注初步純化蛋白1/16μg分別用ELISA法檢測HBcAg和HCV核心蛋白抗原性。表中所示為ELISA測定的A450值。結(jié)果表明,本發(fā)明構(gòu)建的含HBcAg(氨基酸1-144)和HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)的融合基因都同時表達(dá)了HBcAg和HCV核心蛋白,而pBc144中因沒有HCV核心蛋白基因故僅有HBcAg的表達(dá)。實施例5.含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的蛋白電泳分析,采用15%SDS聚丙烯酰胺電泳參照Laemmli法進(jìn)行(Laemmli,U.K.等,Nature1970,223,680)。表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡反應(yīng)采用ECL非放射性標(biāo)記檢測法,按美國Amersham公司提供的試劑與操作方法進(jìn)行。其中針對HBcAg的一抗用兔抗HBcAg多抗(DAKO,1∶500稀釋),針對HCV核心蛋白的一抗用其單抗(WAKE-CHEMIE,1∶50稀釋)。分別用抗HBcAg多抗及抗HCV核心蛋白單抗進(jìn)行雜交,對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行WesternBlot鑒定,結(jié)果見圖4。結(jié)果再一次說明融合的HBcAg(氨基酸1-144)-HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或HBcAg(氨基酸1-144)-HCV核心蛋白(氨基酸1-40)基因都同時獲得了HBcAg與HCV核心蛋白的表達(dá)。由WesternBlot得到的特異條帶的分子量大小與預(yù)計的相符融合蛋白Bc144Cc69在26Kd處,Bc144Cc40在22Kd處。而且分別與抗HBcAg多抗和與HCV核心蛋白單抗雜交所得的特異條帶位置吻合,這表明表達(dá)的融合蛋白同時具有HBcAg和HCV核心蛋白的抗原性。實施例6.含HBcAg(氨基酸1-144)與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的CsCl密度梯度超離心分析和電子顯微鏡觀察融合基因在大腸桿菌TG-1中的表達(dá)裂解物經(jīng)CsCl密度梯度超離心(日立,水平頭PPS65T)45krpm,8℃,48小時,由管底打孔,分管收集,對每管中的HBcAg和HCV核心蛋白分別進(jìn)行ELISA測定,用上??迫A實業(yè)公司的核心抗原試劑盒和方法進(jìn)行(參考實例4)。兩者ELISA峰值完全重合,融合蛋白Bc144Cc69都在密度為1.35g/ml及1.31g/ml處,而融合蛋白Bc144Cc40在密度為1.28g/ml處(見圖5)。將峰值處的融合蛋白經(jīng)2%醋酸鈾負(fù)染后在日立電子顯微鏡下觀察,兩種融合蛋白均可見直徑約為27nm的均勻顆粒。顆粒形狀與報道的HBcAg顆粒相似(Cohen,B.J.等,Nature1982,296,677)(見圖6)。實施例7.表達(dá)的融合抗原Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫原性的試驗表達(dá)的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40以及對照Bc144和Bc144Cc191初步純化基本按JianZheng等人(J.B.C.1992,267,9422-9429)報道的方法進(jìn)行,即經(jīng)過羥基磷灰石和SepharoseCL-4B兩步柱層析純化。用ELISA法(實施例4)測定乙肝核心抗原或丙肝核心蛋白的活性峰,收集活性部分即為初步純化的融合蛋白。選用6-8周齡的BALB/C雄性小鼠(每組5只),每只小鼠經(jīng)腹腔注射10微克初步純化的表達(dá)蛋白或融合蛋白Bc144,Bc144Cc191,Bc144Cc69及Bc144Cc40(先與等體積的完全佐劑混勻),4周后用相同量加強(qiáng)一次(先與等體積的不完全佐劑混勻)。用注射生理鹽水作為空白對照。在第一次注射后的第2,4,6,8和13周采血,測定血清中抗乙肝核心抗原抗體和抗丙肝核心蛋白抗體的變化,結(jié)果見圖7和圖8。由圖7中可以看出,本發(fā)明構(gòu)建的融合抗原Bc144Cc69和Bc144Cc40與載體蛋白Bc144及乙肝核心抗原與丙肝全長核心蛋白的融合蛋白Bc144Cc191,在免疫后的第2周即有104高滴度的抗HBcAg抗體產(chǎn)生,第4周后滴度上升了10倍達(dá)105。同時可以看出Bc144Cc69和Bc144Cc40與Bc144及Bc144Cc191,6周后產(chǎn)生的抗HBcAg抗體的滴度處于同一個水平上。融合抗原Bc144Cc69和Bc144Cc40在第一次免疫后的第6周后,血清中檢測到抗丙肝HCcAg抗體的產(chǎn)生,到13周時抗體滴度水平也可達(dá)104(見圖8)。Bc144Cc69和Bc144Cc40與Bc144Cc191相比,產(chǎn)生抗丙肝HCcAg的水平明顯要高過一個數(shù)量級。其中Bc144蛋白中因沒有丙肝核心蛋白,故不能產(chǎn)生抗HCcAg抗體。上述結(jié)果表明,本發(fā)明構(gòu)建的含乙肝核心抗原(氨基酸1-144)和丙肝核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)的融合基因表達(dá)的Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫小鼠都能產(chǎn)生抗乙肝核心抗原抗體和抗丙肝核心蛋白抗體,具有良好的免疫原性,產(chǎn)生抗乙肝核心抗原抗體水平與載體蛋白Bc144及融合有全長丙肝核心蛋白的Bc144Cc191相當(dāng)。產(chǎn)生抗丙肝核心蛋白抗體的水平比Bc144Cc191為高。實施例8.含HBcAg(氨基酸1-144)基因與HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)融合基因在動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的重組克隆(pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40)的構(gòu)建采用含CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子的質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen公司產(chǎn)品)為動物細(xì)胞表達(dá)載體(見圖9)。首先以含有乙肝核心抗原(氨基酸1-144)基因的通用融合載體pBC144E(見實施例1)為PCR底物。用含HindIII酶切位點的5′引物5′CTCAAGCTTCCATGGACATCGACCCTTATAA3′和用含EcoRI酶切位點的3′引物5′GGAATTCCCCGGAAGTG3′采用PCR法擴(kuò)增出5′端為HindIII切點,3′端為EcoRI切點的乙肝HBc(1-144)片段,插入經(jīng)同樣酶解開的pcDNA3得到重組質(zhì)粒pcDNA3B144(見圖10中的A)。在重組質(zhì)粒pBc144Cc69(見實施例3)上,用HindIII切開并補平,再用EcoRI酶切開,解下含HCV核心抗原(氨基酸1-69)基因片段,插入經(jīng)EcoRI和EcoRV雙酶解的上述pcDNA3B144,即構(gòu)建成了在CMV啟動子控制下的含乙肝HBcAg(氨基酸1-144)與丙肝HCcAg(氨基酸1-69)的重組融合基因表達(dá)克隆pcDNA3B144c69(見圖10中的C),另外,在重組質(zhì)粒pBc144Cc40上(見實施例3),同樣先用HindIII酶切開,并補平,再用EcoRI酶切開,解下含有HCV核心蛋白(氨基酸1-40)基因片段,插入經(jīng)EcoRI和EcoRV雙酶解的上述pcDNA3B144質(zhì)粒,即構(gòu)建成在CMV啟動子控制下含乙肝HBcAg(氨基酸1-144)與丙肝HCcAg(氨基酸1-140)的重組融合基因表達(dá)克隆pcDNA3B144c40(見圖10中的D)。所構(gòu)建成的上述含乙肝核心抗原基因與丙肝核心蛋白融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3B144c69與pcDNA3B144c40,都經(jīng)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞后,用ELISA法(參見實施例4)分別測定了細(xì)胞裂解物中表達(dá)的乙肝和丙肝核心抗原為陽性,并經(jīng)蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)為陽性,證明結(jié)構(gòu)正確后備用。實施例9.含乙肝核心抗原與丙肝核心蛋白融合基因的克隆pcDNA3B144c69和pcDNA3B144c40的DNA直接免疫試驗選用6-8周齡的BALB/c雌性小鼠(每組7只),在小鼠一側(cè)后腿的前脛骨肌肉注射100μl10-5M心臟毒素(cardiotoxin,Sigma公司產(chǎn)品)5天后,在同一部位注射由上述100ugDNA樣品溶于100μlPBS緩沖液配制的溶液,4周后以相同劑量在另一側(cè)后腿的前脛骨肌肉加強(qiáng)一次(在該側(cè)部位加強(qiáng)前5天也同樣用心臟毒素處理)。用只含有HBV核心抗原(氨基酸1-144)的pcDNA3B144以及含HBV核心抗原(氨基酸1-144)與完整的丙肝核心蛋白(氨基酸1-191)的pcDNA3B144C191為對照。在初次免疫后的第2,4,6,8,及11周,尾靜脈采血,對血清中的抗乙肝核心抗體和抗丙肝核心抗體水平用ELISA進(jìn)行了測定。血清中抗乙肝HBcAg抗體或抗丙肝HCcAg抗體分別用在大腸桿菌表達(dá)的經(jīng)純化的乙肝核心抗原(氨基酸1-144)蛋白或丙肝核心抗原(氨基酸1-40)與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白(由中科院上海生化所提供),每孔0.1μg包板,用兔抗鼠IgG辣根過氧化酶結(jié)合物反應(yīng)(DAKO公司產(chǎn)品1∶1000稀釋),用TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為顯色底物,在酶標(biāo)儀上測定450nm波長吸收值,結(jié)果見圖11和圖12??梢钥闯鰌cDNA3B144c69和pcDNA3B144c40DNA直接免疫小鼠都能在2周后產(chǎn)生抗乙肝HBcAg的抗體,4周后達(dá)到103水平,同時也能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗丙肝HCcAg抗體,6周后達(dá)到102水平。pcDNA3B144c69與pcDNA3B144c40產(chǎn)生兩種抗體的水平與融合有完整的丙肝核心抗原基因(氨基酸1-191)的pcDNA3B144c191相比,幾乎相當(dāng),甚至略顯稍高。上述結(jié)果表明,本發(fā)明構(gòu)建的乙肝核心抗原(氨基酸1-144位)與丙肝核心蛋白(氨基酸1-69位)或(氨基酸1-40位)的融合基因在真核細(xì)胞的表達(dá)載體pCDNA3上的克隆pCDNA3B144C69和pCDNA3B144C40用DNA直接免疫BALB/C小鼠后能同時產(chǎn)生抗乙肝核心抗原抗體和抗丙肝核心蛋白抗體,同時具有良好的雙重的乙肝核心抗原的免疫原性和丙肝核心蛋白免疫原性。權(quán)利要求1.一種同時含有乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒核心抗原的雙重抗原,其特征在于該雙重抗原是通過融合基因表達(dá)獲得的具有雙重抗原性的融合蛋白,所述融合基因是乙肝病毒核心抗原中去除羧端精氨酸富集區(qū)后對應(yīng)于1-144位氨基酸的主要抗原決定簇基因與丙肝病毒核心蛋白1至69位氨基酸或1至40位氨基酸的主要抗原決定簇基因的融合。2.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建,是通過將重組質(zhì)粒pBc144Cc191刪除丙肝病毒核心蛋白中自69位氨基酸后的部分或自40位氨基酸后的部分而獲得融合基因的表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc69或pBc144Cc40。3.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于所述融合基因是乙肝病毒基因相對應(yīng)第1-144位氨基酸與丙肝病毒核心蛋白相對應(yīng)第40位氨基酸后的各位氨基酸或第69位氨基酸前的各位氨基酸的任何長度基因的融合。4.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于所述融合基因表達(dá),是融合基因表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc69或pBc144Cc40在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)。5.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于融合基因表達(dá)質(zhì)粒pBc144Cc69轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG-1中得到大腸桿菌菌株TG-1/pBc144Cc69。6.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于所述雙重抗原是顆粒狀融合蛋白。7.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于融合基因也可在哺乳動物細(xì)胞,酵母,重組痘苗,真菌及昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。8.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于它可應(yīng)用于制造預(yù)防、治療或檢測乙肝和丙肝的藥物。9.如權(quán)利要求1所述的雙重抗原,其特征在于所述融合基因也可插入適當(dāng)?shù)妮d體pcDNA3,pMPSVHE或pBHE,直接以DNA形式應(yīng)用于制造DNA免疫與治療乙肝和丙肝的藥物。全文摘要利用基因重組技術(shù),構(gòu)建乙型肝炎病毒核心抗原(氨基酸1—144)與丙型肝炎病毒核心蛋白(氨基酸1—69)或(氨基酸1—40)基因融合的克隆,在大腸桿菌中表達(dá)可獲得水溶性的、具有雙重抗原性和免疫原性的融合蛋白顆粒。它可應(yīng)用于乙肝和丙肝的預(yù)防、治療、檢測和抗體制備。含該融合基因的DNA也可插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體直接應(yīng)用于乙肝和丙肝的DNA免疫和治療。文檔編號A61K39/29GK1175585SQ9710664公開日1998年3月11日申請日期1997年10月6日優(yōu)先權(quán)日1997年10月6日發(fā)明者李光地,楊莉,汪垣申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所
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