專利名稱：檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特別適于動物組織(肌肉、肝臟等)、熟食、水產(chǎn)、蜂王漿、尿液、飼料和牛奶等樣本中氯霉素殘留的檢測。
背景技術(shù)：
氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是20世紀中葉發(fā)現(xiàn)的一種廣譜抗生素,對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有很好的抑制作用，由于其優(yōu)良的抗菌性、穩(wěn)定的藥性和低廉的價格，曾在一段時期內(nèi)作為細菌性疾病的治療藥物應(yīng)用于人和動物臨床，并作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。然而，在使用中人們發(fā)現(xiàn)氯霉素具有毒性，在動物性食品中的殘留會通過肉、蛋、奶等動物性食品對人的健康產(chǎn)生毒害作用。因此，我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文件規(guī) 定，氯霉素及其鹽、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出。但由于氯霉素的抑菌效果好，價格低，仍有人將其用于家禽、畜類、水產(chǎn)品中。為了保障人民的身體健康以及擴大食品的貿(mào)易往來，建立靈敏度高、特異性強、快速、經(jīng)濟的氯霉素殘留檢測方法是很有必要的。目前，用來檢測氯霉素的最常用方法主要是氣相色譜、液相色譜及色譜-質(zhì)譜法，這些方法雖然具有靈敏度高、結(jié)果準確、重復(fù)性好、假陽性少等優(yōu)點，但仍存在一定缺點，如樣品前處理過程復(fù)雜，儀器化程度高且價格昂貴，分析速度慢，已逐漸不能滿足發(fā)達國家及食品加工企業(yè)對檢測方法檢測限的要求。與之相比，免疫學測定方法靈敏度較高、特異性強、試樣預(yù)處理簡單、分析時間短，適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種用于氯霉素檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡單，適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。本發(fā)明試劑盒，它含有(I)包被有包被原的酶標板；(2)酶標記物；(3)氯霉素標準品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明所提供的檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括預(yù)包被包被原的酶標板和酶標記物工作液；所述包被原為氯霉素抗原、抗體或抗抗體，所述酶標記物為酶標記氯霉素半抗原、酶標記氯霉素抗體或酶標記抗抗體，當酶標板上包被抗原且酶標記物為酶標記抗抗體或酶標板上包被抗抗體且酶標記物為酶標記抗原時還含有氯霉素特異性抗體工作液。
所述氯霉素半抗原是將氯霉素分子結(jié)構(gòu)中的硝基通過催化加氫反應(yīng)得到的。所述氯霉素特異性抗體為氯霉素單克隆抗體；所述氯霉素單克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優(yōu)選為氯霉素鼠單克隆抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體。以上抗體均可以用氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白和纖維蛋白原等常用載體蛋白；所述氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將氯霉素半抗原和載體蛋白用戊二醛法進行偶聯(lián)得到。所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標記的羊抗鼠抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯(lián)得到的；酶標記氯霉素半抗原是采用重氮化法或戊二醛法將標記酶與氯霉素半抗原偶聯(lián)得到的；酶標記特異性抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與特異性抗體偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進行偶聯(lián)，如戊二醛法、過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長期的勞動創(chuàng)造將過碘酸鈉法進行了改良，使其省時、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括氯霉素標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。所述氯霉素標準品溶液6瓶，濃度分別為O μ g/L、0. 025 μ g/L、0. 075 μ g/L、0. 3 μ g/L、1. 2 μ g/L、4. 8 μ g/L。當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為I 2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為I 2mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮洗滌液優(yōu)選為pH值為7.1 7. 5，含有O. 8% 1. 2%吐溫-20、O. OI %。 O. 03%。硫柳汞防腐劑、O. 01 O. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。所述濃縮復(fù)溶液優(yōu)選為pH值為7. 2 7. 7，含有8% 12%卵清蛋白、O.1 O. 4mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。其中在酶標板制備過程中所用的包被緩沖液為pH值為9. 6，O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為PH值為9.1 9. 5，含有3% 10%小牛血清、O. 2%吐溫_20、0.1 O. 3mol/L的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。本發(fā)明中酶標板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成O.1 O. 2 μ g/ml,每孔加入100 μ 1，37°C溫育2h或4°C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150 200 μ I封閉液，37°C溫育I 2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁
膜真空密封保存。本發(fā)明中免疫原的合成過程為1.氯霉素半抗原合成(合成路線如圖2)氯霉素半抗原是將氯霉素(結(jié)構(gòu)式如圖1)分子結(jié)構(gòu)中的硝基通過催化加氫反應(yīng)得到的，具體反應(yīng)步驟如下將氯霉素溶于甲醇中，加入5 %的鈀炭催化劑(Pd/C)，通入氫氣，保持一定壓力，室溫反應(yīng)2h，過濾除去Pd/C，蒸干溶劑得到淡黃色黏稠液體，即為氯霉素半抗原；其中所述Pd/C與氯霉素的摩爾比為1: 10。2.免疫原的合成將氯霉素半抗原與載體蛋白采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到免疫原，具體制備方法如下取氯霉素半抗原30mg，用1. 5ml水溶解，得到(I)液；取50%的戊二醛(GA) 10 μ I加入⑴中，室溫下攪拌反應(yīng)18h，得到(II)液；取牛血清白蛋白(BSA) IOOmg用1. 5ml水稀釋后加入(II)液中，反應(yīng)過夜后加入24mg NaBH4反應(yīng)3h ;用三蒸水透析48h即得免疫原。本發(fā)明中氯霉素單克隆抗體的制備過程為(I)動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以氯霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多抗血清后，取出脾臟進行細胞融合。 (2)細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,篩選細胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發(fā)明中羊抗鼠抗抗體的制備過程為以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。本發(fā)明的檢測原理為當在微孔條上預(yù)包被氯霉素偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入酶標記氯霉素特異性抗體溶液，樣本中的氯霉素與酶標板上包被的氯霉素偶聯(lián)抗原競爭氯霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光度值與氯霉素的含量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中氯霉素的殘留量；同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的氯霉素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中氯霉素殘留量的濃度范圍。當在微孔條上預(yù)包被氯霉素偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入氯霉素特異性抗體溶液，樣本中的氯霉素與酶標板上包被的氯霉素偶聯(lián)抗原競爭氯霉素特異性抗體，加入酶標記抗抗體進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光度值與氯霉素的含量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得到樣本中氯霉素的殘留量；同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的氯霉素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中氯霉素殘留量的濃度范圍。當在微孔條上預(yù)包被氯霉素特異性抗體時，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入酶標記氯霉素半抗原溶液，樣本中的氯霉素與酶標記半抗原競爭包被在酶標板上的氯霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光度值與氯霉素的含量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中氯霉素的殘留量；同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的氯霉素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中氯霉素殘留量的濃度范圍。當在微孔條上預(yù)包被抗抗體時，加入氯霉素抗體孵育后，加入樣本溶液或標準品溶液，再加入酶標記氯霉素半抗原溶液，樣本中的氯霉素與酶標記氯霉素半抗原競爭抗氯霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光度值與氯霉素的含量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中氯霉素的殘留量；同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的氯霉素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中氯霉素殘留量的濃度范圍。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測氯霉素的方法，它包括步驟(I)樣品前處理；(2)用試劑盒進行檢測；
(3)分析檢測結(jié)果。樣品的前處理主要是為了從樣品中獲得氯霉素溶液，從而用于后續(xù)的檢測。下面是常見的幾種樣品的前處理方法1.組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本后，稱取3. 0±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，力口入6ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩5min，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取4ml上層有機相(約相當于2g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己燒,用渦旋儀渦動Imin,再加Iml復(fù)溶工作液,用渦旋儀渦動15s,4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取下層50 μ I用于分析。
2.熟食前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本后，稱取3. O ± O. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入3ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩IOmin, 4000rpm,室溫(20-250C /68-77° F)離心IOmin ;移取4ml上層有機相(約相當于2g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動15s，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取下層50 μ I用于分析。3.尿液前處理方法取100 μ I清亮尿液樣本，加入900 μ I洗滌工作液，混勻，取50 μ I用于分析(若尿液樣本不清亮，需將尿液4000rpm，室溫離心5min)。4.蜂王漿前處理方法稱取1. 0±0. 05g樣品至50ml聚苯乙烯離心管中，加入Iml O. lmol/L CB(稱取4. 66g無水碳酸鈉、O. 5g碳酸氫鈉加入500ml去離子水溶解混勻)，8ml乙酸乙酯,再加入2g無水碳酸鈉，用振蕩器振蕩5min，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取2ml上層有機相(約相當于O. 25g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己燒,潤動lmin,再加入Iml復(fù)溶工作液,用潤旋儀潤動15s,4000rpm,室溫(20-25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取50 μ I液體用于分析。5.牛奶前處理方法移取500 μ I牛奶，加入500 μ I洗滌工作液，充分震蕩混勻，取50 μ I用于分析。6.飼料前處理方法稱取1. 0±0. 05g飼料至50ml聚苯乙烯離心管中，加入IOml乙酸乙酯振蕩5min,4000rpm,室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取2ml上層有機相至IOml干凈玻璃管中，于50 60°C氮氣流下吹干；加入Iml正己燒,用渦旋儀渦動lmin,再加Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動15s，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取50 μ I用于分析。7.雞蛋前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本后,稱取I ±0. 05g雞蛋至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙酸乙酯，Iml O. lmol/L CB (稱取4. 66g無水碳酸鈉、O. 5g碳酸氫鈉加入500ml去離子水溶解混勻)，用振蕩器振蕩5min，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取4ml上層有機相(約相當于O. 5g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動15s，4000rpm，室溫(20-25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取下層50 μ I用于分析。本發(fā)明中用試劑盒檢測時當包被原為氯霉素偶聯(lián)抗原時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再加入酶標記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；當包被原為氯霉素偶聯(lián)抗原時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用 酶標儀測定吸光度值；當包被原為氯霉素特異性抗體時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再加入酶標記氯霉素半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；當包被原為抗抗體時，向酶標板微孔中加入氯霉素抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標準品溶液或樣本溶液后加入酶標氯霉素半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為用所獲得的每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(O標準)的吸光度值(Btl)再乘以100%，即百分吸光度值。計算公式為百分吸光度值(％) = (Β/Β0) Χ100%以氯霉素標準品溶液的濃度(μ g/L)的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的氯霉素含量則可從標準曲線上讀出。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程最多只需75分鐘即可完成。本發(fā)明檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中氯霉素的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣品；采用高特異性的氯霉素單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明的試劑盒將在氯霉素的檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1 :氯霉素結(jié)構(gòu)2 :氯霉素半抗原合成路線3 :以氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原、酶標記抗體為酶標記物的試劑盒的標準曲線圖
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.氯霉素半抗原合成
將氯霉素溶于甲醇中，加入5 %的鈀炭催化劑(Pd/C)，通入氫氣，保持一定壓力，室溫反應(yīng)2h，過濾除去Pd/C，蒸干溶劑得到淡黃色黏稠液體，即為氯霉素半抗原；其中所述Pd/C與氯霉素的摩爾比為1: 10。b.免疫原合成將氯霉素半抗原與牛血清白蛋白采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到免疫原。免疫原的制備過程取氯霉素半抗原30mg，用1. 5ml水溶解，得到⑴液；取50%的戊二醛(GA) 10 μ I加入⑴中，室溫下攪拌反應(yīng)18h，得到(II)液；取牛血清白蛋白(BSA) IOOmg用1. 5ml水稀釋后加入(II)液中，反應(yīng)過夜后加入24mg NaBH4反應(yīng)3h ;用三蒸水透析48h即得免疫原。
c.包被原合成將氯霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原。包被原的制備過程取氯霉素半抗原30mg，用1. 5ml水溶解，得到⑴液；取50%的戊二醛(GA) 10 μ I加入(I)中，室溫下攪拌反應(yīng)18h，得到(II)液；取卵清蛋白(OVA) 30mg用1. 5ml水稀釋后加入(II)液中，反應(yīng)過夜后加入24mg NaBH4反應(yīng)3h ;用三蒸水透析48h即得包被原。2.單克隆抗體的合成動物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。細胞融合和克隆化小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細胞，按8 I比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經(jīng)篩選得到氯霉素的單克隆雜交瘤細胞株，可以無限量的產(chǎn)生氯霉素特異性抗體，且該抗體特異性是針對氯霉素的，靈敏度能達到O. 025 μ g/L。細胞凍存和復(fù)蘇將氯霉素的單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成I X IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射穩(wěn)定的氯霉素單克隆雜交瘤細胞株I X IO6個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20°C保存。3.酶標記氯霉素單克隆抗體的制備將氯霉素單克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反應(yīng)體系中酶與抗體的摩爾濃度比為4 1，由于辣根過氧化物酶在強氧化作用下產(chǎn)生許多與抗體結(jié)合的位點，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當了連接各分子的橋梁，降低了酶標記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。為了解決這個問題，我們將傳統(tǒng)的方法進行了改良，即(I)省去了氨基的封閉過程，因為能產(chǎn)生自身氨基連接的氨基實際很少；(2)降低了辣根過氧化物酶抗體的摩爾濃度比率至2 1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶活性的損失減少。4.酶標板的制備
用包被緩沖液將氯霉素偶聯(lián)抗原稀釋成O. 2μ g/ml，每孔加入100μ 1，37°C溫育2h,傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后再每孔中加入200 μ I封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存，實施例2檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(I)包被氯霉素偶聯(lián)抗原的酶標板；(2)氯霉素標準品溶液6瓶，濃度分別為O μ g/L、0. 025 μ g/L、0. 075 μ g/L、0. 3 μ g/L、1. 2 μ g/L、4. 8 μ g/L ；(3)氯霉素高濃度標準品溶液I瓶，濃度為100 μ g/L ；(4)用辣根過氧化物酶標記的氯霉素單克隆抗體工作液；(5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L硫酸；(7)濃縮洗滌液為pH值為7.1 7. 5，含有O. 8 % 1. 2 %吐溫_20、0· 01 %。 O. 03%。硫柳汞防腐劑、O. 01 O. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；(8)濃縮復(fù)溶液為pH值為7. 2 7. 7，含有8% 12%卵清蛋白、O.1 O. 4mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。實施例3樣品中氯霉素的檢測1.樣品前處理(I)組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本后，稱取3. 0±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，力口入6ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩5min，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取4ml上層有機相(約相當于2g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己燒,用渦旋儀渦動lmin,再加Iml復(fù)溶工作液,用渦旋儀渦動15s,4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取下層50 μ I用于分析。(2)熟食前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本后，稱取3. O ± O. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入3ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩IOmin, 4000rpm,室溫(20-250C /68-77° F)離心IOmin ;移取4ml上層有機相(約相當于2g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動15s，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取下層50 μ I用于分析。(3)尿液前處理方法取100 μ I清亮尿液樣本，加入900 μ I洗滌工作液，混勻，取50 μ I用于分析(若尿液樣本不清亮，需將尿液4000rpm，室溫離心5min)。(4)蜂王漿前處理方法稱取1. 0±0. 05g樣品至50ml聚苯乙烯離心管中，加入Iml O. lmol/L CB(稱取 4. 66g無水碳酸鈉、O. 5g碳酸氫鈉加入500ml去離子水溶解混勻)，8ml乙酸乙酯,再加入2g無水碳酸鈉，用振蕩器振蕩5min，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取2ml上層有機相(約相當于O. 25g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己燒,潤動lmin,再加入Iml復(fù)溶工作液,用潤旋儀潤動15s,4000rpm,室溫(20-25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取50 μ I液體用于分析。(5)牛奶前處理方法移取500 μ I牛奶，加入500 μ I洗滌工作液，充分震蕩混勻，取50 μ I用于分析。(6)飼料前處理方法稱取1. 0±0. 05g飼料至50ml聚苯乙烯離心管中，加入IOml乙酸乙酯振蕩5min,4000rpm,室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取2ml上層有機相至IOml干凈玻璃管中，于50 60°C氮氣流下吹干；加入Iml正己燒,用渦旋儀渦動lmin,再加Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動15s，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取50 μ I用于分析。 (7)雞蛋前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本后,稱取I ±0. 05g雞蛋至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙酸乙酯，Iml O. lmol/L CB (稱取4. 66g無水碳酸鈉、O. 5g碳酸氫鈉加入500ml去離子水溶解混勻)，用振蕩器振蕩5min，4000rpm，室溫(20_25°C /68-77° F)離心5min ;移取4ml上層有機相(約相當于O. 5g的樣本)至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動15s，4000rpm，室溫(20-25°C /68-77° F)離心5min ;除去上層有機相，取下層50 μ I用于分析。2.用試劑盒檢測向包被有氯霉素偶聯(lián)抗原的酶標板微孔中加入氯霉素標準品溶液或樣品溶液50 μ 1，再加入辣根過氧化物酶標記的氯霉素單克隆抗體工作液50 μ I/孔，用蓋板膜蓋板后，置25°C恒溫箱中避光反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250 μ I洗滌液，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作洗板5次，用吸水紙拍干；每孔加入底物顯色液A液過氧化脲50μ 1，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C恒溫箱中避光顯色20min，每孔加入終止液2mol/L硫酸50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用酶標儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(0D值)。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(O標準)的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以氯霉素標準品濃度(yg/L)的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖，如圖3所示。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的氯霉素含量則可從標準曲線上讀出。實施例4試劑盒技術(shù)參數(shù)的確定試驗1.標準品精密度試驗分別從三個不同的時間段制備的酶標板中各抽出一批酶標板，每批各抽取10個試劑盒，每板各抽出20個微孔，測定O. 3 μ g/L標準溶液的吸光度值，計算變異系數(shù)。表I標準可重復(fù)性試驗(CV% )
權(quán)利要求
1.一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被有包被原的酶標板；(2)酶標記物；(3)氣霉素標準品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復(fù)溶液，所述包被原為氯霉素抗原、抗體或抗抗體，所述酶標記物為酶標記氯霉素抗原、酶標記氯霉素抗體或酶標記抗抗體，當酶標板上包被抗原且酶標記物為酶標記抗抗體或酶標板上包被抗抗體且酶標記物為酶標記抗原時還含有氯霉素特異性抗體工作液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述氯霉素抗原是由氯霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述氯霉素抗體是由所述偶聯(lián)抗原制備獲得，其中所述氯霉素半抗原是將氯霉素分子結(jié)構(gòu)中的硝基通過催化加氫反應(yīng)得到的。
3 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。
4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述氯霉素抗體為單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所用包被緩沖液為pH值為9.6，O.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所用封閉液為pH值為9.1 9. 5，含有3% 10%小牛血清、O.2%吐溫-20、0.1 O. 3mol/L的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
6.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為I 2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，終止液為I 2mol/L氫氧化鈉。
7.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所用濃縮洗滌液為pH值為7.1 7. 5，含有O. 8% 1. 2%吐溫-20,0. 01%。 O. 03%。硫柳汞防腐劑、O. 01 O. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液；所用濃縮復(fù)溶液為PH值為7. 2 7. 7，含有8% 12%卵清蛋白、O.1 O. 4mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
8.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于氯霉素標準品溶液的濃度分別為Oμ g/L、0. 025 μ g/L、0. 075 μ g/L、0. 3 μ g/L、1. 2 μ g/L、4. 8 μ g/L。
9.一種檢測樣品中氯霉素殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1 8任一項所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標板，酶標記物，氯霉素特異性抗體工作液(當酶標板上包被抗原且酶標記物為酶標記抗抗體或酶標板上包被抗抗體且酶標記物為酶標記抗原時含有)，氯霉素標準品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測氯霉素的方法，它包括首先進行樣品前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測動物組織(肌肉、肝臟等)、熟食、水產(chǎn)、蜂王漿、尿液、飼料和牛奶等樣品中氯霉素的殘留量，其操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號G01N1/28GK103018451SQ201110279098
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者何方洋, 吳鵬, 段盈盈, 浦小容, 李勇, 崔廷婷, 陳煒玲, 齊向武 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司