專利名稱：檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測β -內(nèi)酰胺類抗生素的試劑盒，特別是檢測牛奶中 β-內(nèi)酰胺類抗生素的試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，動物源食品中的藥物殘留日益受到國際社會的重視。 內(nèi)酰胺類抗生素作為發(fā)現(xiàn)最早、用量最多的一類抗生素，在牛乳及動物組織中殘留檢出
報道最多。內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青霉素類和頭孢菌素類，其作用特點是能夠抑制細(xì)菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性，從而阻止細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，呈現(xiàn)殺菌活性。在動物生產(chǎn)中，內(nèi)酰胺類抗生素廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘留，給人類健康帶來嚴(yán)重危害，如產(chǎn)生過敏反應(yīng)、破壞胃腸道菌群平衡和增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性等。其中青霉素在食品中的殘留會對青霉素過敏的人產(chǎn)生健康危害，更為重要的是，抗生素被過量食入健康人腸道，會破壞健康人的正常菌群環(huán)境，導(dǎo)致人體免疫力的降低，從而危害消費(fèi)者的身體健康，同時也影響牛奶及乳制品的出口貿(mào)易。我國的原料乳中內(nèi)酰胺類抗生素殘留嚴(yán)重，對其開展監(jiān)控檢測是我國乳品業(yè)發(fā)展中極為關(guān)注的問題。為使牛奶中抗生素問題得到有效監(jiān)控，符合最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，奶牛場、乳制品廠、政府監(jiān)督部門、出入境檢測、大型食品流通領(lǐng)域等都在努力尋求準(zhǔn)確可行的檢測方法，許多大型化學(xué)試劑和儀器公司也致力于開發(fā)內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測的方法和儀器。目前，牛奶及生鮮奶中內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測方法依據(jù)不同的檢測原理，大體可分為三大類微生物受阻檢測、理化檢測法、免疫學(xué)分析法。微生物受阻檢測方法，主要有抑菌圈試驗、渾濁度試驗、變色型檢測金標(biāo)試劑盒方法，微生物檢測方法檢測成本價低，但是靈敏度低、耗時長、耐藥菌的存在容易導(dǎo)致誤檢；理化檢測方法，是目前檢測 β -內(nèi)酰胺類抗生素主要方法，有液相色譜法、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜法等，理化檢測方法精確度高，但其存在檢測成本高，檢測設(shè)備復(fù)雜，對檢測人員的要求較高，檢測耗時長等缺點，目前常用的免疫學(xué)分析法，主要為酶聯(lián)免疫檢測法和放射免疫分析法需要的檢測費(fèi)用還是較高，不適合企業(yè)低成本的檢測需要。因此，在實踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、檢測藥物種類多、適合大規(guī)模推廣的檢測方法。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的提供一種靈敏度高、檢測內(nèi)酰胺類抗生素藥物種類多，成本低、操作簡單、檢測時間短的檢測內(nèi)酰胺類抗生素的試劑盒。本實用新型的試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12 個具塞試劑桶，試劑桶包括微孔試劑條和8個試紙條，微孔試劑條有8個反應(yīng)孔，反應(yīng)孔上具有微孔塞，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜等組成，與常規(guī)試紙條不同的是，其中的頭孢類單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物金不在是包被在結(jié)合物釋放墊上，組裝入試紙條，而是凍干在微孔試劑條板孔中。將金標(biāo)抗體凍干在微孔試劑條中，這樣做的好處是在檢測過程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度。所述反應(yīng)膜上分別包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡。在反應(yīng)膜上檢測線印跡和質(zhì)控線印跡組合排列為所述的檢測線位于距離樣品吸收墊一側(cè)5-8mm，優(yōu)選6mm，所述質(zhì)控線位于距離檢測線4-7mm，優(yōu)選5_。所述試紙條兩端貼有保護(hù)膜，覆蓋在吸水端上的為手柄端，覆蓋在樣品吸收墊上的為檢測端，檢測端保護(hù)膜上有MAX標(biāo)記線。本實用新型試劑盒中試紙條底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或慮油紙；吸水墊為吸水紙；反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜； 保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜；試劑盒盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質(zhì)支撐材料。本實用新型試劑盒具有如下有益效果1.靈敏度高。β-內(nèi)酰胺類抗生素檢測試劑盒以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，本實用新型試劑盒具有較高的特異性和靈敏度。本試劑盒對青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林、苯唑青霉素、鄰青霉素、雙青霉素、萘夫西林、頭孢喹諾、頭孢乙腈、頭孢洛寧、 頭孢唑林、頭孢哌酮、先鋒霉素VIII、頭孢噻呋檢測靈敏度分別為2 μ g/L、3 μ g/L、3 μ g/L、 3μ g/L、3y g/L、6y g/L、20y g/L、15y g/L、100y g/L、18y g/L、50y g/L、40y g/L、50y g/ L、_ g/L。2.操作簡便快速。使用試劑盒檢測時無需任何其它試劑，只要將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后，孵育5min，將試紙標(biāo)有MAX線標(biāo)記端向下，插入孵育后的微孔試劑后計時，5min內(nèi)觀察結(jié)果。3.顯示檢測結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確。檢測是試紙條以顯示紅線色“ I ”及“ I I，，印跡作為陽性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線“ I ”印跡表示在被檢測樣本液中 β -內(nèi)酰胺類抗生素的含量高于等于試劑盒對β -內(nèi)酰胺類抗生素藥物的最低檢測限，兩條紅線“ 11，，印跡表示在被檢測樣本中β -內(nèi)酰胺類抗生素含量低于試劑盒對β -內(nèi)酰胺類抗生素藥物的最低檢測限，結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確、簡單明了，不容易出現(xiàn)結(jié)果誤判。4.成本低，投資少。使用本實用新型試劑盒，不需另配儀器設(shè)備及其他試劑，使現(xiàn)場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。5.易于大范圍推廣應(yīng)用。試劑盒操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要，如專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、乳業(yè)企業(yè)等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、 社會效益。

圖1為本實用新型試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；[0019]圖2為本實用新型試紙條俯視圖；圖3為本實用新型微孔試劑圖圖4為本實用新型試紙條檢測結(jié)果判定圖。圖5為本實用新型試劑桶結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為本實用新型固定用具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定用具的側(cè)視圖。
具體實施方式
一、β -內(nèi)酰胺類抗生素檢測試劑盒的組裝制備1)、試紙條樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙兩端黏貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜7-1覆蓋在吸水墊上手柄端，保護(hù)膜7-2覆蓋在樣品吸收墊的檢測端，在檢測端保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線，檢測線4包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線5包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。2)微孔試劑條微孔試劑條8具有微孔塞9，板孔中凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。3)將1)試紙條和2)微孔試劑條裝入塑料試劑桶10，將塑料試劑桶放置于試劑盒盒體12內(nèi)的固定用具11中。二、試劑盒的使用待檢牛奶樣品溶液滴加200 μ 1到微孔試劑中，混勻后，孵育5min，將試紙標(biāo)有MAX 線標(biāo)記端向下，插入孵育后的微孔試劑后計，5min內(nèi)觀察結(jié)果。三、檢測結(jié)果分析內(nèi)酰胺類抗生素在樣本中的含量高于等于試劑盒對其的最低檢測限時，頭孢類藥物單克隆-膠體金標(biāo)記物與內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點被封閉，從而在檢測區(qū)內(nèi)因為競爭反應(yīng)，不會與頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。如圖4所示。陽性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)不顯色，試紙條以顯示紅線色“I ”，判為陽性，如圖4. a圖所示。陰性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，檢測線(T)同時也顯示出一條紅色條帶， 且檢測線(T)顏色接近或淺于質(zhì)控線(C)時，試紙條以顯示紅線色為“I I ”，判為陰性，如圖 4. b所示。無效當(dāng)質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否， 該試紙條判為無效，如圖4. c、4. d所示。四、檢測試劑盒中用到的材料制備方法如下[0040]1、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定頭孢類藥物是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。1)免疫原的制備-頭孢類藥物與卵清蛋白偶聯(lián)物合成取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1. 5ml雙蒸水溶解，得到⑴液；取EDC40mg和NHS60mg 用0. 5ml水溶解得到(II)液；在攪拌狀態(tài)下將(II)加入(I)中，反應(yīng)lh，得到(III)液； 取卵清蛋白60mg用8ml水溶解，得到(IV)液；將(IV)加入(III)中，室溫攪拌反應(yīng)24h分別得到免疫原，用0. 02M PBS透析3天，分裝、凍存。2)包被原的制備-頭孢類藥物與牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1. 5ml雙蒸水溶解，得到(I)液；取EDC40mg和 NHS60mg用0. 5ml水溶解得到(II)液；在攪拌狀態(tài)下將(II)加入(I)中，反應(yīng)lh，得到 (III)液；取牛血清白蛋白IOOmg用8ml水溶解，得到(IV)液；將(IV)加入(III)中，室溫攪拌反應(yīng)24h分別得到免疫原，用0. 02M PBS透析3天，分裝、凍存。3)頭孢類藥物-載體偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7. 4的PBS配成 0. 5mg/ml的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200-800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明頭孢類藥物與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、頭孢類藥物單克隆抗體的制備(1)制備單抗a.動物免疫將步驟1得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)
生抗血清。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合， 篩選得到穩(wěn)定分泌頭孢類藥物單克隆抗體的頭孢類藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20°C保存。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為0. 2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。3、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(1)膠體金的制備[0062]用雙蒸去離子水將氯金酸(購于sigma公司，產(chǎn)品目錄號T09041)稀釋成 0.01% (質(zhì)量百分含量)，置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入 2.5ml 檸檬酸三鈉(購于廣州化學(xué)試劑廠，產(chǎn)品目錄號BG11-AR-01KG)，繼續(xù)攪拌加熱反應(yīng)至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、 無沉淀和漂浮物。(2)頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下，用0. 2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7. 0，按50-100 μ g抗體/ml 膠體金的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述頭孢類藥物單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入 10% BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為(體積百分含量)，靜置30min。12000rpm、 4°C離心30min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，得到的頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物溶液的濃度為50ug 單抗/ml溶液，置4°C備用。復(fù)溶緩沖液含酪蛋白、吐溫-80的0. 02mol/L、pH7. 2的磷酸鹽溶液，其中酪蛋白在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0. 05-0. 1% (體積百分含量)，吐溫-80在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0. 05-0. 15% (質(zhì)量百分含量)。5、將頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 μ 1頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度為-70°C條件下，預(yù)凍4h后，再凍干14h，即可取出，得到凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；6、樣品吸收墊的準(zhǔn)備將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0. 5% (體積百分含量))、pH為7. 2、0. lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C 烘池備用；7、反應(yīng)膜的制備包被過程用磷酸緩沖液將頭孢類藥物-牛血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL， 用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)，包被量為1. 0μ g/cm2 ；用0. 01M、pH 7. 4PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200μ g/ml，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)，包被量為1. 0μ g/cm2。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥池，備用。
權(quán)利要求1.一種檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的試劑盒，其特征在于試劑盒包括試劑盒盒體、具有 12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜組成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)膜上具有包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“ I ”。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述檢測線和質(zhì)控線平行。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測線位于距離樣品吸收墊一側(cè)5-8mm，所述質(zhì)控線位于距離檢測線4_7mm。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試紙條兩端貼有保護(hù)膜，覆蓋在吸水端上的為手柄端，覆蓋在樣品吸收墊上的為檢測端，檢測端保護(hù)膜上有MAX標(biāo)記線。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料，樣品吸收墊可為吸濾紙或慮油紙，吸水墊為吸水紙，反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜， 保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
7.如權(quán)利要求書1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒盒體為硬紙盒，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具是硬質(zhì)支撐材料。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述微孔試劑條有8個反應(yīng)孔，反應(yīng)孔上具有微孔塞。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述微孔試劑中凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的試劑盒，試劑盒包括試劑盒盒體，具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣本吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜組成，頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中。在反應(yīng)膜具有包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體構(gòu)成質(zhì)控線。本實用新型試劑盒具有便攜性好，靈敏度高，檢測時間短等特點，可以在β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/558GK201935920SQ20102057902
公開日2011年8月17日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者萬宇平, 何麗霞, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 馮靜, 崔海峰, 李勇, 汪善良, 王建霞, 羅曉琴, 趙正苗 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司