專利名稱：一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
苯巴比妥(1-(4-carboxybutyle) _5_ethyl_5_phenylbarbituricacid, 1_ (4_ 幾丁基)-5_乙基-5-苯基-巴比妥酸)是臨床上常用的抗癲癇、抗驚厥、穩(wěn)定情緒類的藥物， 由于治療的有效血藥濃度范圍狹窄，藥物的藥動學(xué)個體間差異顯著，血藥濃度與治療效果密切相關(guān)，血藥濃度過高時可產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，可導(dǎo)致呼吸中樞衰竭，甚至危及生命， 血藥濃度過低則無治療效果，因此在治療期間對病人的血藥濃度進行監(jiān)測，對開展個性化治療具有重要的臨床指導(dǎo)意義。目前，國內(nèi)外測定苯巴比妥血藥濃度的方法主要是高效液相色譜(HPLC)、微粒酶免法、免疫比濁法、發(fā)光免疫、酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)等免疫法。采用HPLC法，需要樣本前處理，操作較復(fù)雜、周期較長、且成本昂貴；ELISA檢測法靈敏度高，但只能半定量; 發(fā)光免疫檢測法雖然具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點，但試劑成本昂貴，不適合常規(guī)治療藥物的檢測，不利于個性化治療的推廣。因此開發(fā)一種操作簡便、周期短、成本低、靈敏度高的檢測方法成為急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速、靈敏度高和全自動化的苯巴比妥藥物濃度檢測試劑盒和制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括以下幾種組分試劑Rl 苯巴比妥衍生物特異的多克隆抗體；試劑R2 葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物；試劑R3:定標(biāo)液；所述定標(biāo)液為苯巴比妥校準(zhǔn)品溶于空白血清中制得； 所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物為苯巴比妥衍生物與葡萄糖六磷酸脫氫酶偶聯(lián)產(chǎn)物，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物能與苯巴比妥衍生物特異抗體特異性結(jié)合；所述苯巴比妥衍生物特異的多克隆抗體是以苯巴比妥衍生物與牛血清白蛋白偶聯(lián)的產(chǎn)物為免疫抗原制得。優(yōu)選的，所述定標(biāo)液為6種不同苯巴比妥質(zhì)量濃度的溶液，所述定標(biāo)液苯巴比妥質(zhì)量濃度分別為 0 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL、40 μ g/mL、80 μ g/mL。優(yōu)選的，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物稀釋度為1 1000-1 3000，苯巴比妥衍生物特異的多克隆抗體稀釋度為1 500-1 4000。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的另一個技術(shù)方案是提供一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟苯巴比妥衍生物特異的單克隆或多克隆抗體的制備；葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的特異抗原的制備；定標(biāo)液的制備。優(yōu)選的，所述苯巴比妥衍生物特異的多克隆抗體的制備包括以下步驟步驟a:將牛血清白蛋白溶解于0. 2mol/L的pH8. 5的磷酸緩沖液中；苯巴比妥衍生物的活化將特異的苯巴比妥衍生物IOmg置于容器中，并依次加入 350 μ L 二甲基酰胺、350 μ L乙醇、700 μ L磷酸鉀緩沖液、40mgl-乙基-3- (-3- 二甲氨丙基) 碳二亞胺和5mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺；所述磷酸鉀緩沖液濃度為10mmol/L，pH值為5. 0 ；步驟b 苯巴比妥衍生物免疫抗原的偶聯(lián)和純化將步驟a活化的苯巴比妥衍生物滴加到步驟a所得的牛血清白蛋白溶液中，在2 8°C條件下攪拌12-16小時，將偶聯(lián)的抗原進行孔徑為8KD的透析袋透析純化；步驟c 采用步驟b得到的苯巴比妥衍免疫抗原制備苯巴比妥衍生物抗體。優(yōu)選的，所述步驟c為將步驟b合成的苯巴比妥免疫抗原用lOmmol/L，pH7. 4的磷酸緩沖液稀釋至 1.0mg/mL，然后用苯巴比妥免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對兔子進行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，從兔子進行初次注射開始，經(jīng)過4個月后獲得的抗體。優(yōu)選的，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物的制備包括以下步驟a、將15mg葡萄糖六磷酸脫氫酶溶解于12mLTris緩沖液中，然后依次加入225mg 還原型輔酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0. 75mL卡必醇和2. 25mL 二甲基亞砜；所述Tris緩沖液PH為9. 0，各組分濃度為0. 05mol/LTris、3. 3mmol/L氯化鎂，145. 4mmol/L氯化鈉；b、苯巴比妥衍生物的活化將IOmg苯巴比妥衍生物溶解于420 μ L 二甲基亞砜和 180 μ L 二甲基甲酰胺中，加入6 μ L三丁胺和350 μ L氯甲酸異丁酯在2 8°C條件下攪拌 30分鐘；C、將所述步驟a和b所得溶液混合，在2 8°C條件下攪拌12_16小時，并將偶聯(lián)的酶標(biāo)抗原進行G-25凝膠層析柱純化，得到葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物。本發(fā)明的有有益效果為本發(fā)明的苯巴比妥藥物濃度均相酶免疫檢測試劑盒準(zhǔn)確度和精確度非常高，檢測的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)小于1.7%，血清標(biāo)本的平均回收率(Recovery)大于95%，相關(guān)系數(shù)偏差(CV)小于2.5%。該試劑盒中提供的苯巴比妥抗體的特異性強，藥物交叉反應(yīng)試驗中，對測試的30種常見藥物和化合物幾乎無任何交叉反應(yīng)，適合臨床檢測苯巴比妥的血藥濃度。本試劑盒的藥物濃度的有效檢測范圍lOng-SOyg/mL，靈敏度達到 lOng/mL。本試劑盒簡便、快速、成本低、靈敏度高、可全自動化。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細(xì)的說明圖1是苯巴比妥免疫檢測試劑盒使用原理示意圖2是苯巴比妥均相酶免疫測定的定標(biāo)曲線。
具體實施例方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖詳予說明。本發(fā)明中的均相酶免疫測定是一種競爭性反應(yīng)，該檢測的基本原理是液體樣本中游離的苯巴比妥與偶聯(lián)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-PhosphateDehydrogena se, G6PDH)上的苯巴比妥衍生物對特異性抗體的位點進行競爭結(jié)合。葡萄糖_6_磷酸脫氫酶-苯巴比妥衍生物偶聯(lián)物是酶標(biāo)半抗原，具有抗原和酶的活性，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶_苯巴比妥衍生物偶聯(lián)物可以被抗體識別。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶既能夠轉(zhuǎn)化磷酸葡萄糖也能夠?qū)⒛峥缩０废汆堰识塑账嵫趸?-磷酸葡萄糖和還原型輔酶I (NADH)。這個過程導(dǎo)致吸光度的變化，可以在340nm波長光源下被檢測到。一旦抗體與酶-苯巴比妥結(jié)合物結(jié)合上，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性即被抑制，液體樣本中的苯巴比妥競爭性的取代與抗體結(jié)合的苯巴比妥酶偶聯(lián)物，并使其從抗體的結(jié)合位點上釋放出來，從而使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶恢復(fù)活性。因此，液體樣本中苯巴比妥的含量越多，游離的苯巴比妥衍生物_葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯(lián)物就越多，從而能得到更強的信號。請參閱圖1苯巴比妥免疫檢測試劑盒使用原理示意圖。實施例一a、牛血清白蛋白_苯巴比妥衍生物免疫抗原的合成1、BSA溶液的制備，稱取20mg牛血清白蛋白(BSA)并在室溫條件下溶解于 5mL0. 2mol/L, pH8. 5的磷酸緩沖液中；2、苯巴比妥衍生物的活化，稱取IOmg特異的苯巴比妥衍生物于小燒杯中，并依次加入350 μ L 二甲基酰胺(DMF)、350 μ L乙醇、700 μ L10mmol/L, ρΗ5· 0的磷酸鉀緩沖液、 40mgl-乙基-3-(-3- 二甲氨丙基)碳二亞胺和5mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，將這些化學(xué)品在室溫條件下攪拌溶解反應(yīng)30分鐘；3、抗原的偶聯(lián)和純化，將活化的苯巴比妥衍生物滴加到BSA溶液中，在2 8°C條件下攪拌過夜，得到抗原；并將偶聯(lián)的抗原進行透析純化。b、抗苯巴比妥衍生物抗體的制備，步驟如下用磷酸緩沖液將合成的苯巴比妥免疫抗原稀釋至1. Omg/mL，然后用1. OmL的抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對家兔進行注射。2 3周后，再用1. OmL相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次，之后每隔四周一次，共兩次，獲得的抗體效價約為1 30000。C、葡萄糖六磷酸脫氫酶-苯巴比妥衍生物酶標(biāo)抗原的制備稱取15mg葡萄糖六磷酸脫氫酶，溶解于12mL，0. 05mmol/LTris緩沖液中，然后依次加入100-250mgNADH、0. 5-1. OmL的卡必醇和1_3. OmL的二甲基亞砜混勻；將IOmg的苯巴比妥衍生物溶解于420 μ L 二甲基亞砜和180 μ LDMF中，加入6 μ L 三丁胺和3 μ L氯甲酸異丁酯，在2 8°C條件下攪拌30分鐘。將上述兩種溶液混合，在2 8°C條件下攪拌過夜，并將偶聯(lián)的酶標(biāo)抗原進行G-25 凝膠層析柱純化。
d、均相免疫試劑的制備Rl試劑的制備，將抗體制備中的抗體按1 1000到1 3000的比例添加到Rl Base(50mmol Tris, pH8. 0)中，其中含有 0.1% (w/v)的 BSA。R2試劑的制備，將制備的酶標(biāo)抗原按1 500-1 4000的比例稀釋到R2 Base(50mmol Tris, pH8. 0)中，其中含有 0.1% (w/v)的 BSA。通過調(diào)節(jié)抗體和酶標(biāo)抗原在緩沖液中的濃度，優(yōu)化測定工作曲線的范圍。實施例二苯巴比妥檢測試劑盒產(chǎn)品的檢測實驗1.定標(biāo)實驗請參閱圖2，苯巴比妥校準(zhǔn)品溶于空白血清中并配制成0、5、10、20、40、80μβ/ιΛ 共6種系列濃度的定標(biāo)液，定標(biāo)液的工作體積為10-35 μ L，然后加入100-200 μ L試劑Rl和 100-200 μ L試劑R2，采用兩點速率法，檢測主波長為340nm、副波長為405nm的吸光度變化率，建立并優(yōu)化苯巴比妥均相酶免疫定標(biāo)曲線(圖2)，定標(biāo)曲線的建立和優(yōu)化在日立7180 型全自動生化分析儀上完成。2.回收實驗利用建立的苯巴比妥定標(biāo)曲線，測定低(20 μ g/mL), ψ (‘Oyg/mL))、高(80 μ g/ mL)三種濃度的苯巴比妥血清標(biāo)本，每個標(biāo)本完成10個測試。表一苯巴比妥試劑盒的回收實驗
權(quán)利要求
1.一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分試劑Rl 苯巴比妥衍生物特異的多克隆抗體； 試劑R2 葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物； 試劑R3 定標(biāo)液；所述定標(biāo)液為苯巴比妥校準(zhǔn)品溶于空白血清中制得；所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物為苯巴比妥衍生物與葡萄糖六磷酸脫氫酶偶聯(lián)產(chǎn)物，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物能與苯巴比妥衍生物特異抗體特異性結(jié)合；所述苯巴比妥衍生物特異的多克隆抗體是以苯巴比妥衍生物與牛血清白蛋白偶聯(lián)的產(chǎn)物為免疫抗原制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述定標(biāo)液為6種不同苯巴比妥質(zhì)量濃度的溶液，所述定標(biāo)液苯巴比妥質(zhì)量濃度分別為0μ g/mL、 5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL>80 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物稀釋度為1 1000-1 3000，苯巴比妥衍生物特異的多克隆抗體稀釋度為1 500-1 4000。
4.一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟苯巴比妥衍生物特異的單克隆或多克隆抗體的制備；葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的特異苯巴比妥衍生物的制備；定標(biāo)液的制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述苯巴比妥衍生物特異多克隆抗體的制備包括以下步驟步驟a 將牛血清白蛋白溶解于0. 2mol/L的pH8. 5的磷酸緩沖液中；苯巴比妥衍生物的活化將特異的苯巴比妥衍生物IOmg置于容器中，并依次加入 350 μ L 二甲基酰胺、350 μ L乙醇、700 μ L磷酸鉀緩沖液、40mgl-乙基-3- (-3- 二甲氨丙基) 碳二亞胺和5mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺；所述磷酸鉀緩沖液濃度為10mmol/L，pH值為5. 0 ； 步驟b 苯巴比妥衍生物免疫抗原的偶聯(lián)和純化將步驟a活化的苯巴比妥衍生物滴加到步驟a所得的牛血清白蛋白溶液中，在2 8°C條件下攪拌12-16小時，將偶聯(lián)的抗原進行孔徑為8KD的透析袋透析純化；步驟c 采用步驟b得到的苯巴比妥衍免疫抗原制備苯巴比妥衍生物抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述步驟c為將步驟b合成的苯巴比妥免疫抗原用10mmol/L，pH7. 4的磷酸緩沖液稀釋至1. Omg/mL, 然后用苯巴比妥免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對兔子進行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，從兔子進行初次注射開始，經(jīng)過4個月后獲得的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物的制備包括以下步驟a、將15mg葡萄糖六磷酸脫氫酶溶解于12mLTris緩沖液中，然后依次加入225mg還原型輔酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0. 75mL卡必醇和2. 25mL 二甲基亞砜；所述Tris緩沖液 pH 為 9. 0，各組分濃度為0. 05mol/LTris、3. 3mmoL/L 氯化鎂，145. 4mmol/L 氯化鈉；b、苯巴比妥衍生物的活化將IOmg苯巴比妥衍生物溶解于420μ L 二甲基亞砜和 180 μ L 二甲基甲酰胺中，力Π入6 μ L三丁胺和350 μ L氯甲酸異丁酯在2 8°C條件下攪拌 30分鐘；c、將所述步驟a和b所得溶液混合，在2 8°C條件下攪拌12-16小時，并將偶聯(lián)的酶標(biāo)抗原進行G-25凝膠層析柱純化，得到葡萄糖六磷酸脫氫酶標(biāo)記的苯巴比妥衍生物。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速、靈敏度高和全自動化的苯巴比妥藥物濃度檢測設(shè)備及其制備方法，為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒及其制備方法，包括苯巴比妥免疫原的合成，抗苯巴比妥特異性抗體的制備，酶標(biāo)偶聯(lián)物的制備以及樣本的測定。本發(fā)明的苯巴比妥藥物濃度均相酶免疫檢測試劑盒準(zhǔn)確度和精確度高，血清標(biāo)本的平均回收率大于95％，相關(guān)系數(shù)偏差小于2.5％。該試劑盒中提供的苯巴比妥抗體的特異性強，藥物交叉反應(yīng)試驗中，對測試的30種常見藥物和化合物幾乎無任何交叉反應(yīng)，適合臨床檢測苯巴比妥的血藥濃度。本發(fā)明的試劑盒簡便、快速、成本低、靈敏度高、可全自動化。
文檔編號G01N33/577GK102323414SQ20111015094
公開日2012年1月18日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者李冬, 梁曉翠, 王金文, 胡朝暉, 虞留明 申請人:西安金域醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司